專利名稱:阜薯24脫毒苗快繁技術(shù)和培養(yǎng)基組成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)與脫毒快繁技術(shù),確切的說是用甘薯的莖尖分生 組織進行脫毒,莖段無性組織培養(yǎng)進行快速繁殖,以及組織培養(yǎng)所用的營養(yǎng)物質(zhì)一培養(yǎng)基 組成。
背景技術(shù):
甘薯是一種雜糧作物,既可當(dāng)糧食又可當(dāng)蔬菜食用。阜陽市甘薯常年種植面積300 萬畝以上,利用甘薯加工成的粉絲、薯片已經(jīng)成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的有效途徑。在當(dāng)?shù)卦?培歷史悠久,淮河兩岸自古就有“紅芋面,紅芋饃,離開紅芋不能活”的農(nóng)謗。紅芋就是甘薯。 在阜陽市甘薯病毒病害發(fā)生特別嚴(yán)重,2000年我們在全市進行病毒普查,發(fā)現(xiàn)89%田塊存 在病毒感染癥狀,國際馬鈴薯中心(CIP)鑒定的6種病毒均有。連年種植區(qū)品種嚴(yán)重退化, 產(chǎn)量減產(chǎn)嚴(yán)重。甘薯病毒造成的損失已導(dǎo)致甘薯產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟損失近3億元。只有采用莖尖脫 病毒培養(yǎng),才能生產(chǎn)出無毒種苗供應(yīng)大田生產(chǎn)。植物脫毒和快速繁育技術(shù)已經(jīng)在多種作物上大量使用。植物不同其培養(yǎng)方式不 同,甚至不同品種由于其基因型差異,培養(yǎng)方式和結(jié)果也迥異,因此對于不同的作物品種, 在培養(yǎng)時,只有找到最佳的培養(yǎng)方式,方能夠事半功倍,降低生產(chǎn)成本。甘薯脫毒在90年代 陸續(xù)開展脫毒種苗繁育工作,已經(jīng)取得了較好的成績。但是隨著生產(chǎn)的進步,市場急需高 產(chǎn)、抗病、高淀粉的甘薯新品種進行更新?lián)Q代。甘薯較易感染病毒,一般甘薯原種種植三代 后必須更換,因此對于優(yōu)良品種必須進行脫毒培養(yǎng),方能保證市場獲得優(yōu)質(zhì)種苗。阜薯M 是阜陽市農(nóng)科院新近培育的高抗、高產(chǎn)、高淀粉的新品種,深受農(nóng)民歡迎。但是市場上至今 未有脫毒苗,限制了生產(chǎn)發(fā)展。因此迫切需要找到阜薯M的脫毒培養(yǎng)方法和最佳培養(yǎng)基組 成。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘薯的莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒與快速繁育種苗的技術(shù), 以及用于甘薯脫毒繁育的最佳培養(yǎng)基物質(zhì),通過試管克隆繁殖可以不受季節(jié)和時間場地限 制,可以快速,高效的繁殖??梢员WC品種的純度和基因型不變。1甘薯阜薯M的脫毒繁育技術(shù),其具體步驟是 (1)甘薯的莖尖分生組織培養(yǎng)
從正在生長的植株中,選取生長健壯,無病蟲,具有本品種特征特性的植株,剪取帶有 莖尖的莖蔓,去掉葉片,剪成5cm長一段。在流水中將莖段沖洗干凈,放入一玻璃瓶中,加入 水和洗衣粉少許,用手捂住上口進行震蕩搖晃洗滌10-15秒。再用蒸餾水沖洗干凈,放在準(zhǔn) 備好的高壓滅過菌的容器內(nèi)。在無菌室超凈工作臺上,用質(zhì)量百分比為0. 1%的升汞消毒 IOmin,無菌水沖洗6遍,在解剖鏡下,利用解剖針剝離莖尖,所剝莖尖為0. 2mm,帶1_2個葉 原基,快速接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基,不加瓊脂,做成液體培養(yǎng)基,在培養(yǎng)瓶中加入用脫脂棉花做成的濾紙條。莖尖接種在濾紙條上,每瓶接種4個莖 尖。然后在25°C下,光照強度為2000Lx,光照時數(shù)為14h下培養(yǎng),25天后轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基 中培養(yǎng),待苗長到8cm高時進行病毒檢測。 (2)試管苗直接嫁接法檢測病毒
在防蟲條件下盆栽巴西牽牛,采用15x15的塑料花盆播種牽牛,每盆3株。將成苗的 試管苗分品系和編號直接嫁接在巴西牽牛上,每株牽牛嫁接一株試管苗。試管苗至1-2片 真葉時嫁接。以待測樣品的莖蔓為接穗,巴西牽牛為砧木,在巴西牽牛的莖部(子葉以 下)斜切。將待檢樣品莖蔓切成3-5段,每段帶有至少一個腋芽,去葉后將底端削成楔型, 插入砧木的切口內(nèi),用封口膜扎緊,置防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮蔭保濕2-3天。嫁接好后采用 上蓋塑料小弓棚保濕,6-7天后成活,接去塑料膜,在25°C _27°C下常規(guī)管理。發(fā)現(xiàn)有癥狀的 去除。直到20天后即可斷定所獲得試管苗是否脫除病毒。淘汰感染株,剩下無毒株進行試 管快速繁育。每個樣品重復(fù)3次。同時設(shè)陽性對照、陰性對照。嫁接10-15天后觀察記載 癥狀。根據(jù)指示植物癥狀,確定病毒有無及種類。在所有嫁接的指示植物中只要有一株表 現(xiàn)典型癥狀,該樣品即為陽性。采用此法可以脫除甘薯六種常見病毒,甘薯羽狀斑駁病毒 (SPFMV)、甘薯輕斑駁病毒(SPMMV)、甘薯潛隱病毒(SPLV)、甘薯脈花葉病毒(SPVMV)、C-6、 C-8。(3)試管苗快速繁殖
切段繁殖時的莖節(jié)以1節(jié)即可,即一葉一芽.上端要與芽平,下端留l-2cm長度, 斜插或者平放于培養(yǎng)基表面即可,3-4天生根,5-7天根系發(fā)育完全,8-10天莖葉生長達(dá) 到高峰,15天即可剪切下一代,16-18天苗齡的小苗可以出瓶交貨.在繁殖中光照要求一 般,1000-20001X均可生長良好。培養(yǎng)溫度以高溫為好,溫度可以提高到觀_301以促進生 根,后期可以降低培養(yǎng)溫度到M_25°C。(4)煉苗移栽
煉苗前要進行低溫鍛煉,從中溫溫室移到低溫溫室,鍛煉一周,再洗苗栽苗,洗干凈 根部瓊脂,栽入蛭石基質(zhì)中,澆透水,上覆蓋塑料薄膜保濕3-4天,在25°C下7天生根,然后 撤去薄膜,常規(guī)管理,加強光照,一般15天即可移入溫室生產(chǎn)核心原原種,如果4-6月煉苗 可以在室內(nèi)用育苗盤煉苗,保持通風(fēng)和溫度在20-30°C之間,經(jīng)常葉面噴水,一周后即可成 活移入溫室,煉苗成活率在95%以上。煉苗馴化采用ABT3號生根粉20-30ppm灌根促使根 系活化,生根快,煉苗成活率達(dá)到95%以上。(5)種質(zhì)資源保存
在10-14°C低溫下保存試管苗,可有效延緩保存時間,一般保存半年,加入延緩劑 CCC,B9等保存時間可以延長到8個月。只要有低溫冰箱即可進行種質(zhì)資源的保存,保存時 待生根后即可將試管苗連同試管捆扎好放入冰箱中保存,每半年要繁殖恢復(fù)生長一次,以 恢復(fù)活力和生長勢。2根據(jù)權(quán)利1所述的甘薯阜薯M的脫毒繁育技術(shù),其脫毒繁育所用的培養(yǎng)基由基 本培養(yǎng)基MS和激素食用糖、瓊脂等物質(zhì)組成,具體如下
(1)莖尖分生組織培養(yǎng)培養(yǎng)基
MS+6-BA1. Omg/l+NAAO. 05mg/l+GA0. lmg/1+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g 以上表達(dá)式所表示的意思是在每升培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.0mg、a -萘乙酸(NAA)0.05mg、赤霉素(GA3)0. lmg、瓊脂6. 5g、白糖30g。本發(fā)明所列表達(dá)式均 按此解釋。(2)成苗培養(yǎng)基
1/2MS+瓊脂6. 5g+市售白糖30g,培養(yǎng)基用自來水配制。MS微量元素和有機物省略, 同時無機鹽離子適當(dāng)變化,提高鉀鹽的濃度水平,降低鈣鎂離子的用量。在每升培養(yǎng)基中 加入1 2 m g硫酸鉀,將M S原氯化鈣濃度由原來的4 4 O m g降到4 O O m g,硫酸鎂 由原來的3 7 O降到3 4 O m g。(3)試管苗快速繁殖培養(yǎng)基
M S + I B A O . Olmg /1+GA30. 01mg/l,吲哚丁酸(IBA)
培養(yǎng)基用自來水配制。MS微量元素和有機物省略,同時無機鹽離子適當(dāng)變化,提高鉀 鹽的濃度水平,降低鈣鎂離子的用量。在每升培養(yǎng)基中加入1 5 m g硫酸鉀,將M S原氯化 鈣濃度由原來的4 4 O m g降到4 O Omg,硫酸鎂由原來的3 7 O降到3 2 O m g。(3)壯苗和種質(zhì)資源保存培養(yǎng)基
MS+IBAO. 01mg/l+CCC50PPM+瓊脂6. 5g+白糖30g(壯苗培養(yǎng)基,PPM為百萬分之一, 即 lPPM=lmg/l);
MS+CCC60PPM+瓊脂6. 5g+白糖30g (保存培養(yǎng)基) 本發(fā)明的積極效果是
1利用阜薯對的莖尖脫毒,莖段快繁,解決了病毒導(dǎo)致的種性退化問題。提高了產(chǎn)量 和品質(zhì)。增產(chǎn)30%以上,并且薯塊較易貯藏,口感好。2采用小試管棉花濾紙條培養(yǎng),每管接種3-4個莖尖,節(jié)約培養(yǎng)空間。莖尖培養(yǎng)采 用優(yōu)化配方培養(yǎng),速度快,愈傷組織少。配方中加入GA3促進莖尖成苗,成苗率高達(dá)到98%。 采用食用白糖代替蔗糖,自來水直接用于培養(yǎng)基制作.淺層培養(yǎng),增加接種密度,提高單 位面積的利用效率。采取一葉一芽莖段切繁,繁殖系數(shù)提高到5倍,繁殖母株反復(fù)利用, 增加剪切次數(shù).提高培養(yǎng)溫度到30°C,促使其快速生根,出苗前期培養(yǎng)溫度在^-30°C, 生根后4-5天轉(zhuǎn)移到低溫培養(yǎng)室控制生長,達(dá)到壯苗的目的。3直接用試管苗嫁接在巴西牽牛上,檢測病毒獲得成功。嫁接成活率90%,省略煉 苗階段,省時,省力,省工。4 CCC的加入使甘薯的苗子莖節(jié)縮短,長勢好,苗壯,葉色深綠,莖稈增加l_2mm 粗度。IBA主要是使根系發(fā)達(dá),較不加任何激素時的根系發(fā)達(dá)粗壯,根多根長。采用甘薯 脫毒苗三級育苗體系和無病毒甘薯種苗的繁殖更新,有效的防止了品種退化,確保了種苗 純度。
權(quán)利要求
1.阜薯M脫毒苗快繁技術(shù)和培養(yǎng)基組成從正在生長的植株中,選取生長健壯,無病蟲,具有本品種特征特性的植株,剪取帶有 莖尖的莖蔓,去掉葉片,剪成5cm長一段。
2.在流水中將莖段沖洗干凈,放入一玻璃瓶中,加入水和洗衣粉少許,用手捂住上口進 行震蕩搖晃洗滌5-10秒。
3.再用蒸餾水沖洗干凈,放在準(zhǔn)備好的滅過菌的容器內(nèi)。
4.在無菌室超凈工作臺上,用質(zhì)量百分比為0.1%的升汞消毒lOmin,無菌水沖洗6遍, 在解剖鏡下,利用解剖針剝離莖尖,所剝莖尖為0. 2mm,帶1-2個葉原基,快速接種到誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中,誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基,不加瓊脂,做成液體培養(yǎng)基,在培養(yǎng)瓶中加入用 脫脂棉花做成的濾紙條。
5.莖尖接種在濾紙條上,每瓶接種4個莖尖。
6.然后在25°C下,光照強度為2000Lx,光照時數(shù)為14h下培養(yǎng),25天后轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng) 基中培養(yǎng),待苗長到8cm高時進行病毒檢測。
7.在防蟲條件下盆栽巴西牽牛,采用15x15的塑料花盆播種牽牛,每盆3株。
8.將成苗的試管苗分品系和編號直接嫁接在巴西牽牛上,每株牽牛嫁接一株試管苗。
9.試管苗至1-2片真葉時嫁接。
10.以待測樣品的莖蔓為接穗,巴西牽牛為砧木,在巴西牽牛的莖部(子葉以下)斜切。
11.將待檢樣品莖蔓切成3-5段,每段帶有至少一個腋芽,去葉后將底端削成楔型,插 入砧木的切口內(nèi),用封口膜扎緊,置26-32°C防蟲網(wǎng)室內(nèi)遮蔭保濕2-3天。
12.嫁接好后采用上蓋塑料小拱棚保濕,6-7天后成活,接去塑料膜,在25°C-27°C下常 規(guī)管理。
13.發(fā)現(xiàn)有癥狀的去除。
14.直到20天后即可斷定所獲得試管苗是否脫除病毒。
15.淘汰感染株,剩下無毒株進行試管快速繁育。
16.每個樣品重復(fù)3-5次。
17.同時設(shè)陽性對照、陰性對照。
18.嫁接10-15天后觀察記載癥狀。
19.根據(jù)指示植物癥狀,確定病毒有無及種類。
20.在所有嫁接的指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀,該樣品即為陽性。
21.采用此法可以脫除甘薯六種常見病毒,甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯輕斑駁 病毒(SPMMV)、甘薯潛隱病毒(SPLV)、甘薯脈花葉病毒(SPVMV)、C-6、C-8。
22.切段繁殖時的莖節(jié)以1節(jié)即可,即一葉一芽.上端要與芽平,下端留l-2cm長度, 斜插或者平放于培養(yǎng)基表面即可,3-4天生根,5-7天根系發(fā)育完全,8-10天莖葉生長達(dá) 到高峰,15天即可剪切下一代,16-18天苗齡的小苗可以出瓶交貨.在繁殖中光照要求一 般,1000-20001x均可生長良好。
23.培養(yǎng)溫度以高溫為好,溫度可以提高到觀_301以促進生根,后期可以降低培養(yǎng)溫 度到 M-25°C。
24.煉苗前要進行低溫鍛煉,從中溫溫室移到低溫溫室,鍛煉一周,再洗苗栽苗,洗干凈根部瓊脂,栽入蛭石基質(zhì)中,澆透水,上覆蓋塑料薄膜保濕3-4天,在25°C下7天生根, 然后撤去薄膜,常規(guī)管理,加強光照,一般15天即可移入溫室生產(chǎn)核心原原種,如果4-6月 煉苗可以在室內(nèi)用育苗盤煉苗,保持通風(fēng)和溫度在20-30°C之間,經(jīng)常葉面噴水,一周后即 可成活移入溫室,煉苗成活率在95%以上。
25.煉苗馴化采用ABT3號生根粉20-30ppm灌根促使根系活化,生根快,煉苗成活率達(dá) 到95%以上。
26.在10-14°C低溫下保存試管苗,可有效延緩保存時間,一般保存半年,加入延緩劑 CCC, B9等保存時間可以延長到8個月。
27.只要有低溫冰箱即可進行種質(zhì)資源的保存,保存時待生根后即可將試管苗連同試 管捆扎好放入冰箱中保存,每半年要繁殖恢復(fù)生長一次,以恢復(fù)活力和生長勢。
28.根據(jù)權(quán)利1所述的甘薯阜薯M的脫毒繁育技術(shù),其脫毒繁育所用的培養(yǎng)基由基本 培養(yǎng)基MS和激素食用糖、瓊脂等物質(zhì)組成,具體如下莖尖分生組織培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-BA1. Omg/l+NAAO. 05mg/l+GA0. lmg/1+ 瓊脂 6. 5g+ 市售白糖 30g以上表達(dá)式所表示的意思是在每升培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.0mg、 a -萘乙酸(NAA) 0. 05mg、赤霉素(GA3) 0. lmg、瓊脂 6. 5g、白糖 30g。
29.成苗培養(yǎng)基1/2MS+瓊脂6. 5g+市售白糖30g,培養(yǎng)基用自來水配制。
30.MS微量元素省略,同時無機鹽離子適當(dāng)變化,提高鉀鹽的濃度水平,降低鈣鎂離子 的用量。
31.在每升培養(yǎng)基中加入12 m g硫酸鉀,將M S原氯化鈣濃度由原來的4 4 O m g 降到4 O O m g,硫酸鎂由原來的3 7 O降到3 4 O m g。
32.( 3 )試管苗快速繁殖培養(yǎng)基MS + IBA0.0 1mg /1+GA30. Olmg/1,吲哚丁酸(IBA)培養(yǎng)基用自來水配制。
33.MS微量元素省略,同時無機鹽離子適當(dāng)變化,提高鉀鹽的濃度水平,降低鈣鎂離子 的用量。
34.在每升培養(yǎng)基中加入15 m g硫酸鉀,將M S原氯化鈣濃度由原來的4 4 O m g 降到4 O O m g,硫酸鎂由原來的3 7 O降到3 2 O m g。
35.壯苗和種質(zhì)資源保存培養(yǎng)基MS+IBAO. 01mg/l+CCC50PPM+瓊脂6. 5g+白糖30g(壯苗培養(yǎng)基,PPM為百萬分之一, 即 lPPM=lmg/l);MS+CCC60PPM+瓊脂6. 5g+白糖30g (保存培養(yǎng)基)。
全文摘要
阜薯24的脫毒苗快繁技術(shù)和培養(yǎng)基組成,是從正在生長的植株中,選擇生長健壯,無病蟲,具有本品種特征特性的植株,利用解剖針剝離0.2mm莖尖,接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中;通過病毒檢測后,將脫毒無菌苗剪成帶有一葉一芽的莖段轉(zhuǎn)接到快繁培養(yǎng)基中。本發(fā)明采用棉花濾紙條培養(yǎng)莖尖,病毒檢測采用直接試管苗嫁接法,采用高溫培養(yǎng)和加入適當(dāng)激素,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組成,極大的降低生產(chǎn)成本,縮短了生產(chǎn)周期。解決了用常規(guī)繁殖種性退化的難題;可人為的控制培養(yǎng)生長條件,不受自然條件的影響,取材量小,培養(yǎng)材料經(jīng)濟,生長周期短,繁殖系數(shù)大,管理方便,利于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK102138531SQ20111010416
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者馬宗新 申請人:馬宗新