專利名稱：海馬齒及其提取物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海馬齒及其提取物的新用途。
背景技術(shù)：
隨著全球人口的迅速增長，城市化步伐的不斷加快以及農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)廢水的排入， 造成近海海水嚴(yán)重富營養(yǎng)化，生態(tài)系統(tǒng)破壞，大面積的赤潮頻繁發(fā)生，海洋污染日益 成為世界各國迫切關(guān)切的問題。近年來，各國科學(xué)家已經(jīng)開展了各種富營養(yǎng)化治理的
相關(guān)研究，其中植物修復(fù)技術(shù)(Phytoremediation)作為一項新興的技術(shù)，逐漸成為研 究的熱點(Agency, U. (2000). Introduction to Phytoremediation， US Environmental Protection Agency)。目前植物修復(fù)技術(shù)在淡水系統(tǒng)中已經(jīng)得到很好 的應(yīng)用，人們利用大型水生植物治理富營養(yǎng)化水體，主要基于以下機制吸收大量營
養(yǎng)降低水體營養(yǎng)鹽水平；遮蔭和創(chuàng)造缺氧環(huán)境； 一些水生植物還能對藻類起克生作用，
抑制浮游藻類的生長和促進水中其它水生生物的代謝(Gross 2003， Allel叩athy of Aquatic Autotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences 22(3): 313-339; 方 云英2006，不同水生植物吸收去除水體氮效果及機理研究；Benson, 0'Neil et al. 2008， Using the aquatic macrophyte Vallisneria americana (wild celery) as a nutrient bioindicator. Hydrobiologia 596: 187-196; Hu， Ao et al. 2008， Treating eutrophic water for nutrient reduction using an aquatic macrophyte (Ipomoea aquatica Forsskal) in a deep flow technique system. Agricultural Water Management 95(5): 607-615; Penning, Dudley et al. 2008， Using aquatic macrophyte community indices to define the ecological status of European lakes. Aquatic Ecology 42(2): 253-264)。在海洋領(lǐng)域，植物修復(fù)技術(shù)的研究仍處于探索 階段。近年來，國內(nèi)外著重利用大型海藻治理海水富營養(yǎng)化和赤潮問題(Gross， Erhard et al. 2003， Allelopathic activity of C&rato/ 力jiJ咖flfe77ers〃/ff L and A^/as ssp. intermedia (Wolfgang) Casper. Hydrobiologia 506-509 (1) : 583-589; Nielsen 2003， Nutrient loading and consumers: agents of change in open-coast macrophyte assemblages. Proc Natl Acad Sci USA 100(13) : 7660-5; Erhard and Gross 2006， Allelopathic activity of ^/oofes c朋sc/e/ 57'51 and ^7oflfes y 〃"a77h' against epiphytes and phytoplankton. Aquatic Botany 85(3): 203-211; Hilt, Ghobrial et al. 2006， 57." allelopathic potential of妙/^'o/ 力j^mz yerficj'77(3t鵬(Haloragaceae) against selected phytoplankton species. Journal of Phycology 42(6): 1189-1198; 0rhan， Se匿et al. 2006， Turkish freshwater and marine macrophyte extracts show in vitro antiprotozoal activity and inhibit Fabl， a key enzyme of Plasmodium falciparum fatty acid biosynthesis. Phytomedicine 13(6): 388-93; Mulderij， Mau et al. 2007, Allelopathic activity of 5"tra"ote51 s7oi(/e51 on phytoplankton-towards identification of allelopathic-substances. Hydrobiologia 584(1): 89-100; Nagai， Imai et al. 2007， Dissolved iron and its speciation in a shallow eutrophic lake and its inflowing rivers." Water Res 41(4): 775-84)。但是現(xiàn)有研究表明，大型海藻存在著生長季節(jié)性和污損 生物附著等問題，嚴(yán)重制約了修復(fù)作用的進行(Blindow， Hargeby et al. 2002， Seasonal changes of mechanisms maintaining clear water in a shallow lake with abundant CAara vegetation. Aquatic Botany 72(3-4): 315-334; Gross, Hilt et al. 2007， Searching for allelopathic effects of submerged macrophytes on phytoplankton-state of the art and open questions. Hydrobiologia 584(1) : 77-88; Zhu, Mayer et al. 2007， Can Dreissenid Attachment and Biod印osition Affect Submerged Macrophyte Growth Journal of Aquatic Plant Management 45: 71-76)。 因此，找到既適合在海水環(huán)境中生長，又具有較高修復(fù)價值和經(jīng)濟價值的植物迫在眉 睫。
海水蔬菜長在海邊鹽堿灘涂上，用海水澆灌，除了含有普通蔬菜所含的各類營養(yǎng) 成分外，粗蛋白、維生素B2、維生素C以及胡蘿卜素含量要比同類普通蔬菜高，其中 胡蘿卜素含量高出近40倍，鋅、硒等微量元素高出2-6倍，有突出的減肥、保健作 用(張華2006，海水蔬菜有前景.中國農(nóng)業(yè)信息(2): 34.)。海馬齒((&s"w'咖 party7acastr"http:// (Linn.) Linn.)為番杏科(Aizonaceae)海馬齒屬多年生肉質(zhì)草本 植物，生長于海邊沙地或鹽堿地，具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力和藥用價值，同時海馬齒 是一種經(jīng)濟價值很高的海水蔬菜(Lonard and Judd 1997， The biological flora of coastal dunes and wetlands 5"e5wi咖portt/Zacsstra/zKL.) L. Journal of Coastal Research 13(1): 96-104)。 Magwa等(Magwa， Gundidza et al. 2006， Chemical composition and biological activities of essential oil from the leaves of Sesuvium portulacastrum. Journal of Ethnopharmacology 103(1): 85-89)的石開究 發(fā)現(xiàn)海馬齒葉中具有揮發(fā)性油類物質(zhì)，富含萜、烯，臨床證明對發(fā)燒、壞血病等病癥 具有很好的療效。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種海馬齒及其提取物的新用途。 本發(fā)明提供了海馬齒及其提取物在修復(fù)富營養(yǎng)化水體中的應(yīng)用。
所述富營養(yǎng)化水體可為海水也可為淡水。所述海馬齒可為海馬齒植株，所述海馬 齒提取物可為海馬齒各個器官的提取物，如根、莖、葉的提取物。 本發(fā)明還提供了海馬齒及其提取物在抑制赤潮中的應(yīng)用。 所述赤潮具體可為由中肋骨條藻引起的赤潮。
所述海馬齒可為海馬齒植株，所述海馬齒提取物可為海馬齒各個器官的提取物， 如根、莖、葉的提取物。
本發(fā)明還提供了海馬齒及其提取物在抑制中肋骨條藻生長中的應(yīng)用。
所述海馬齒可為海馬齒植株，所述海馬齒提取物可為海馬齒各個器官的提取物， 如根、莖、葉的提取物。
所述應(yīng)用中，海馬齒植株的用量可為至少1株海馬齒/106個中肋骨條藻細(xì)胞。
所述提取物具體可為海馬齒干粉的水提物。
所述海馬齒干粉具體可為海馬齒葉干粉、海馬齒莖干粉和海馬齒根干粉中的至少 一種，優(yōu)選海馬齒葉千粉。
以抑制率50%為有效抑制中肋骨條藻生長的標(biāo)準(zhǔn)，貝lj:以海馬齒葉干粉計，所述 應(yīng)用中，海馬齒提取物的用量至少可為0.075g海馬齒葉干粉/l()6個中肋骨條藻細(xì)胞； 以海馬齒莖干粉計，所述應(yīng)用中，海馬齒提取物的用量至少可為0.61g海馬齒莖干粉 /106個中肋骨條藻細(xì)胞；以海馬齒根干粉計，所述應(yīng)用中，海馬齒提取物的用量至少 可為6g海馬齒根干粉/l(f個中肋骨條藻細(xì)胞。
海馬齒抑制赤潮暴發(fā)的最重要的作用機理是克生作用。在海馬齒不同組織部位， 其克生作用的強弱差別明顯(葉>莖>根)，這與不同組織器官中克生物質(zhì)的含量和 組成密切相關(guān)。克生物質(zhì)很可能最初是在葉中生成，通過莖向下輸送到根部，克生物 質(zhì)具有親水性，比較容易由根系直接分泌到生長環(huán)境中。隨著海馬齒種植密度的升高，
克生物質(zhì)的分泌量增多，海馬齒對中肋骨條藻的克生作用增強；在低種植密度(lg FW/L)時，海馬齒延遲骨條藻進入指數(shù)生長期，中等種植密度(2-3g FW/L)時，降 低藻細(xì)胞生長率和最大種群密度，高種植密度(4-5g FW/L)下，直接殺死藻細(xì)胞， 從而使藻細(xì)胞無法進入指數(shù)生長期。
利用海馬齒修復(fù)富營養(yǎng)化水體，抑制赤潮，不僅基于其克生作用，海馬齒還可以 吸收大量的營養(yǎng)鹽，從而降低富營養(yǎng)化程度，降低赤潮發(fā)生的可能性和頻率。雖然野 外栽培實驗中發(fā)現(xiàn)海馬齒自身對氮磷營養(yǎng)鹽無富集作用，但在富營養(yǎng)化條件下海馬齒 生長迅速，可以通過生物量的增加而去除水中氮磷營養(yǎng)鹽。室內(nèi)實驗也顯示，利用海馬齒修復(fù)富營養(yǎng)化水體，平均每天單株海馬齒鮮重能增加0. 039g，體內(nèi)N和P的吸收 量分別為0. 858mg和0. 147mg。
低種植密度下，海馬齒延遲中肋骨條藻進入指數(shù)生長期；中等種植密度下，海馬 齒可降低中肋骨條藻細(xì)胞生長率和最大種群密度；高種植密度下，海馬齒直接殺死中 肋骨條藻細(xì)胞，從而使中肋骨條藻細(xì)胞無法進入指數(shù)生長期。海馬齒根、莖、葉干粉 的水提取物均能抑制中肋骨條藻的生長，既可降低中肋骨條藻的生長速率，又可減小 中肋骨條藻種群的最大密度；隨著各種組織提取物濃度升高，對中肋骨條藻生長的抑 制作用增強，抑制作用最強的是葉，其次為莖，最后為根。海馬齒可在體內(nèi)吸收并通 過植株生長過程中生物量的增加來積累大量的氮磷營養(yǎng)鹽，從而降低水體中富營養(yǎng)化 程度，降低赤潮發(fā)生的可能性和頻率。海馬齒同時是一種經(jīng)濟價值很高的海水蔬菜， 可廣泛應(yīng)用于近海海域富營養(yǎng)化污染以及赤潮的治理，具有很高的經(jīng)濟價值和社會意 義。
以下的實施例子便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為在海馬齒培養(yǎng)11天過程中水體內(nèi)葉綠素a(Chl a)濃度(n g/L)的變化。圖 中數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(『3)。
圖2為在海馬齒培養(yǎng)11天過程中水體內(nèi)中肋骨條藻密度(X106細(xì)胞/L)的變化。 圖中數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(『6)。
圖3為海馬齒對水體內(nèi)葉綠素a(Chl 3)濃度和中肋骨條藻密度的抑制率(％)， 其中，中肋骨條藻密度是在移植培養(yǎng)海馬齒第6天測定的結(jié)果，水中葉綠素a(Chla) 濃度是在移植培養(yǎng)海馬齒第8天測定的結(jié)果。
圖4為在海區(qū)自然生長一個月的海馬齒體內(nèi)氮(N)和磷(P)的平均百分含量(％ )。
圖5為抑制赤潮過程中平均每天單株海馬齒增加的鮮重(g)和氮磷含量(mg)。
圖6為不同種植密度的海馬齒培養(yǎng)9天過程中水體內(nèi)葉綠素a(Chl a)濃度(y g/L) 的變化。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(11=3)。
圖7為不同種植密度的海馬齒培養(yǎng)9天過程中水體內(nèi)中肋骨條藻密度(X106細(xì)胞 /U的變化。圖中數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(『6)。
圖8為不同種植密度的海馬齒對水體內(nèi)葉綠素a(Chl s)濃度和中肋骨條藻密度的 抑制率(％)，其中，中肋骨條藻密度是在移植培養(yǎng)海馬齒第6天測定的結(jié)果，水中 葉綠素a (Chl 3)濃度是在移植培養(yǎng)海馬齒第8天測定的結(jié)果。
圖9為在不同提取物處理8天過程中水體內(nèi)中肋骨條藻密度的變化(X106細(xì)胞 /L)。圖中數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(『6)。圖10為不同提取物處理8天后水體內(nèi)中肋骨條藻細(xì)胞的長度和寬度的變化(U m)。圖中數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(『30)，經(jīng)LSD多重比較(P<0.05)，相同字 母表示處理組間差異不顯著，不同字母表示處理組間差異顯著。
圖11為不同提取物處理8天后水體內(nèi)中肋骨條藻細(xì)胞體積(u m3)的變化，圖中數(shù) 據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(n二30)，經(jīng)LSD多重比較(P<0.05)，相同字母表示處理組 間差異不顯著，不同字母表示處理組間差異顯著。
圖12為在不同濃度的海馬齒葉提取物處理11天過程中水體內(nèi)中肋骨條藻密度的 變化(X 106細(xì)胞/L)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(11=6)。
圖13為在不同濃度的海馬齒莖提取物處理8天過程中水體內(nèi)中肋骨條藻密度的 變化(X H)6細(xì)胞/L)。圖中數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(『6)。
圖14為在不同濃度的海馬齒根提取物處理8天過程中水體內(nèi)中肋骨條藻密度的 變化(X106細(xì)胞/L)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(11=6)。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
廈門賞篤湖位于廈門島西部，原為一個天然漁港，面積達10km2。 20世紀(jì)70年代初 經(jīng)圍墾后，成為一個基本封閉的半咸水湖。20世紀(jì)80年代初隨著廈門經(jīng)濟特區(qū)城市的 建設(shè)和工業(yè)的發(fā)展，大量的污水未經(jīng)處理就直接排入湖內(nèi)，使原本清澈的湖水迅速惡 化，水生生物幾乎滅絕(阮金山2006 ，廈門賞等湖水產(chǎn)生物體內(nèi)重金屬含量及評價. 海洋通報25(005): 84-89.)，氮磷等營養(yǎng)鹽長期超出四類海水標(biāo)準(zhǔn)，屬于嚴(yán)重的富營養(yǎng) 化水體，夏秋季節(jié)湖區(qū)藻類異常增殖，特別是硅藻門中的中肋骨條藻 (5!W"朋柳a cost"咖)為主要的優(yōu)勢種，導(dǎo)致赤潮頻繁發(fā)生，嚴(yán)重破壞水體功能 和水生生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，并影響城市景觀以及居民生活，因此，對湖區(qū)的生態(tài)治理刻不 容緩。以下實施例以賞笛湖的水進行試驗。
以下實施例中所用的試驗材料如下
① 中肋骨條藻
美國CCMP (美國國家海洋藻種中心)，編號為2092。
藻禾中無菌培養(yǎng)于f/2培養(yǎng)液(Guillard and Ryther 1962， Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyc_Zote77a "朋a Hustedt， and "e加i/7a co/ /"e/racea (cleve) Gran. Can J Microbiol 8: 229-39.)中，培養(yǎng)溫度為15。C，光強為60 umolm2s—\光周期為12h。培養(yǎng)液的pH和鹽度分別調(diào)至8. 0±0. 02和30。每天定 時晃動培養(yǎng)瓶2次，以防止藻附壁生長。
② 海馬齒海馬齒種苗由江蘇晶隆海洋產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司提供。
利用扦插枝條進行無性繁殖，水培培養(yǎng)于經(jīng)醋酸纖維濾膜(0.45ym)過濾后的 廈門西海域天然清潔海水(鹽度28-33)中。
③透明玻璃水缸長度X寬度X高度-30cmX20cmX 30cm。
海馬齒的預(yù)培養(yǎng)剪取在海馬齒扦插枝條，平均含有3個節(jié)、2片對生葉、株高 10-15cm，平均鮮重(FW)為5g，在經(jīng)0. 45 u m醋酸纖維濾膜過濾后的廈門西海域天然 清潔海水中培養(yǎng)1個月。取新的0. 45 n m醋酸纖維濾膜過濾后的賞笞湖海水中添加 線、(NH4)孤和K2HP04 (腦3的終濃度為0. 5mg/L、(肌)2S04的終濃度為3. 5mg/L、 &朋04的終濃度為0. 05mg/L)，調(diào)鹽度至30， pH至8. 0，將上述培養(yǎng)1個月后的海馬 齒枝條置于透明玻璃水缸中再培養(yǎng)1周后，取生長良好且根系完整的植株進行以下三 個實施例的試驗。
以下實施例中涉及的試驗方法如下
① 植物體中氮磷含量的測定氮(N)測定使用Vario III元素分析儀(德國)， 磷(P)測定采用鉬銻抗比色法(鮑士旦(1992) 土壤農(nóng)化分析，農(nóng)業(yè)出版社)。
② 水中葉綠素Chl a濃度的測定水樣經(jīng)Whatman GF/F玻璃纖維濾膜過濾后， 濾膜保存于凍存管中，在-2(TC，以N， N-二甲基甲酰胺(DMF)為萃取劑萃取24h，每 12小時振蕩一次，萃取液經(jīng)有機相樣品針式過濾器(0.45um)抽濾后用Turner 10AU Fluorometer測定Chl a。
③ 中肋骨條藻密度的測定樣品用Lugol' s試劑(濃度為1% (體積比))固定， 在倒置顯微鏡(Leica DM 1L)下、用浮游生物計數(shù)板計數(shù)。
④ 中肋骨條藻大小的測定在熒光顯微鏡(Leica DM4500B)下獲得圖像，使用圖 像測量軟件Image-Pro Express 6. 0測定大小。
⑤ 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析利用OriginPro 7.5對實驗數(shù)據(jù)作圖，SPSS 13.0 (One-way ANOVA)進行方差分析，各處理組平均值的多重比較采用LSD檢驗。處理組間差異不 顯著用相同字母(如a)表示，處理組間差異顯著則用不同字母(a，b，c，d等)表示。
實施例1、海馬齒對赤潮暴發(fā)的抑制作用和對富營養(yǎng)化海水的修復(fù)作用 取賞笞湖海水(0.45ym醋酸纖維濾膜過濾)，加入N、 P營養(yǎng)鹽(KN03的終濃度
為0.5mg/L、 (NH》2S04的終濃度為3.5mg/L、 &即04的終濃度為0. 05mg/L)，調(diào)鹽度至
30、 pH至8.0，得到溶液A。
一、海馬齒對赤潮暴發(fā)的抑制作用
取9只水缸，每一水缸中加入15L溶液A，接入處于指數(shù)生長期的中肋骨條藻，使其初始密度為1X106細(xì)胞/L。分成3組，每組設(shè)3個重復(fù)，分別進行以下處理 CK組(對照組)不移植海馬齒；
I處理組試驗一開始(即中肋骨條藻處于停滯期時)就移植海馬齒，種植密度 為15株/缸(相當(dāng)于5g FW/L);
W處理組等發(fā)生赤潮時(即中肋骨條藻處于指數(shù)生長期時)再移植海馬齒，種
植密度為15株/缸(相當(dāng)于5g FW/L)。
以上3組均培養(yǎng)lld， 24h通氣和水循環(huán)，平均光照為130 umolm231，光周期 為12h，平均氣溫為24/30。C，水溫為28士2'C。每天定時取樣，測定水中葉綠素(Chl a)濃度(每個重復(fù)取樣一次)和中肋骨條藻密度(每個重復(fù)取樣兩次)。
水中葉綠素(Chla)濃度的測定結(jié)果見圖l。水中中肋骨條藻密度的測定結(jié)果見 圖2。結(jié)果表明海馬齒能夠明顯抑制赤潮的暴發(fā)，顯著抑制中肋骨條藻的生長，降 低水中Chl a濃度；另外，在中肋骨條藻生長指數(shù)期再移入海馬齒，同樣能夠降低中 肋骨條藻的生長速率，使中肋骨條藻不能達到種群最大密度，并且可以加快赤潮的衰 敗。
根據(jù)試驗各種處理下水體中葉綠素a (Chls)濃度和中肋骨條藻密度，分別計算 試驗第6天海馬齒對中肋骨條藻的抑制率和試驗第8天海馬齒對葉綠素(Chl a)的 抑制率，計算方法如下
抑制率(％)=(對照組數(shù)值一處理組數(shù)值)/對照組數(shù)值X100X。 抑制率結(jié)果見圖3。結(jié)果表明不管在中肋骨條藻生長停滯期述是在指數(shù)期，海 馬齒都能有效抑制赤潮暴發(fā)；W處理組中(即中肋骨條藻處于指數(shù)生長期時再移植海 馬齒)，海馬齒對水中Chl a和中肋骨條藻密度的抑制率分別為35.5X和22.4M; I 處理組中(即中肋骨條藻處于停滯期時就移植海馬齒)，海馬齒的作用效果更加明顯， 對水中Chl a和中肋骨條藻密度的抑制率分別達到了 98. 6%和97. 5%。 二、海馬齒對富營養(yǎng)化海水的修復(fù)作用
植物對水體營養(yǎng)鹽的修復(fù)程度主要由植物從水中吸收的氮磷含量來體現(xiàn)。圖4為 在海區(qū)條件下生長一個月內(nèi)海馬齒體內(nèi)N和P的百分含量，分別平均為2. 23%和0. 38 %。
另取3只水缸，每一水缸中加入15L溶液A，接入處于指數(shù)生長期的中肋骨條藻， 使其初始密度為lXl(f細(xì)胞/L。種植海馬齒，種植密度為15株/缸(相當(dāng)于5gFW/L)。 培養(yǎng)11天，實驗開始時和實驗結(jié)束時測定植物鮮重和體內(nèi)氮磷的含量。將15株植物 鮮重和氮磷總增加量除以天數(shù)再除以植株數(shù)，計算平均每天每株植株的增加量，見圖 5。結(jié)果表明海馬齒在試驗過程中，生長迅速，進行完ll天的試驗后，平均每株 海馬齒鮮重增加0. 424g(占試驗前海馬齒總重的0. 484%)，體內(nèi)N含量增加了 9. 439mg (占試驗前N含量的0. 484%),體內(nèi)P含量增加了 1. 620 mg占試驗前P含量的0. 484%)。 平均每天每株海馬齒鮮重增加0. 039g (占試驗前海馬齒總重的0.044%)，體內(nèi)N含 量增加了 0.858mg (占試驗前N含量的0. 044%)，體內(nèi)P含量增加了 0. 147mg (占試 驗前P含量的0.044%)?？梢?，海馬齒能夠通過生物量的增加而大量吸收水中的氮和 磷，從而去除水中氮磷營養(yǎng)鹽。結(jié)果表明海馬齒可以顯著降低水體中氮磷的含量，修 復(fù)富營養(yǎng)化的水體。
實施例2、營養(yǎng)鹽充足時不同種植密度的海馬齒對中肋骨條藻的抑制作用
取賞笞湖海水(0.45ym醋酸纖維膜過濾)，加入N、 P營養(yǎng)鹽(KN03的終濃度為 0. 5rag/L、 (NH4)2S(^的終濃度為3. 5mg/L、 1(2^04的終濃度為0. 05mg/L)，調(diào)鹽度至30、 pH至8.0，得到溶液A。
取18只水缸，每一水缸中加入15L溶液A，接入指數(shù)生長期的中肋骨條藻，使其 初始密度為0.2X1()6細(xì)胞/L。然后分成6組，每組設(shè)3個重復(fù)，分別進行以下處理
第一組不移植海馬齒；
第二組移植海馬齒，海馬齒的種植密度為3株/缸(相當(dāng)于lg FW/L) 第三組移植海馬齒，海馬齒的種植密度為6株/缸(相當(dāng)于2g FW/L) 第四組移植海馬齒，海馬齒的種植密度為9株/缸(相當(dāng)于3g FW/L) 第五組移植海馬齒，海馬齒的種植密度為12株/缸(相當(dāng)于4g FW/L); 第六組移植海馬齒，海馬齒的種植密度為15株/缸(相當(dāng)于5g FW/L); 為了保證營養(yǎng)鹽充足，以上六組均隔天添加N、P營養(yǎng)鹽(KN03的終濃度為0. 5mg/L、 (NH》2S04的終濃度為3.5mg/L、 &朋04的終濃度為0,站mg/L) ， 24h通氣和水循環(huán)，平 均光照130 umol m2 s—、光周期為12h，平均氣溫24/3(TC，水溫為28土2。C。每天 定時取樣，測定水中葉綠素(Chl a)濃度(每個重復(fù)取樣一次)和水中中肋骨條藻 密度(每個重復(fù)取樣兩次)。試驗進獰9天。.
水中葉綠素(Chls)濃度的測定結(jié)果見圖6。水中中肋骨條藻密度的測定結(jié)果見 圖7。結(jié)果表明海馬齒能夠顯著降低水中Chl a的濃度和中肋骨條藻的密度，抑制 赤潮的發(fā)生，而且海馬齒的種植密度在一定程度上決定了抑制作用的強弱。隨著海馬 齒種植密度的升高，對中肋骨條藻生長的抑制作用增強。另外，在不同種植密度下， 海馬齒對中肋骨條藻生長抑制作用的動態(tài)過程略有不同。在海馬齒種植密度為lgFW/L 吋，海馬齒延遲中肋骨條藻進入指數(shù)生長期，而海馬齒種植密度稍高時，不僅抑制中肋骨條藻的生長，而且降低最大中肋骨條藻種群密度，尤其是當(dāng)海馬齒種植密度》4g FW/L時，可完全抑制中肋骨條藻的生長。
記錄各種處理下水體中的葉綠素a (Chla)濃度和中肋骨條藻密度，分別計算試 驗第6天海馬齒對中肋骨條藻的抑制率和試驗第8天海馬齒對葉綠素(Chl a)的抑 制率。
抑制率結(jié)果見留80結(jié)果表明，在不同種植密度下，海馬齒對水中Chl 3和水中 中肋骨條藻生長的抑制率基本都達到了 80%以上。
試驗進行9天后，檢測海馬齒植株生長指標(biāo)的變化，計算每缸中海馬齒鮮重總增 加量、N總增加量和磷總增加量，見表l。
表1不同種植密度的海馬齒培養(yǎng)9天后植物鮮重及體內(nèi)氮磷的總增加量
處理lg/L2g/L3g/L4g/L5g/L
鮮重增加量(g)2. 173. 365. 846. 247. 00
N增加量(mg)48. 3174. 80130.01138. 91155.83
P增加量(mg)8. 2912.8422. 3123. 8426. 75
實施例3、海馬齒根、莖、葉提取物對中肋骨條藻的抑制作用
一、 提取液制備
各取15g海馬齒根、莖、葉的干粉末，加100ml無菌水在常溫黑暗中浸提24h， 每次用超聲波萃取l h，重復(fù)3次。然后在4000 g下離心10 min，收集上清液并經(jīng) 0.22 um混合纖維濾膜過濾，濾液保存在4。C，作為母液備用。
二、 提取液對中肋骨條藻的抑制作用
以f/2培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)液，調(diào)鹽度、pH分別至30和8.0，高溫滅菌后，分別 加入海馬齒根、莖、葉的提取物母液，使?jié)舛葹? g DW/L (以干粉計，每升培養(yǎng)液中 含有海馬齒干粉3 g)。接入處于指數(shù)生長期的中肋骨條藻，初始密度為2X1()6細(xì)胞 /L，每個處理重復(fù)6次。培養(yǎng)8天，每天定時取樣lml，測定中肋骨條藻密度以及大 小。
中肋骨條藻密度見圖9。結(jié)果表明在培養(yǎng)液中加入海馬齒根、莖、葉提取物均 降低了中肋骨條藻的生長速率和種群的最大密度；對中肋骨條藻密度生長抑制作用最 強的是葉，其次為莖，最后為根。
培養(yǎng)第8天，中肋骨條藻的形態(tài)大小見圖10和圖11。其中處理組間以相同字母(如 a)標(biāo)記表示兩者無顯著差異，若處理組間以不同字母(如a與b)標(biāo)記則表示兩者存 在顯著差異。結(jié)果表明在培養(yǎng)液中加入海馬齒根、莖、葉提取物均改變了中肋骨條藻細(xì)胞的大小形態(tài)；海馬齒各種提取物的抑制作用體現(xiàn)在明顯增大了中肋骨條藻細(xì)胞 的長度和體積，分別是對照組的2-3倍，尤其是在海馬齒葉提取物的作用下，中肋骨 條藻的體積增大了2.5倍，同時中肋骨條藻細(xì)胞寬度也較對照組大(p二O.OOl)。熒 光顯微鏡下觀察，不同海馬齒組織提取物處理之后，單個中肋骨條藻細(xì)胞明顯由橢球 形變?yōu)殚L棒形，而且部分細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，核質(zhì)增多，液泡變大。
實施例4、不同濃度的海馬齒提取物對中肋骨條藻的抑制作用
一、 海馬齒葉提取物對中肋骨條藻的抑制作用
取15g海馬齒葉的干粉末，加100ml無菌水在常溫黑暗中浸提24h，每次用超聲 波萃取1 h，重復(fù)3次。然后在4000 g下離心10 min，收集上清液并經(jīng)0. 22 u m混 合纖維濾膜過濾，濾液保存在4'C，作為母液備用。
以f/2培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)液，調(diào)鹽度、pH分別至30和8.0，高溫滅菌后，加入 海馬齒葉提取物母液，以葉干粉計，每升培養(yǎng)液中分別含有O g (CK) 、 0.5 g、 3 g、 6 g海馬齒葉干粉。接入處于指數(shù)生長期的中肋骨條藻，使其初始密度為2X1()6細(xì)胞 /L，每個處理重復(fù)6次。培養(yǎng)11天，每天定時取樣lml，測定中肋骨條藻密度。
中肋骨條藻密度見圖12。
結(jié)果表明海馬齒葉提取物的克生作用非常明顯。在海馬齒葉提取物最低濃度為 0.5g L—'時，對中肋骨條藻生長的抑制作用即達到99%。根據(jù)Sigmoidal Model (OriginPro 7. 5) (R2=l)函數(shù)處理實驗結(jié)果，當(dāng)海馬齒提取物的濃度為0. 075g海馬齒 葉干粉/106個中肋骨條藻細(xì)胞，其抑制率即可達到50%。
二、 海馬齒莖提取物對中肋骨條藻的抑制作用
取15g海馬齒莖的干粉末，加100ml無菌水在常溫黑暗中浸提24h，每次用超聲 波萃取l h，重復(fù)3次。然后在4000 g下離心10 min，收集上清液并經(jīng)0. 22 y m混 合纖維濾膜過濾，濾液保存在4"C，作為母液備用。
以f/2培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)液，調(diào)鹽度、pH分別至30和8.0，高溫滅菌后，加入 海馬齒莖提取物母液，以莖干粉計，每升培養(yǎng)液中分別含有O g (CK) 、 0.5 g、 3 g、 6 g海馬齒莖干粉。接入處于指數(shù)生長期的中肋骨條藻，使其初始密度為5乂106細(xì)胞 /L，每個處理重復(fù)6次。培養(yǎng)8天，每天定時取樣lml，測定中肋骨條藻密度。
中肋骨條藻密度見圖13。結(jié)果表明隨著海馬齒莖提取物濃度的升高，對中肋骨 條藻生長的抑制作用增強。當(dāng)海馬齒莖提取物濃度為6gL—'時，對中肋骨條藻生長的 抑制率最高，為99.8%，其次為3 g L_1， 79.1%，再次為1 g L—'， 44.1%，最后為 0. 5gL—'，其抑制率為29. 1%。根據(jù)Sigmoidal Model (OriginPro 7. 5) (R2=0. 995)函數(shù)處理實驗結(jié)果，當(dāng)海馬齒提取物濃度為0. 61g海馬齒莖干粉/106個中肋骨條藻細(xì) 胞時，其抑制率達到50%。
三、海馬齒根提取物對中肋骨條藻的抑制作用
取15g海馬齒根的干粉末，加100ml無菌水在常溫黑暗中浸提24h，每次用超聲 波萃取l h，重復(fù)3次。然后在4000 g下離心10 min，收集上清液并經(jīng)0. 22 yra混 合纖維濾膜過濾，濾液保存在4'C，作為母液備用。
以f/2培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)液，調(diào)鹽度、pH分別至30和8.0，高溫滅菌后，加入 海馬齒根提取物母液，以根干粉計，每升培養(yǎng)液中分別含有O g (CK) 、 0.5 g、 3 g、 6 g海馬齒根干粉。接入處于指數(shù)生長期的中肋骨條藻，使其初始密度為2Xl(/細(xì)胞 /L，每個處理重復(fù)6次。培養(yǎng)8天，每天定時取樣lml，測定中肋骨條藻密度。
中肋骨條藻密度見圖14。結(jié)果表明當(dāng)海馬齒根提取物濃度較低時，對中肋骨條 藻的抑制作用不明顯，當(dāng)海馬齒根提取物的濃度升高時，對中肋骨條藻的生長具有一 定的抑制作用，在海馬齒根提取物濃度為6gL—'時，對中肋骨條藻生長的抑制作用達 到最大，為28%。根據(jù)Sigmoidal Model (OriginPro 7. 5) (R2=0. 960)函數(shù)處理實驗 結(jié)果，若要使對中肋骨條藻的抑制率達到50%，海馬齒根提取物的濃度至少應(yīng)為6g 海馬齒根干粉/106個中肋骨條藻細(xì)胞。
權(quán)利要求
1、海馬齒及其提取物在修復(fù)富營養(yǎng)化水體中的應(yīng)用。
2、 海馬齒及其提取物在抑制赤潮中的應(yīng)用。
3、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述赤潮是由中肋骨條藻引起的。
4、 海馬齒及其提取物在抑制中肋骨條藻生長中的應(yīng)用。
5、 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中，海馬齒的用量至少為l株海馬齒/106個中肋骨條藻細(xì)胞。
6、 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述提取物為海馬齒干粉的水提物。
7、 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述海馬齒干粉為海馬齒葉干粉、海馬齒莖干粉和海馬齒根干粉中的至少一種。
8、 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述海馬齒干粉為海馬齒葉干粉，以海馬齒葉干粉計，所述應(yīng)用中，海馬齒提取物的用量至少為0.075g海馬齒葉干粉 /106個中肋骨條藻細(xì)胞。
9、 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述海馬齒干粉為海馬齒莖干粉，以海馬齒莖干粉計，所述應(yīng)用中，海馬齒提取物的用量至少為0. 61g海馬齒莖干粉/106 個中肋骨條藻細(xì)胞。
10、 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述海馬齒干粉為海馬齒根干粉， 以海馬齒根干粉計，所述應(yīng)用中，海馬齒提取物的用量至少為6g海馬齒根干粉/106 個中肋骨條藻細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海馬齒及其提取物的新用途。本發(fā)明提供了海馬齒及其提取物在修復(fù)富營養(yǎng)化水體、抑制赤潮和抑制中肋骨條藻生長中的應(yīng)用。海馬齒低密度種植時，延遲中肋骨條藻進入指數(shù)生長期；中密度時，降低中肋骨條藻細(xì)胞生長率和最大種群密度；高密度時，直接殺死中肋骨條藻細(xì)胞，使其無法進入指數(shù)生長期。海馬齒根、莖、葉干粉的水提物均能抑制中肋骨條藻生長，降低生長速率和種群的最大密度，隨著提取物濃度升高，抑制作用增強；自強至弱為葉、莖、根。海馬齒可通過生物量的增加積累氮磷營養(yǎng)鹽，降低水體富營養(yǎng)化程度和赤潮發(fā)生頻率。海馬齒是高經(jīng)濟價值的海水蔬菜，可廣泛應(yīng)用于近海海域富營養(yǎng)化污染和赤潮的治理，具很高的生態(tài)經(jīng)濟及社會價值。
文檔編號A01N65/08GK101416649SQ200810239400
公開日2009年4月29日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者丹 姜, 張志英, 李銀心, 林施泉, 董美艷, 黃凌風(fēng) 申請人:中國科學(xué)院植物研究所