一種新的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大白菜原位轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大白菜原位轉(zhuǎn)基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1、大白菜CSrawica 是十字花科蕓薹屬CSrawica)中最 重要的蔬菜作物之一，是我國(guó)栽培面積最大、分布最廣、人們普遍喜愛的蔬菜，被稱為"當(dāng)家 菜"。長(zhǎng)期以來，我國(guó)大白菜主要是通過雜交育種進(jìn)行品種改良。但傳統(tǒng)的雜交育種方法， 存在育種年限長(zhǎng)、成本高、親本自交多代生活力易退化等諸多弊端，隨著組織培養(yǎng)和DNA重 組技術(shù)的建立和不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為改良農(nóng)藝性狀，解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)難題的重要 手段。目前以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法主要有借助細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)的離體轉(zhuǎn)化和直接在植 株上進(jìn)行的原位滲入轉(zhuǎn)化，例如花粉管通道法、真空滲入法等。
[0003] 目前，大白菜遺傳轉(zhuǎn)化最常使用的方法仍是利用普通的組培方式進(jìn)行的農(nóng)桿菌介 導(dǎo)法，即將要轉(zhuǎn)化的植株的子葉等外植體作為轉(zhuǎn)化受體在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長(zhǎng)，然后浸入 攜帶外源基因的農(nóng)桿菌菌液中3~5min，在無菌濾紙上吸干菌液。首先，被浸染的外植體 在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定的時(shí)間，以確保外源基因充分整合到染色體上；其次，被浸染的外植 體轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng)基內(nèi)含有一定濃度的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素(有氨芐青霉 素、羧芐青霉素、利福平等）；最后，外植體被轉(zhuǎn)移至含有一定濃度選擇性抗生素的選擇培養(yǎng) 基，篩選抗性芽，誘導(dǎo)生根，再生植株，經(jīng)抗性分子鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株。近年來，大白菜轉(zhuǎn) 基因研究隨著其高頻植株再生體系的建立和不斷完善取得了顯著進(jìn)展。例如朱常香等、楊 廣東等、王關(guān)林等、王洋等、張艷萍等、楊廣東等分別將抗蕪菁花葉病毒基因、修飾豇豆胰蛋 白酶抑制劑基因、抗菌肽基因、白細(xì)胞介素一 2基因、硝酸還原酶基因、雪花蓮凝集素基因 GNA等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)人大白菜基因組，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。
[0004] 據(jù)近幾年研究報(bào)道，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大白菜遺傳轉(zhuǎn)化所使用的受體主要是無菌苗 的子葉或下胚軸，都是體細(xì)胞組織，具有兩套染色體，外源基因同時(shí)插入同源染色體相同座 位的可能性極小，因而轉(zhuǎn)化植株常常是雜合的，后代會(huì)發(fā)生分離。曹鳴慶等以小孢子作為遺 傳轉(zhuǎn)化受體，得到了抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。因?yàn)樾℃咦油瑫r(shí)具備了單倍體和單細(xì)胞兩個(gè)特 性，轉(zhuǎn)化體經(jīng)加倍后即可成為純合的二倍體。
[0005] 但是，由于大白菜組織培養(yǎng)難度較大，再生體系較難建立，一定程度上制約了轉(zhuǎn)基 因技術(shù)在大白菜育種中的應(yīng)用，因此，尋求不依賴于組織培養(yǎng)途徑的轉(zhuǎn)化方法，是許多從事 基因工程研究的研究者非常關(guān)注的事情?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ且环N以生殖細(xì)胞作為外源DNA的 受體細(xì)胞，借助開花植物復(fù)雜的有性生殖過程，獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。其原理主要是授粉 后使外源DNA能沿花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合 子或早期胚胎細(xì)胞。據(jù)統(tǒng)計(jì)，外源DNA直接導(dǎo)入植物技術(shù)已相繼在近30種作物上獲得成功， 在水稻、小麥等經(jīng)濟(jì)作物上的應(yīng)用例子比較多，而在蔬菜育種上的應(yīng)用相對(duì)少一些，尤其對(duì) 一些蔬菜小品種報(bào)道不多。例如王雷等人通過花粉管通道法介導(dǎo)il-4基因轉(zhuǎn)化大白菜，"哈 白二號(hào)"大白菜在花期授粉后24h左右進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)1. 15%。
[0006] 原位滲入轉(zhuǎn)化法最早獲得成功是Feldmann和Marks利用農(nóng)桿菌侵染剛剛萌發(fā)的 種子，從其后代種子中篩選出了抗性株，并通過分子雜交進(jìn)行了驗(yàn)證。而真空滲入轉(zhuǎn)化法 作為原位滲入轉(zhuǎn)化的一種，它是由Bechtold等將植物病理學(xué)中用來輔助植物病毒進(jìn)入植 株的方法，應(yīng)用到了擬南芥植株的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化上，其轉(zhuǎn)化頻率較種子轉(zhuǎn)化提高了 3~4 倍。該方法避開了組織培養(yǎng)的過程，以生長(zhǎng)中的植株作為轉(zhuǎn)化受體，從后代種子中直接篩選 抗性株，為植物的轉(zhuǎn)基因工作開辟了新的途徑。但遺憾的是目前這種方法除在擬南芥中被 廣泛應(yīng)用外，其他植物中僅在不結(jié)球白菜、苜蓿中有成功轉(zhuǎn)化的報(bào)道。曹鳴慶等將不結(jié)球白 菜利用真空滲入法轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)基因白菜。劉凡等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲入轉(zhuǎn)化法將馬 鈴薯蛋白酶抑制劑基因/i)導(dǎo)人不結(jié)球白菜"49菜心"中，獲得抗蟲性材料。
[0007] 盡管大白菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得一些進(jìn)展，但由于離體轉(zhuǎn)化比較困難，大白菜農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的離體轉(zhuǎn)基因方法受到制約，花粉管通道法和真空滲入法僅在不結(jié)球白菜上試驗(yàn)成 功，在接球大白菜上未見報(bào)道，且這些方法也存在一些弊端，實(shí)踐上迫切需要發(fā)展一些更高 效、簡(jiǎn)易、快捷、重復(fù)性好的技術(shù)。
[0008] 本發(fā)明的植物原位轉(zhuǎn)基因方法（inplantatransformation)是一種更加簡(jiǎn)便、 快速、可靠，且無需經(jīng)過組織培養(yǎng)階段即可獲得大量轉(zhuǎn)化植株的新的基因轉(zhuǎn)化方法，其根本 特點(diǎn)就在于它不需要組織或細(xì)胞培養(yǎng)手段，也無需抽真空而達(dá)到植物在活體（invivo)而 非離體（vitro)狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化。目前，這種方法的應(yīng)用還僅局限于擬南芥，本方法為尋找蕓 薹屬作物乃至十字花科作物高效遺傳轉(zhuǎn)化的非組織培養(yǎng)方法提供借鑒，意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種新的大白菜原位轉(zhuǎn)基因途徑，不需要組織培養(yǎng)和復(fù)雜的 操作而直接獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0010] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的： (1)配制農(nóng)桿菌浸染液：從平板上挑取含有待轉(zhuǎn)基因的單菌落，接種到含篩選抗生素的YEB液體培養(yǎng)基（pH7. 0)中，28°C、225r/min的條件下培養(yǎng)至OD6m=O. 6~0. 8。取800ML 菌液稀釋到50mL無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)至OD6tw=O. 6~0. 8時(shí)， 4000r/min離心5min，沉淀物用50mL液體MS培養(yǎng)基將菌體重懸。
[0011] (2)大白菜原位轉(zhuǎn)基因方法：大白菜于田間正常生長(zhǎng)至開花始期，去除已開的花， 保留花蕾，用鑷子輕輕將花蕾剝開小口，將花序全部浸泡在農(nóng)桿菌浸染液里2~4min。正常 管理，采收種子。
[0012] (3)大白菜轉(zhuǎn)化后代的抗性鑒定：將收獲的大白菜種子播種于含抗生素的培養(yǎng)基 MS+lmg/LBA上，挑選具有抗性的幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)。
[0013] (4)大白菜轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)：采集具有抗性的大白菜幼嫩葉片，用常規(guī)的 CTAB法提取葉片DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物IOul，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳， 觀察如有待轉(zhuǎn)基因的條帶，則說明是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)化成功。
[0014] 由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有7大優(yōu)點(diǎn)： (1)針對(duì)由于白菜攜帶不易再生的AA基因組型，白菜難分化這一特點(diǎn)，本方法不需要 外植體的再生系統(tǒng)，這對(duì)組織培養(yǎng)時(shí)不定芽發(fā)生困難的大白菜基因型的轉(zhuǎn)基因研究具有較 大的應(yīng)用價(jià)值，在其他作物涉及植株再生的轉(zhuǎn)基因方法遇到困難時(shí)，亦具有很好的應(yīng)用前 景。
[0015] (2)簡(jiǎn)化和縮短轉(zhuǎn)基因育種過程，直接得到轉(zhuǎn)化種子，無須進(jìn)行繁瑣的組織培養(yǎng)， 避免了組培過程中容易污染導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗，也免除了從離體原生質(zhì)到再生植株漫長(zhǎng)的人工 培養(yǎng)過程，還減少了基因型的影響。
[0016] (3)操作簡(jiǎn)便、快速、高效、成本低、易于掌握，無需昂貴的儀器設(shè)備和化學(xué)藥品，研 究人員可直接在田間操作。
[0017] (4)具備基因工程的先進(jìn)性，不僅可以導(dǎo)入供體的總DNA，也可是部分DNA片段或 目的基因，導(dǎo)入的DNA易于整合，被轉(zhuǎn)基因所控制的性狀在受體植株中易于穩(wěn)定。
[0018] (5)在轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建中，有時(shí)可省略抗生素標(biāo)記基因，因而在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品 中，將可能不含有抗生素表達(dá)，安全性會(huì)更好。
[0019] (6)保留了常規(guī)育種的基本特點(diǎn)（可直接按照育種要求選擇轉(zhuǎn)化后代）。
[0020] (7)在現(xiàn)有技術(shù)中，國(guó)內(nèi)外從沒有將大白菜花蕾直接浸泡在含待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌 浸染液里，在活體狀態(tài)下原位轉(zhuǎn)化而直接獲得大白菜轉(zhuǎn)化種子。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)離體轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法及真空滲入法相比，有 以下3大不同點(diǎn)： (1)常用的由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的離體轉(zhuǎn)化方法需經(jīng)過以下步驟：一、選擇植物材料進(jìn)行無菌 培養(yǎng)，培養(yǎng)子葉、下胚軸、小孢子等組織或器官作為轉(zhuǎn)化受體(外痔提）；二、建立高頻再生體 系；三、材料選擇壓的確定；四、農(nóng)桿菌的活化；五、受體材料的預(yù)培養(yǎng)；六、感染材料和共培 養(yǎng)；七、抑菌培養(yǎng)；八、選擇培養(yǎng)；九、轉(zhuǎn)基因植株鑒定；十、轉(zhuǎn)基因后代的遺傳穩(wěn)定性分析。 該方法的缺點(diǎn)是：_大白菜是蕓薹屬中最難再生的一類作物，由于白菜具有AA基因組，與 蕓薹屬其他具有BB和CC基因組的植物相比，其不定芽和植株再生比較難；賴大白菜組織培 養(yǎng)及轉(zhuǎn)化再生能力對(duì)基因型依賴性比較強(qiáng)，不同的基因型其再生率和轉(zhuǎn)化難易程度差異很 大，所以對(duì)于特定的大白菜材料，需要進(jìn)行再生和轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化; 1i不同的抑菌抗生素和 轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株對(duì)外植體的分化有一定的影響；響有些品種存在著可再生細(xì)胞和轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細(xì)胞部位不一致的問題，造成逃逸體、嵌合體、轉(zhuǎn)化率低下等；有的品種農(nóng)桿菌與受 感染細(xì)胞間易產(chǎn)生過敏性反應(yīng)，導(dǎo)致感染部位的褐化和壞死；?細(xì)胞脫分化和再分化中有 可能產(chǎn)生體細(xì)胞變異以及轉(zhuǎn)基因植株的育性降低或喪失，這有可能干擾轉(zhuǎn)基因植株的分析 及利用。
[0022] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因過程與上述不同，是直接將大白菜花蕾浸泡在含待轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿 菌浸染液里，直接獲得大白菜轉(zhuǎn)化種子，不需組織培養(yǎng)過程，簡(jiǎn)單易行，大大節(jié)約了時(shí)間，縮 短了轉(zhuǎn)化進(jìn)程，且避免了植物組織培養(yǎng)過程中可能產(chǎn)生的體細(xì)胞變異及基因型依賴性等上 述6