專利名稱：一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，特別涉及一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法。
背景技術(shù)：
由于生理解剖結(jié)構(gòu)微小，聲音信號(hào)極為微弱，研究較少且結(jié)果不一，小鼠有無咳嗽 目前在國際上還存在很大爭議。印度學(xué)者和墨西哥學(xué)者將藥物刺激后的小鼠用漏斗形裝置 罩住，將聽診器置于頂端進(jìn)行小鼠聲音的監(jiān)測，但結(jié)果相對主觀不能記錄分析。我國的吳康 松于2002年發(fā)表了小鼠咳嗽模型的建立方法，主要模仿日本的Jimzo Kamei教授的檢測方 法進(jìn)行，并沒有特殊的改進(jìn)。Kamei教授自上世紀(jì)九十年代起開始并堅(jiān)持使用小鼠咳嗽模型 進(jìn)行鎮(zhèn)咳藥的研究，是目前使用小鼠咳嗽模型最多的學(xué)者。他使用雙腔體描艙將小鼠的頭 部和身體分處于相對獨(dú)立的密閉艙中，小鼠處于清醒半固定狀態(tài)，定量霧化辣椒素，連接呼 吸波形描記儀檢測胸部氣流的變化，主要通過觀察小鼠腹部急速抽搐運(yùn)動(dòng)同時(shí)合并異常呼 吸波形進(jìn)行咳嗽的判斷。但由于沒有咳嗽聲音檢測，因此說服力較弱。因始終未能像豚鼠 一樣得到聲音和波形的統(tǒng)一，小鼠咳嗽檢測至今未得到學(xué)術(shù)界的公認(rèn)，小鼠咳嗽聲音檢測 是逾越這一障礙的關(guān)鍵。豚鼠性情溫和，咳嗽反射容易引出，聲音響亮可直接聽到，自1955年Charles監(jiān)聽 豚鼠咳嗽聲音以來，豚鼠一直是進(jìn)行咳嗽反射機(jī)制及咳嗽新藥研究的最常用動(dòng)物。2004年 美國Buxco公司和諾華公司共同研發(fā)了豚鼠咳嗽自動(dòng)檢測軟件，其人工檢測和軟件自動(dòng)檢 測的符合率已達(dá)到98%以上，在2005年ATS大會(huì)發(fā)布后得到了廣泛的認(rèn)可。雖然豚鼠的咳 嗽檢測已十分成熟，但使用豚鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)成本較高，豚鼠體質(zhì)嬌嫩容易死亡，篩選藥物時(shí)藥 物耗費(fèi)大，難以進(jìn)行多組及大批量研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠咳嗽模型的建 立和檢測方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，包 括以下操作步驟(1)提供雌性Balb/c小鼠，小鼠的年齡為6 15周齡，小鼠體重為22 25g，動(dòng) 物級(jí)別為SPF級(jí)；(2)利用Buxco無創(chuàng)檢測系統(tǒng)，該Buxco無創(chuàng)密閉體描艙連接有聲音監(jiān)聽設(shè)備和信 號(hào)轉(zhuǎn)化器，將上述小鼠置于體描艙內(nèi)自由活動(dòng)；(3)使用辣椒素激發(fā)液霧化激發(fā)小鼠咳嗽，實(shí)時(shí)監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音，通過聲音分析 軟件記錄聲波，并通過Fin印ointe軟件將艙內(nèi)氣流變化轉(zhuǎn)化為呼吸波形進(jìn)行記錄并自動(dòng) 實(shí)時(shí)分析。步驟(1)所述小鼠的年齡優(yōu)選為10周齡。步驟(2)所述聲音監(jiān)聽設(shè)備為微型麥克風(fēng)。
步驟(3)所述辣椒素激發(fā)液的濃度為lOOymol/L ；所述辣椒素激發(fā)液的霧化劑量 為 1. 0ml/3mino步驟(3)所述聲音分析軟件為cooledit軟件。步驟(3)所述辣椒素激發(fā)液由以下組分配制而成辣椒素30. 5mg，吐溫801ml，無 水乙醇Iml，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.9%的氯化鈉溶液8ml。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，僅需在監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音的同時(shí)觀察小鼠咳嗽呼吸波形 即可即時(shí)確定小鼠咳嗽，在小鼠咳嗽檢測同時(shí)就能得到最終數(shù)據(jù)。具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效 果(1)本發(fā)明利用原本用于肺功能檢測的Buxco的無創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)儀器裝置， 來進(jìn)行小鼠咳嗽的檢測，這是國際首創(chuàng)；(2)直接監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音，并記錄保存進(jìn)行回放分析，從而確?？人詳?shù)據(jù)的客觀 性和準(zhǔn)確性，為FP軟件開發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)來源；(3)小鼠呼吸波形分析更為細(xì)致，通過Buxco系統(tǒng)FP軟件得到的呼吸波形區(qū)分為 7類，可更加準(zhǔn)確地辨認(rèn)性質(zhì)特征；(4)無需觀察小鼠腹部運(yùn)動(dòng)情況，減少主觀因素對判斷的影響；(5)無需分析聲波變化，避免雜音干擾影響數(shù)據(jù)分析。(6)本方法可大大降低工作強(qiáng)度，節(jié)省工作時(shí)間，提高工作效率，有利于小鼠咳嗽 模型的推廣和應(yīng)用。在本研究基礎(chǔ)上與美國Buxco公司合作開發(fā)的Fin印ointe小鼠咳嗽 檢測軟件具有較高的相關(guān)性和一致性，顯示了良好的開發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。


圖1為人工計(jì)數(shù)和軟件計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析圖。圖2為人工計(jì)數(shù)和軟件計(jì)數(shù)的一致性分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例11、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌性，10周齡，體重22_25g，可以自由進(jìn)食去OVA的飼料和三 蒸水。將40只小鼠分為生理鹽水(normal saline, NS)組、可待因(codeine，⑶I)組、辣 椒平(capsaz印ine，CPZ)組、辣椒素(Capsasin，CAP)耗竭組，每組10只。CDI組和CPZ組 小鼠在實(shí)驗(yàn)前2天及實(shí)驗(yàn)日均給予藥物預(yù)處理，共計(jì)3次。⑶I組小鼠(100mg/kg)予可待 因0. 2ml/d灌胃，CPZ組小鼠(6mg/kg)予0. 2ml/d辣椒平腹腔注射。NS組使用生理鹽水 0. 2ml/d灌胃，實(shí)驗(yàn)流程同前。辣椒素耗竭組在實(shí)驗(yàn)前3天予50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg 辣椒素皮下注射，總劑量達(dá)到300mg/kg。每次用藥前均使用戊巴比妥鈉(60mg/kg)淺麻醉， 氨茶堿(25mg/kg)腹腔注射、特布他林(0. lmg/kg)皮下注射以減少藥物不適反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)當(dāng) 日直接行咳嗽檢測。2、檢測方法
清醒小鼠位于Buxco無創(chuàng)體描艙中自由活動(dòng)，向霧化頭中加入lOOymol/L辣椒 素激發(fā)液(所述辣椒素激發(fā)液由以下組分配制而成辣椒素30. 5mg,吐溫801ml，無水乙醇 lml，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0. 9%的氯化鈉溶液8ml) Iml霧化3min，霧化結(jié)束后繼續(xù)觀察3min，共記 錄6min內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)。微型麥克風(fēng)實(shí)時(shí)監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音，同時(shí)通過cooledit軟件記 錄聲波，必要時(shí)可回放以便重復(fù)分析。使用Fin印ointe軟件記錄小鼠呼吸波形，可通過呼 吸波形的變化自動(dòng)判斷小鼠異常呼吸波形是否為咳嗽。操作者仔細(xì)觀察小鼠腹部運(yùn)動(dòng)，如 果在小鼠出現(xiàn)典型快速揚(yáng)頭張口，腹部急速抽動(dòng)的同時(shí)聽到清脆的咳嗽聲音，立即點(diǎn)擊熱 鍵標(biāo)記為一次咳嗽。待小鼠咳嗽檢測結(jié)束后再次瀏覽軟件自動(dòng)標(biāo)記咳嗽波形及熱鍵標(biāo)記符 號(hào)，觀察聲音和呼吸波形的一致性，最終判斷是否咳嗽。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法藥物預(yù)處理后小鼠咳嗽次數(shù)檢測結(jié)果以χ表示，SPSS12. O軟件進(jìn)行分析。多組 樣本均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)；軟件分析和人工計(jì)數(shù)小鼠咳嗽進(jìn)行相關(guān)性 檢驗(yàn)和一致性分析，P < 0. 05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、結(jié)果(1)藥物預(yù)處理后小鼠咳嗽次數(shù)的變化(結(jié)果見表1)CAP組小鼠在用藥后出現(xiàn)精神萎靡，食欲減退，10只小鼠存活8只。其余實(shí)驗(yàn)組小 鼠無明顯不適。經(jīng)辣椒素刺激后各藥物預(yù)處理組小鼠與NS組比較咳嗽次數(shù)顯著降低，進(jìn)一 步提示建立的小鼠咳嗽檢測方法具有較高的可信性。表1使用不同藥物預(yù)處理后小鼠咳嗽次數(shù)的比較 注與NS組比較廣ρ < 0.01(2)小鼠呼吸波形的種類Finepointe系統(tǒng)檢測到辣椒素刺激后小鼠出現(xiàn)的多種呼吸波形，結(jié)合小鼠腹部運(yùn) 動(dòng)和聲音監(jiān)聽結(jié)果，判斷相關(guān)波形為平靜呼吸波形波形頻率和呼吸深度均一，多于初期小鼠適應(yīng)艙內(nèi)環(huán)境后及辣椒 素霧化完畢小鼠恢復(fù)平靜時(shí)出現(xiàn)。
急促呼吸波形呼吸頻率增加，呼吸幅度增加。多于小鼠剛剛進(jìn)入密閉艙尚未熟悉 環(huán)境時(shí)、辣椒素刺激過程及恢復(fù)階段中，活動(dòng)明顯增多。屏氣波形呼吸頻率減慢，呼吸幅度明顯減弱。多于辣椒素刺激后，小鼠主動(dòng)性減 慢呼吸以減少辣椒素的吸入，蜷縮于密封艙內(nèi)，活動(dòng)減少。典型咳嗽波形振幅高大，波形較寬，類似心電圖波形。此時(shí)小鼠出現(xiàn)快速揚(yáng)頭張 嘴，腹部急速抽動(dòng)，可聽到清脆響亮的咳嗽聲音。不典型咳嗽波形波形與典型咳嗽波形相似，只是波形幅度較低，此時(shí)小鼠同樣出 現(xiàn)快速揚(yáng)頭張嘴，腹部急速抽動(dòng)，可聽到清脆響亮的咳嗽聲音。深吸氣波形波形前寬后窄，與咳嗽波形明顯不同，容易區(qū)分。此時(shí)亦有快速揚(yáng)頭 張嘴，腹部急速抽動(dòng)表現(xiàn)，但未聽到咳嗽聲音。甩頭波形呈倒V形。可聽到清晰類似吹風(fēng)的甩頭聲，音域稍低，時(shí)程稍長。此時(shí) 小鼠有明顯用力左右甩頭動(dòng)作。(3)人工監(jiān)聽與Fin印ointe軟件自動(dòng)記錄小鼠咳嗽次數(shù)的相關(guān)性和一致性分析 (見圖1和圖2)。小鼠咳嗽人工計(jì)數(shù)和Fin印ointe軟件計(jì)數(shù)的相關(guān)系數(shù)r = 0. 964，ρ = 0. 000，按 α =0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，r有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人工計(jì)數(shù)和軟件計(jì)數(shù)呈正相關(guān)一致性分析提示ICC =0.956，ICC的95%可信區(qū)間為(0. 911，0. 978)。其他誤差占總誤差的4. 4% (1-ICC)。 軟件計(jì)數(shù)與人工計(jì)數(shù)比較誤差較小，精密度較高，信度較好。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)提供雌性Balb/c小鼠，小鼠的年齡為6～15周齡，小鼠體重為22～25g，動(dòng)物級(jí)別為SPF級(jí)；(2)提供Buxco無創(chuàng)檢測系統(tǒng)，該Buxco無創(chuàng)密閉體描艙連接有聲音監(jiān)聽設(shè)備和信號(hào)轉(zhuǎn)化器，將上述小鼠置于體描艙內(nèi)自由活動(dòng)；(3)使用辣椒素激發(fā)液霧化激發(fā)小鼠咳嗽，實(shí)時(shí)監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音，通過聲音分析軟件記錄聲波，并通過Finepointe軟件將艙內(nèi)氣流變化轉(zhuǎn)化為呼吸波形進(jìn)行記錄并自動(dòng)實(shí)時(shí)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，其特征在于步驟(1) 所述小鼠的年齡為10周齡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，其特征在于步驟(2) 所述聲音監(jiān)聽設(shè)備為微型麥克風(fēng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，其特征在于步驟(3) 所述辣椒素激發(fā)液的濃度為100 μ mol/L ；所述辣椒素激發(fā)液的霧化劑量為1. 0ml/3min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，其特征在于步驟(3) 所述聲音分析軟件為cooledit軟件。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，其特征在于步驟(3) 所述辣椒素激發(fā)液由以下組分配制而成辣椒素30. 5mg,吐溫801ml，無水乙醇1ml，質(zhì)量百 分?jǐn)?shù)0.9%的氯化鈉溶液8ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鼠咳嗽模型的建立和檢測方法，包括以下操作步驟(1)提供雌性Balb/c小鼠，小鼠的年齡為10周齡，小鼠體重為22～25g，動(dòng)物級(jí)別為SPF級(jí)；(2)提供Buxco無創(chuàng)檢測系統(tǒng)，該Buxco無創(chuàng)密閉體描艙連接有聲音監(jiān)聽設(shè)備和信號(hào)轉(zhuǎn)化器，將上述小鼠置于體描艙內(nèi)自由活動(dòng)；(3)使用辣椒素激發(fā)液霧化激發(fā)小鼠咳嗽，實(shí)時(shí)監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音，通過聲音分析軟件記錄聲波，并通過Finepointe軟件將艙內(nèi)氣流變化轉(zhuǎn)化為呼吸波形進(jìn)行記錄并自動(dòng)實(shí)時(shí)分析。本方法同時(shí)監(jiān)測小鼠咳嗽聲音和呼吸波形，可大大降低工作強(qiáng)度，節(jié)省工作時(shí)間，提高工作效率，有利于小鼠咳嗽模型的推廣和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61D7/00GK101897627SQ20101021419
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者約瑟夫·馬克·羅麥斯克, 蔣波, 賴克方, 鐘南山, 陳莉延 申請人:廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;美國Buxco電子有限公司;廣州呼吸疾病研究所;呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室