專利名稱：重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子i型的化學(xué)偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基生物工程領(lǐng)域，具體涉及缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的重組制備，缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的聚乙二醇化學(xué)修飾，以及修飾前后的純化及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor, KGF)屬于纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)家族，目前，發(fā)現(xiàn)了兩種角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor, KGF),即角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(KGF-I)和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子 II 型(KGF-II)，分別命名為 FGF-7 和 FGF-10 (Aaronoson SA. et al.J. Annals of theNew York Academy of science, 1991,638 :62-77.)。Rubin 等人(Rubin, J. S. , et al. ProcNatl Acad Sci U S A, 1989. 86(3) p. 802-6.)從人胎肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離并純化得到KGF-I，并發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)小鼠角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的作用，故將其定名為角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子。KGF-II 是 Emoto 等(Emoto H Tagashira S Mattei MG, Journal of biologychemistry, 1997(37))于1997年從肺中分離出編碼人KGF-II的cDNA。人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I 型(human keratinocyte growth factor, hKGF-I)位于15號(hào)染色體，其cDNA編碼194個(gè)氨基酸殘基，包括一段21個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽。成熟的hKGF-I為一含163個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽。臨床前研究和臨床研究顯示，人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型是一種多功能的生長(zhǎng)因子，通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、分化、存活、DNA修復(fù)以及誘導(dǎo)對(duì)活性氧具有解毒功能的酶的表達(dá)來加強(qiáng)上皮功能，從而保護(hù)上皮免于毒性物質(zhì)的損傷(Finch, P. ff.，et al.，Science, 1989. 245(4919) p. 752-5. ； Rub in, J. S.，etal. V ；Farrell, C. L. , et al. , Int J Radiat Biol, 1999. 75 (5) :p. 609-20. ；Farrell, C. L.,et al. , Cancer Res,1998. 58(5) :p. 933-9. ；Ellison CA, et al. , J Clin Immunol,2008,28(5) :600-615.)。天然野生型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一個(gè)含163個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽，含位于1,15,40,102,106的五個(gè)半胱氨酸，其中Cysl_Cysl5、Cysl02_Cysl06形成兩對(duì)二硫鍵，Cys40 以游離疏基形式存在(Timothy D. Osslund et al. , prorein Science (1998), 7 1681-1690)。文獻(xiàn)報(bào)道(Osslund TD.，et al.，Protein Sci. 1998 Aug ；7(8) :1681-90.；Hsu E et al. , Protein Eng Des Sel. 2006Apr ；19 (4) 147-53. Epub 2006 Feb 14.)缺失N端23個(gè)氨基酸(A 23hKGF)和或突變其第40，102，106位半胱氨酸對(duì)其生物活性無影響，即二硫鍵的形成與否與其生物活性無關(guān)。
由Amgen公司開發(fā)的重組人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子Palifermin (商品名Kepivance)是缺失人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的N末端23個(gè)氨基酸(A 23hKGF) (EricHsu et al. , Protein Engineering, Design&SeIection vol.19 no. 4pp. 147-153,2006),于2004年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療血液腫瘤患者高劑量化療或者聯(lián)合放療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜損傷。A 23hKGF在體內(nèi)的半衰期僅為2-3hr，臨床給藥劑量大(60 u g/kg/日)，需連續(xù)給藥6天(I次/天)。
在治療用蛋白質(zhì)藥物的研究中，解決蛋白類藥物在機(jī)體內(nèi)半衰期短的方法眾多。其中最有效的方法之一是將蛋白質(zhì)與水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合成偶聯(lián)物。而所使用的水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚乳糖、聚合氨基酸等，其中聚乙二醇的使用最為普遍。聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物具有良好的熱穩(wěn)定性、抗酶解、增加水溶性、延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期、降低免疫原性和毒性等多重優(yōu)點(diǎn)(Inada, et al. , J. Bioact. And CompatiblePolymers, 5 :343(1990) ；Delgalo, et al. , Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier systems,9 :249 (1992) ；katre, Advanced Drug Delivery Systems,10 91(1993))。1991年第一種用聚乙二醇(PEG)修飾的藥物PEG-ADA上市，近幾年上市的產(chǎn)品有PEG-干擾素、PEG-粒細(xì)胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺酶、PEG-生長(zhǎng)抑素以及PEG-利巴韋林等。此外，尚有數(shù)十種PEG修飾的蛋白藥物處于研究或臨床實(shí)驗(yàn)階段。
對(duì)于聚乙二醇分子來說，可通過多種方法將其加到蛋白質(zhì)上?？偟膩碚f，聚乙二醇分子是通過其分子上的反應(yīng)基團(tuán)而偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上的。PEG的偶聯(lián)的主要基團(tuán)是氨基、巰基和羧基(Veroneee FM, Biomaterials, 2001, 22 :405),絕大部分修飾劑主要與Lys的e-氨基和N-末端的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)的。但特異性不高，從而造成產(chǎn)物的不均一性。而與巰基偶聯(lián)，特異性好，修飾率高，均一性好等特點(diǎn)。檢索國內(nèi)外專利和文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，采用聚乙二醇修飾人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的公開文獻(xiàn)僅有 Zhifeng Huang 等人(Zhifeng Huang, et al. , Journal of Biotechnology142(2009)242-249.)針對(duì)人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子N末端的聚乙二醇修飾。本專利發(fā)明了采用單甲氧基聚乙二醇特異性修飾重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(A23hKGF)的第79位半胱氨酸的游離巰基，該修飾方法修飾而成的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型偶聯(lián)物，具有修飾位點(diǎn)專一、結(jié)構(gòu)均一、易于實(shí)施等優(yōu)勢(shì)；更為重要的是在保留人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的生物活性下，能有效改善其體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)特性，實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)半衰期，減少給藥頻率，更適合作為一種預(yù)防或治療性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用聚乙二醇與重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的半胱氨酸的游離巰基共價(jià)連接而形成的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物能有效改善人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)；同時(shí)該偶聯(lián)物，可作為一種預(yù)防或治療藥物，或藥物組合物，在有效治療劑量用于治療對(duì)放化療引起的消化道粘膜損傷或潰瘍性黏膜炎、急性化學(xué)性肝損傷。本發(fā)明所述的聚乙二醇與重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的半胱氨酸的游離巰基共價(jià)連接中的半胱氨酸的游離巰基，指的是天然野生型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(hKGF) N末端缺失23個(gè)氨基酸的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子突變體(A23hKGF)的第79位半胱氨酸(Cys)，相當(dāng)于天然野生型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的第102位半胱氨酸。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先界定了缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的氨基酸序列或組成。所述的缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型是指在天然野生型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的氨基末端缺失23個(gè)氨基酸的突變體，序列特征為(序列為SEQ ID No 1)Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp He Arg Val Arg Arg Leu PheCys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg He Asp Lys Arg Gly Lys Val LysGly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn He Met Glu He Arg Thr
Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe TyrLeu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys AsnGlu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu lie Leu Glu Asn His Tyr Asn ThrTyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val AlaLeu Asn Gln Lys Gly lie Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys GluGln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala lie Thr同時(shí)包含在SEQ ID No :1序列的基礎(chǔ)上氨基末端增加或減少1-5個(gè)氨基酸的變異體。如從SEQ ID No 1序列的N末端增加一個(gè)甲硫氨酸(Met)，或增加5個(gè)氨基酸序列為 Glu-Arg-His-Thr-Arg或Met-Arg-His-Thr-Arg ;或從SEQ ID No :1序列的N末端減少一個(gè)絲氨酸(Ser)，或減少5個(gè)氨基酸序列為Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met，或減少4個(gè)氨基酸序列為Ser-Tyr-Asp-Tyr0同時(shí)也包含在SEQ ID No :I序列的基礎(chǔ)上分別或同時(shí)將第17位和第83位半胱氨酸突變成其他氨基酸的變異體。如將SEQ ID No : I序列的第17位和第83位半胱氨酸突變成Ser、Gly或Ala等其他氨基酸。所述的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型，是指通過基因工程重組技術(shù)，經(jīng)大腸桿菌重組表達(dá)，表達(dá)后經(jīng)層析分離技術(shù)獲得純度大于95%的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子 I 型(A 23hKGF)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了 A23hKGF的聚乙二醇修飾制備。所述的聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇馬來酸亞胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Maleimide,mPEG-MAL)活化分子，或?yàn)閱渭籽趸垡叶监彾蜈啾揉?Monomethoxy Polyethyleneglycol 0rtho-pyridyldisulfide,mPEG-0PSS)活化分子，或?yàn)閱渭籽趸垡叶家蚁┗?Monomethoxy Polyethylene glycol Vinylsufone, mPEG-VS)活化分子，或單甲氧基聚乙二醇疏基(Monomethoxy Polyethylene glycol sulfhydryl,mPEG_SH)活化分子，或?yàn)閱渭籽趸垡叶嫉獯宜岚?Monomethoxy Polyethylene glycol Iodo acetamide,mPEG_IA)活化分子，優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺活化分子。聚乙二醇分子可為直鏈型或分枝型，分子量介于5，000-40, 000道爾頓，其中優(yōu)選20，000道爾頓的直鏈型聚乙二醇分子和40，000道爾頓的分枝型聚乙二醇分子。通過基因工程重組表達(dá)制備的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(A 23hKGF)，其第79位半胱氨酸非游離(其與第83位半胱氨酸形成一對(duì)二硫鍵)，首先需要將該對(duì)二硫鍵還原，讓A 23hKGF的第79位半胱氨酸游離，充分暴露其巰基。二硫鍵的還原常用二硫蘇糖醇(DTT, Dithiothreitol)、P -疏基乙醇、三[2_ 羧乙基]勝(Tris [2-carboxyethyl]phosphine (TCEP))以及半胱氨酸等試劑。本發(fā)明中優(yōu)選用DTT將重組制備的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(A23hKGF)中的二硫鍵還原，再經(jīng)分子篩去除殘余DTT，最終獲得二硫鍵還原形式的A 23hKGF (r- A 23hKGF)。如果A 23hKGF中的第83位半胱氨酸突變成其他氨基酸，則不需要此步驟。所述的A23hKGF的聚乙二醇修飾，其是指重組制備的r_A23hKGF(第79位半胱氨酸游離)蛋白濃度為l-10mg/ml，在IO-IOOmm的磷酸鹽緩沖液，pH值5. 0-8. 0下，重組蛋白與聚乙二醇質(zhì)量比在I : 0. 5-6的條件與mPEG-MAL，或mPEG-OPSS，或mPEG-SH，或mPEG-IA，經(jīng)4-37°C，100r/min攪拌反應(yīng)0. 5_24hr后，調(diào)低pH終止反應(yīng)。再采用層析分離技術(shù)除去未被修飾的r-A23hKGF和游離PEG分子，獲得純度大于95%的聚乙二醇化重組r- A 23hKGF的偶聯(lián)物(PEG- A 23KGF)。其中優(yōu)選的修飾條件為r_ A 23hKGF原液用IOOmmoI/L磷酸鹽緩沖液，pH6. 5稀釋樣品至2mg/mL，按r_ A 23hKGF與mPEG-MAL_20KD質(zhì)量比為 I : 3 稱取 m PEG-MAL-20KD 加入 r-A23hKGF 溶液中，25°C，100r/min 攪拌反應(yīng) 2hr 后，用鹽酸調(diào)低pH至3. 0終止反應(yīng)。再經(jīng)SP-sepharose fast flow純化獲得純度大于95%的聚乙二醇化重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(PEG-A23KGF)。該制備方法經(jīng)實(shí)例證明，修飾率高、修飾特異性好、修飾后產(chǎn)物均一、且利于實(shí)施。本專利發(fā)明技術(shù)制備的聚乙二醇化重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(PEG-A23KGF)，在試驗(yàn)動(dòng)物中，經(jīng)I次體內(nèi)皮下注射，可有效保護(hù)由CCl4引起的急性肝損傷，保護(hù)5氟尿嘧啶引起的急性小腸粘膜損傷。因此，本發(fā)明所述的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的化學(xué)偶聯(lián)物，可作為一種預(yù)防或治療藥物，或藥物組合物，在有效治療劑量下用于預(yù)防和治療對(duì)放化療引起的消化道粘膜損傷或潰瘍性黏膜炎以及急性化學(xué)性肝損傷。至此已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，通過參考下列實(shí)例，能夠?qū)Ρ景l(fā)明有更清楚地理解，但所述實(shí)例僅為說明目的而并不旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。


圖I重組A 23hKGF表達(dá)和純化后的SDS-PAGE圖譜，A圖中I為大腸桿菌誘導(dǎo)前，2為誘導(dǎo)后，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；B圖中I為破菌上清,2為SP柱純化后,3為肝素純化后,4為分子篩分離的r-A 23hKGF，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。圖2r- A 23hKGF的mPEG-MAL_20k修飾前后和修飾后經(jīng)純化的SDS-PAGE圖譜，圖中I為修飾前，2為修飾后，3為修飾后純化的PEG-20K- A 23KGF, M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。圖3r- A 23hKGF和 PEG-20K- A 23KGF 的 RP-HPLC分析圖譜，其中 A 圖為 r_ A 23hKGF的RP-HPLC分析圖譜，B圖為PEG-20K-A 23KGF的RP-HPLC分析圖譜。兩者的保留時(shí)間相差0. 8min左右。圖4為 r-A23hKGF 和PEG-20K-A23KGF 的肽圖。其中 A 圖為 r_ A 23hKGF 的肽圖，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，B圖為PEG-20K-A 23KGF的肽圖，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。兩者相比較，A圖中18. 805min肽段峰在B圖中消失。圖5為PEG-20K- A 23KGF肽圖的ELSD檢測(cè)色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I、缺失N末端23個(gè)氨基酸的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(A23hKGF)的重組表達(dá)根據(jù)A 23hKGF氨基酸序列(SEQ ID No 1),設(shè)計(jì)大腸桿菌偏愛密碼子的對(duì)應(yīng)cDNA序列并包含5’端和3’分別設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I位點(diǎn)(SEQ ID No:2)。委托寶生物工程(大連)有限公司全基因人工合成，并嵌入PUC18載體且命名為pUC18-A23hKGF/DH5a。質(zhì)粒pUC18_A23hKGF DH5 a和表達(dá)載體質(zhì)粒pET_3c用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I雙酶切，經(jīng)I %瓊脂糖電泳，分別回收pET_3c酶切后約4638bp的片段和回收PUC18- A 23hKGF/DH5 a酶切后約450bp的片段，將兩個(gè)片段用T4連接酶進(jìn)行連接成質(zhì)粒pET-3c- A 23hKGF,再將質(zhì)粒pET_3c_ A 23hKGF轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) plysS宿主菌中，篩選正確高表達(dá)的工程菌命名pET-3c-A23hKGF/BL21(DE3)plysS。用于表達(dá)的載體和宿主菌菌購于Novagen公司，Nde I和BamH I酶購于寶生物工程(大連)有限公司。將上述表達(dá)最佳工程菌株劃線接種于LA瓊脂平板(胰蛋白胨2g，酵母提取物lg，NaC12g，瓊脂3g，加水定溶至200mL，12rC，高壓滅菌30min，當(dāng)溫度降到50°C左右時(shí)加入Amp至終濃度為100ug/mL，取適量倒培養(yǎng)皿，凝固后即成LA瓊脂平板)，37°C培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的LA平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg,加水定溶至lOOOmL，121°C，高壓滅菌30min即可)試管中，37°C培養(yǎng)12小時(shí)，然后按1%的比例轉(zhuǎn)接到含200mL LB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，37°C培養(yǎng)過夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按5%的比例接種于含20L M9培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整個(gè)發(fā) 酵過程中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣量、純氧量來保持溶氧在30%以上,用28%的氨水調(diào)節(jié)pH并保持在7. O。至菌液0D600 = 10 14時(shí)，加入終濃度為0. lmmol/L的IPTG，28°C繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后停止發(fā)酵(圖1A)，收集菌液，8000rpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)例2、A 23hKGF和r_ A 23hKGF的純化制備從_20°C冰箱中取出菌體，按I : 15w/v放入細(xì)菌裂解液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/LEDTA, 10 u g/mlDNase, 2mmol/L MgCl2, pH 8. 5-9. 0)中，37°C下攪拌待破菌液不粘稠時(shí)加入終濃度0. IM的檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌0. 5h。調(diào)節(jié)pH為7. 5，IOOOOrpm離心，15min，收集上清。上清液上SP-Sepharose Fast Flow柱(平衡液50mmpb, pH7. 5),復(fù)平衡,用50-500mmNacl線性梯度洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，確定含主要目的蛋白的洗脫峰。SP洗脫的目的樣品上Heparin柱(平衡液20_ pb, pH7. 5),復(fù)平衡,用50_500_ Nacl線性梯度洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測(cè)，獲得純度大于95%的二硫鍵形成形式的A23hKGF。將純度大于95%的二硫鍵形成形式的A 23hKGF，調(diào)pH8. 0，加入終濃度為5mmol/L的DTT，室溫，作用2-3小時(shí)，再經(jīng)Superdex-75分離(100mm pb, pH6. 5)獲得純度大于95%的二硫鍵還原形式的r-A23hKGF(圖1B)。實(shí)例3、r- A 23hKGF 的 mPEG-MAL_20K 修飾及修飾后(PEG-20K- A 23KGF)的純化純度大于95%的r- A 23hKGF溶液用100mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH6. 5，稀釋樣品至2mg/mL，按r_ A 23hKGF與mPEG-MAL_20KD (直鏈型，購于北京健凱科技有限公司)質(zhì)量比為 I : 3 稱取 mPEG-MAL-20KD 加入 r_ A 23hKGF 溶液中，25°C，100r/min 攪拌反應(yīng) 2hr，用鹽酸調(diào)低PH終止反應(yīng)。修飾后的r- A 23hKGF (PEG-20K- A 23KGF)溶液透析過夜(透析液20mmNaAc, pH5. 0)，透析后的 PEG-20K-A 23KGF 溶液上 SP-S^harose Fast Flow 柱(平衡液20mmNaAc，pH5. 0)，復(fù)平衡，用50_500mm Nacl線性梯度洗脫，收集洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測(cè)，獲得純度大于95%的PEG-20K-A23KGF(圖2，圖3)。實(shí)例4 PEG-20K- A 23KGF修飾位點(diǎn)的分析確認(rèn)r-A23KGF中含有三個(gè)游離半胱氨酸(第17位、79位和83位)，mPEG-MAL有可能分別或同時(shí)對(duì)r-A 23KGF的三個(gè)游離半胱氨酸進(jìn)行修飾，而本發(fā)明僅對(duì)r_ A 23KGF中的第79位游離半胱氨酸進(jìn)行單獨(dú)修飾。為了證明PEG-20K- A 23KGF的修飾位點(diǎn)僅是r-A23KGF中的第79位游離半胱氨酸，通過選用專一性強(qiáng)的合適酶，裂解較少位點(diǎn)后對(duì)獲得的裂解肽段進(jìn)行分析和分離純化，最后對(duì)目的序列進(jìn)行氨基酸測(cè)序，確定修飾位點(diǎn)。通過對(duì)r-A 23KGF氨基酸序列的分析，選用專一性強(qiáng)的胰蛋白酶特異性酶解賴氨酸和精氨酸的C端肽鍵，對(duì)r- A 23KGF和PEG-20K- A 23KGF做質(zhì)量肽圖分析，再收集修飾后的目的肽段進(jìn)行氨基酸序列分析，從而確定修飾位點(diǎn)。r- A 23KGF肽圖的理論肽段見下表
權(quán)利要求
1.重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的半胱氨酸游離巰基的聚乙二醇化學(xué)修飾及其偶聯(lián)物。
2.權(quán)利要求I所述的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型，指天然含163個(gè)氨基酸組成的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型在氨基末端缺失23個(gè)氨基酸，氨基酸序列為SEQ ID No 1 ；同時(shí)包含在SEQ ID No :I序列的基礎(chǔ)上氨基末端增加或減少1-5個(gè)氨基酸的變異體；也包含在SEQ ID No :1序列的基礎(chǔ)上分別或同時(shí)將第17位和第83位半胱氨酸突變成其他氨基酸的變異體。
3.權(quán)利要求I所述的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的半胱氨酸的游離巰基，指位于氨基酸序列SEQ ID No :I中的第79位氨基酸。
4.權(quán)利要求I所述的聚乙二醇，其特征在于，聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Maleimide, mPEG-MAL)活化分子，或?yàn)閱渭籽趸垡叶监彾蜈啾揉?Monomethoxy Polyethylene glycol Ortho-pyr idyl disulfide,mPEG-OPSS)活化分子，或?yàn)閱渭籽趸垡叶家蚁┗?Monomethoxy Polyethyleneglycol Vinylsufone, mPEG-VS)活化分子，或單甲氧基聚乙二醇疏基(MonomethoxyPolyethylene glycol sulfhydryl, mPEG-SH)活化分子,或?yàn)閱渭籽趸垡叶嫉獯阴０?Monomethoxy Polyethylene glycol Iodo acetamide,mPEG-IA)活化分子，優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇馬來酰亞胺活化分子。
5.權(quán)利要求1、4任一項(xiàng)所述聚乙二醇分子，其特征在于聚乙二醇分子可為直鏈型或分枝型或星型；
6.權(quán)利要求1、4、5任一項(xiàng)所述聚乙二醇分子，其特征在于聚乙二醇分子分子量為5，000-40, 000道爾頓，其中優(yōu)選20，000道爾頓的直鏈型聚乙二醇分子和40，000道爾頓的分枝型聚乙二醇分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物可作為一種預(yù)防和治療性藥物，其特征在于，所述藥物為治療有效劑量的聚乙二醇化重組重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的蛋白。
8.權(quán)利要求7所述作為預(yù)防和治療藥物的偶聯(lián)物，可用于預(yù)防和治療放化療引起的消化道粘膜損傷、急性化學(xué)性肝損傷或潰瘍性黏膜炎的臨床治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型的聚乙二醇化學(xué)修飾而成的偶聯(lián)物。其特征是以分子量為5K-40K經(jīng)活化的聚乙二醇分子與N末端缺失23位氨基酸的重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型(Δ23KGF-I)的第79位半胱氨酸的游離巰基共價(jià)化學(xué)偶聯(lián)，再經(jīng)柱層析分離純化制備而獲得聚乙二醇化重組缺失型人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I型。該偶聯(lián)物在保留人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生物學(xué)作用下，改變了其體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)特性，對(duì)放化療引起的消化道粘膜損傷或潰瘍性黏膜炎，急性化學(xué)性肝損傷有預(yù)防和治療價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/50GK102633874SQ20111003729
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者馮一建, 張?jiān)鰸? 張益 , 胡春蘭, 范開, 陳勇, 陳海容 申請(qǐng)人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司