專利名稱：發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生根誘導(dǎo)體系的建立方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及是發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生根誘導(dǎo)體系的建立方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
發(fā)根農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，會引起植物的發(fā)狀根(Moore L. ,Warren G.， and Strobel G. Involvement of a plasmid in the hairy root disease of plants caused by Agrobacterium rhizogenes. Plasmid, 1979，2 :617-26.)，并合成冠瘦減。發(fā)根農(nóng)桿菌中的大質(zhì)粒決定了感染植物合成的冠癭堿的種類，根據(jù)分泌冠癭堿的不同，將發(fā)根農(nóng)桿菌分為黃瓜堿、異黃瓜堿、甘露堿和農(nóng)桿堿型4種。發(fā)根農(nóng)桿菌中rol基因整合到植物基因組后表達(dá)，使侵染的組織分化出大量的根。發(fā)根農(nóng)桿菌因侵染效率高、宿主廣泛， 目前成功的誘導(dǎo)100多種植物產(chǎn)生發(fā)狀根(Georgiev M.，Pavlov Α.，and Bley Τ. . Hairy root type plant in vitro systems as sources of bioactive substances. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74 :1175-1185.)。發(fā)根農(nóng)桿菌功能基因及發(fā)狀根誘導(dǎo)機(jī)制的研究，加速了發(fā)根農(nóng)桿菌在積累化合物等方面的應(yīng)用，主要是在藥用植物中生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物，其次研究根瘤形成機(jī)制及相關(guān)基因功能和植物的遺傳轉(zhuǎn)化。發(fā)根農(nóng)桿菌在花生上的應(yīng)用，主要是侵染野生的發(fā)根農(nóng)桿菌，在誘導(dǎo)的根系中提取花生根中的白黎蘆醇，并沒有通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化外源基因的報(bào)道。建立發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的根誘導(dǎo)體系，對體系進(jìn)行優(yōu)化，獲得的嵌合植株為外源基因在花生根中的功能驗(yàn)證提供實(shí)驗(yàn)材料。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明提供一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生根誘導(dǎo)體系的建立方法，成功的獲得了嵌合植侏，為外源基因在花生根中的快速的功能驗(yàn)證提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本發(fā)明還通過煙草基因的成功轉(zhuǎn)入，表明本發(fā)明建立的誘導(dǎo)體系可以成為轉(zhuǎn)基因成功與否的快速驗(yàn)證體系。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生根誘導(dǎo)體系的建立方法，包括如下步驟(1)活化菌種，將發(fā)根農(nóng)桿菌在含有有鏈霉素、利福平的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長出單菌落，挑取單菌落在含有鏈霉素、利福平的LB液體培養(yǎng)基中220rpm，3(TC培養(yǎng)至 OD600 = 0. 2-0. 8，(2)微量注射，取發(fā)根農(nóng)桿菌對花生外植體上胚軸微量注射，接種量為 1 X 107-5X 107 ；(3)接菌的外植體放置到共培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3天；(4)轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6-25天。所述共培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述共培養(yǎng)基中的乙酰丁香酮的含量為5 μ mol F1-IOOmol Γ1。
所述繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。優(yōu)選取指數(shù)期的發(fā)根農(nóng)桿菌，接種量為每個(gè)外植體5X IO7個(gè)細(xì)胞，共培養(yǎng)2天， 共培養(yǎng)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的濃度為50 μ mol Γ1。所述微量注射為采用微量注射器，在上胚軸上分三點(diǎn)注射。所述花生外植體為完整胚的子葉放置在基本培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)5天左右后的小苗，切去下胚軸得到。所述完整胚的子葉在培養(yǎng)前需要做無菌處理。所述無菌處理的方法為將花生去殼，75%乙醇中放置lmin，棄乙醇，0. 升汞中放置4min，無菌水洗3次，放置無菌紙上至晾干。上述方法的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)根農(nóng)桿菌中含有外源基因載體。所述外源基因載體中的基因?yàn)閏ry8Eal或/和cry8Hal。所述外源基因載體中基因的上游添加了 Ω序列、Kozak序列，下游添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號，其核苷酸序列如SEQ ID Ν03或SEQ ID Ν04所示；骨架載體為插入了兩個(gè)MAR序列的基礎(chǔ)載體PCAMBIA2300，其結(jié)構(gòu)如圖10所示；cry8Eal或cry8Hal基因由組成型啟動子 35S驅(qū)動。本發(fā)明采用發(fā)根農(nóng)桿菌并利用微量注射方法誘導(dǎo)花生根系，得到了嵌合植株，同時(shí)對該體系的方法，進(jìn)行了優(yōu)化，以上胚軸為外植體微量注射方式侵染花生的方法，最大的轉(zhuǎn)化效率為61%，同時(shí)驗(yàn)證了經(jīng)密碼子優(yōu)化的cry8Eal (SEQ ID N01，公開見專利號 200410009808)和cry8Hal (SEQ ID N02，公開見專利號200710120020)基因?qū)Π岛邛w金龜幼蟲的生物活性。本發(fā)明成功建立了花生根誘導(dǎo)體系，為外源基因?qū)С龌ㄉ仓?，提供了快速?yàn)證方法，為進(jìn)一步得到轉(zhuǎn)基因花生植株提供了技術(shù)支持。


圖1花生發(fā)狀根的誘導(dǎo)A 花生播種5天B:上胚軸不同的點(diǎn)注射發(fā)根農(nóng)桿菌C:瘤狀物D 產(chǎn)生發(fā)狀根 E 誘導(dǎo)的根系圖2花生誘導(dǎo)根的RT-PCR鑒定圖3花生組織⑶S染色鑒定A和B:上胚，C和D 上胚軸，E和F:根A、C 和 E 注射發(fā)根農(nóng)桿菌 K599 (pGFPGUSplus)B、D和F 未接種發(fā)根農(nóng)桿菌圖4花生誘導(dǎo)根的Southern雜交A 載體 pGFPGUSplus B 誘導(dǎo)根 Southern 雜交N 接種發(fā)根農(nóng)桿菌(空菌)的誘導(dǎo)根GFP :pGFPGUSplus/EcoR I+Nco IP1/P2 接種發(fā)根農(nóng)桿菌(pGFP⑶Splus)的誘導(dǎo)根圖5發(fā)根農(nóng)桿菌K599生長曲線 圖6發(fā)根農(nóng)桿菌活力對根誘導(dǎo)能力的影響圖7不同共培養(yǎng)時(shí)間RT-PCR檢測
M :DM2000 K 發(fā)根農(nóng)桿菌K599 (pGFPGUSplus) N 非轉(zhuǎn)基因花生根圖8不同共培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)根⑶S染色鑒定圖9乙酰丁香酮濃度對誘導(dǎo)根的影響圖10基礎(chǔ)載體pDMAR構(gòu)建流程 11煙草MAR序列及中間載體pRMAR的PCR及酶切鑒定1 :DM2000, 2 =Negative control, 3 MAR (primer :TMARF/R) ,4 =Negative control (ddH20)，5 :MAR+ (primer MCF/TMARR)，6 :pRMAR/Nco 1,7 λ DNA/Sty I圖12重疊PCR產(chǎn)物分析結(jié)果1 :DM2000，2、4、6 =Negative control (ddH20), 3 =EcoRVF fragment amplified by primer EcoR VF and Pme I R, 5 :EcoR VR fragment amplified by primer Pme I F and EcoRVR,7 =EPme I fragment，8 : λDNA/Sty I，圖13中間載體pEPme I-RMAR的PCR及酶切鑒定1:DM2000 2 =Negative control(ddH20) 3 :pEPme I-RMAR(primerEcoR VF/ TMARR) 4 pEPme I/Pme I 5 :MAR fragment(primer TMARF/R) 6 pEPme I-RMAR/Nco I 7 λ DNA/Sty I圖14植物表達(dá)載體pDMAR的PCR及酶切鑒定1 :DM2000,2 =Negative control (ddH20), 3 pDMAR (primer EcoRVF/TMARR), 4 pEPme I-RMAR/EcoRV, 5 :pLMAR/EcoRV, 6 :pDMAR/EcoRV, 7 : λDNA/Sty I圖15cry8類基因兩側(cè)Ω序列、Kozak序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號的檢測1 :DM2000 ；2, 4 Negative control (ddH20) ；3 :cry8Eal fragment ；5 :cry8Gal fragment圖16植物表達(dá)載體pDMARN的酶切分析1 λ DNA/Sty I，2 :T_Nos (EcoR I+Sac I)，3 :pDMAR (EcoR I+Sac I) ,4 pDMARN (EcoR I+Sac I)，5:DM2000圖17植物表達(dá)載體pDMARSN的酶切分析1 :DM2000,2 :pG2AB4(Hind III+BamH 1)3 :pDMARN(Hind III+BamH I) ,4 pDMARSN(Hind III+BamH I), 5 λ DNA/Sty I圖18植物表達(dá)載體pSN8E、pSN8H結(jié)構(gòu)示意19植物表達(dá)載體pSN8E的PCR及酶切分析1 :DM2000, 2 =Negative control (ddH20)，3 :pSN8E (rt8eF2/rt8eR2)，4 pSN8E(BamH I+Sac I)，5 :T_8E(BamH I+Sac I) ,6 pDMARSN(BamH I+Sac I) 7 λ DNA/Sty I圖20植物表達(dá)載體pSN8H的PCR及酶切分析1 :DM2000，2 =Negative control (ddH20)，3 :pSN8H (jc8HF/jc8HR)，4 :T_8H(BamH I) ,5 pDMARSN(BamH I+Kpn I)圖21轉(zhuǎn)pSN8E和pSN8H載體誘導(dǎo)根RT-PCR鑒定M :DM2000 P 發(fā)根農(nóng)桿菌(含有載體pSN8E或pSN8H) N 非轉(zhuǎn)化根
圖22花生根系暗黑鰓金龜生物活性測定情況A 含有crySEal基因根系的嵌合植株B 非轉(zhuǎn)基因植株C 存活暗黑鰓金龜幼蟲圖23嵌合植株暗受黑鰓金龜幼蟲危害情況圖24轉(zhuǎn)cry8Eal、cry8Hal基因嵌合植株危害統(tǒng)計(jì)結(jié)果
SE:含有cry8Eal基因根系的嵌合植株SH 含有cry8Hal基因根系的嵌合植株 CK 未注射花生CKA 注射發(fā)根農(nóng)桿菌花生(無載體)
具體實(shí)施例方式LB固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，乙酰丁香酮的含量為5 μ mol F1-IOOmol Γ1。繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基可以是市售，也可以自行配制載體pGFP⑶Splus，發(fā)根農(nóng)桿菌K599，保存在本申請人的實(shí)驗(yàn)室，可以對外界免費(fèi)發(fā)放。pCAMBIA2300，市售?；ㄉ鸀槭惺鄣娜我黄贩N。1.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的微量注射方式侵染花生1)將花生去殼，75%乙醇中放置lmin，棄乙醇，0. 1 %升汞中放置4min，無菌水洗3 次，放置無菌紙上至晾干；2)用無菌的手術(shù)刀，將花生兩個(gè)子葉分開，含有完整胚的子葉放置在基本培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)5天左右；3)活化菌種將保存的發(fā)根農(nóng)桿菌K599 (含有載體pGFP⑶Splus)在含有鏈霉素、 利福平、卡那霉素的抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)至長出單菌落；挑取單菌落至5mL含有有鏈霉素、利福平、卡那霉素的抗生素的LB液體培養(yǎng)基中， 220rpm，30°C 培養(yǎng)。4)花生小苗剪去下胚軸，用微量注射器取適量的發(fā)根農(nóng)桿菌，在上胚軸上分3點(diǎn)注射；5)接菌的外植體放置到共培養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)；6)轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25天左右?；ㄉN子表面消毒培養(yǎng)5天后(圖1A)，去掉下胚軸，用微量注射器分3點(diǎn)接種發(fā)根農(nóng)桿菌(圖1B)。一周后有瘤狀物的產(chǎn)生(圖1C)，兩周左右，有明顯的誘導(dǎo)根產(chǎn)生(圖 1D)，25天后產(chǎn)生足夠用于分子檢測、鑒定及生物活性測定的誘導(dǎo)根系(圖1E)。提取發(fā)狀根的總RNA，經(jīng)引物對actF/R和VirH/R檢測，無擴(kuò)增信號，排除了來自花生及發(fā)根農(nóng)桿菌K599基因組的污染。反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，RT-PCR的結(jié)果顯示，誘導(dǎo)根樣品擴(kuò)增得到600bp左右的條帶，為gfp基因的擴(kuò)增信號，而沒有VirH基因的擴(kuò)增信號(圖 2)，表明沒有來自發(fā)根農(nóng)桿菌的污染，外源gfp基因在花生誘導(dǎo)根中能正常的轉(zhuǎn)錄。注射發(fā)根農(nóng)桿菌(含有載體pGFPGUSplus)的花生上胚軸(圖3A、C)及誘導(dǎo)根(圖3E)經(jīng)GUS染色后，有藍(lán)點(diǎn)出現(xiàn)，而未注射發(fā)根農(nóng)桿菌的負(fù)對照(圖3B、D、F)沒有GUS藍(lán)點(diǎn)出現(xiàn)，表明外源的GUSplus基因在花生的上胚軸及誘導(dǎo)根中能表達(dá)有活性的蛋白。提取發(fā)狀根的基因組，將擴(kuò)增得到的600bp的gfp基因片段標(biāo)記，進(jìn)行Southern 雜交，誘導(dǎo)根樣品中的Pl和P2有雜交信號出現(xiàn)，證明外源gfp基因整合到花生誘導(dǎo)根的基因組中。以上的結(jié)果分別從DNA、RNA及蛋白水平證明，通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)引入誘導(dǎo)根的外源基因能整合到基因組中，并能正常轉(zhuǎn)錄，表達(dá)為有活性的蛋白，用該體系將目的基因轉(zhuǎn)入花生根系中是可行的。2.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化2. 1基因型對發(fā)根農(nóng)桿菌根誘導(dǎo)能力的影響

選取7種不同的花生品種分別接種了發(fā)根農(nóng)桿菌，平均的發(fā)根天數(shù)都在11天左右，除了花育28所需的發(fā)根時(shí)間稍長，平均發(fā)根數(shù)在6 9個(gè)，花育28和新花1號的發(fā)根數(shù)則只有4 6個(gè)(表1)。雖然在發(fā)根天數(shù)和發(fā)根數(shù)上存在差異，所有7個(gè)測試的花生品種接種發(fā)根農(nóng)桿菌后都能產(chǎn)生誘導(dǎo)根，初步說明發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳轉(zhuǎn)化是不受受基因型的限制的。表1發(fā)根農(nóng)桿菌對不同基因型花生根誘導(dǎo)能力的比較
權(quán)利要求
1.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生根誘導(dǎo)體系的建立方法，包括如下步驟(1)活化菌種，將發(fā)根農(nóng)桿菌在含有鏈霉素、利福平的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長出單菌落，挑取單菌落在含有鏈霉素、利福平的LB液體培養(yǎng)基中220rpm，3(TC培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 2-0. 8，(2)微量注射，取發(fā)根農(nóng)桿菌對花生外植體上胚軸微量注射，接種量為1X 107-5X 107;(3)接菌的外植體放置到含有乙酰丁香酮的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3天，乙酰丁香酮的含量為 5ymol F1-IOOymol Γ1 ；(4)轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6-25天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述共培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述取指數(shù)期的發(fā)根農(nóng)桿菌，接種量為每個(gè)外植體 5 X IO7個(gè)細(xì)胞，共培養(yǎng)2天，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的濃度為50 μ mol Γ1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述繼代培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述微量注射為采用微量注射器，分三點(diǎn)在上胚軸注射。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述花生外植體為完整胚的子葉放置在基本培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)5天左右后的小苗，切去下胚軸得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株為發(fā)根農(nóng)桿菌Κ599。
8.權(quán)利要求1-7任一所述的方法的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)根農(nóng)桿菌中含有外源基因載體，菌種活化時(shí)的培養(yǎng)基中還含有載體所帶的相應(yīng)抗生素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述外源基因載體中的基因?yàn)榻?jīng)密碼子優(yōu)化的 cry8Eal或cry8Hal，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1或SEQ ID N02所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述外源基因載體中基因的上游添加了Ω序列、 Kozak序列，下游添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號，其核苷酸序列如SEQ IDN03或SEQ IDN04所示； 骨架載體為插入了兩個(gè)MAR序列的基礎(chǔ)載體PCAMBIA2300，其結(jié)構(gòu)如圖10所示；cry8Eal或 cry8Hal基因由組成型啟動子35S驅(qū)動。
全文摘要
本發(fā)明涉及“發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生根誘導(dǎo)體系的建立方法及其應(yīng)用”屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用發(fā)根農(nóng)桿菌并利用微量注射方法誘導(dǎo)花生根系，得到了嵌合植株，同時(shí)對該體系的方法，進(jìn)行了優(yōu)化，以上胚軸為外植體微量注射方式侵染花生的方法，最大的轉(zhuǎn)化效率為61％，同時(shí)驗(yàn)證了經(jīng)密碼子優(yōu)化的cry8Ea1和cry8Ha1基因?qū)Π岛邛w金龜幼蟲的生物活性。本發(fā)明成功建立了花生根誘導(dǎo)體系，為外源基因?qū)С龌ㄉ仓?，提供了快速?yàn)證方法，為進(jìn)一步得到轉(zhuǎn)基因花生植株提供了技術(shù)支持。
文檔編號A01H5/06GK102260707SQ20111018011
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者宋福平, 張 杰, 束長龍, 耿麗麗, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所