專利名稱：一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌，同時還涉及一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌的制備方法，還涉及一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌的用途。
背景技術(shù)：
很多芽胞桿菌可以通過產(chǎn)生脂肽抑制真菌的生長。脂肽之所以能夠抑制真菌的生長，是由于其兩親的結(jié)構(gòu)決定的，脂肽與細(xì)胞膜相互作用可以導(dǎo)致膜穿孔造成原生質(zhì)泄露，使得菌絲體斷裂；脂肽還可以通過溶解病原菌孢子的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，致使細(xì)胞壁穿孔、畸形等從而抑制孢子萌發(fā)，見參考文獻(xiàn)(祁高富；趙秀云；朱發(fā)銀；文凱；張世超；喻子牛。一株產(chǎn)促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌及由該菌制備的脂肽與應(yīng)用。專利號 CN200810197403. 4)。申請人:所在單位從水稻根部分離到一株解淀粉芽胞桿菌CH1，經(jīng)過發(fā)酵可以產(chǎn)生脂肽類表面活性素，該脂肽對水稻紋枯病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病、棉花炭疽病菌、楊樹潰瘍病菌、灰霉菌等多種植物病原真菌具有顯著的拮抗效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該脂肽對真菌的抑制作用原理不但包括使真菌菌絲發(fā)生壞死，而且包括在濃度較低時誘導(dǎo)真菌發(fā)生細(xì)胞凋亡，見參考文獻(xiàn)Oli，G.F.，Zhu, F. Y.，Du, P，et al. Lipopeptide induces apoptosis in fungal cells by a mitochondria-dependent pathway. 020P印tides，2010，31 :1978-1986 和林福呈，李德葆，枯草芽孢桿菌(Bacillus 訓(xùn)計丨1化)59對植物病原真菌的溶菌作用，植物病理學(xué)報，2003，33 :174-177)。在載玻片上分別接種CHl和水稻紋枯病菌進(jìn)行對峙實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在載玻片上受到抑制的水稻紋枯病菌出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，卻沒有檢測到相應(yīng)的細(xì)胞壞死特征， 推測在自然環(huán)境下芽胞桿菌類的拮抗細(xì)菌，如枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌等，產(chǎn)生的脂肽濃度不足以使病原真菌壞死，通常是通過誘導(dǎo)真菌細(xì)胞凋亡的形式來抑制病原真菌的生長。當(dāng)前，化學(xué)農(nóng)藥的使用已經(jīng)在全球造成了嚴(yán)重的生態(tài)破壞和環(huán)境污染，使用高效低毒的生物農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。本實驗中對CHl的發(fā)酵優(yōu)化首先采用 Plackett-Burman設(shè)計篩選出對脂肽產(chǎn)量有顯著影響的因素，然后用田口設(shè)計得到了培養(yǎng)基各組分的最優(yōu)組合。發(fā)酵液后處理采用噴霧干燥方式進(jìn)行，噴霧干燥中，高壓氣流使發(fā)酵液形成超細(xì)液滴，使發(fā)酵液瞬時干燥，最大限度的降低了高溫對發(fā)酵液中活性成分的傷害， 保留了抑菌活性。本研究還通過田間苗圃實驗對CHl粉末的藥效進(jìn)行了檢測，并與常用的化學(xué)殺菌劑進(jìn)行了比較，為脂肽類生物農(nóng)藥的研究和使用提供了參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供了一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌，該菌能產(chǎn)生促真菌凋亡的一種脂肽，可作為抗植物病原菌的有效成分。該菌對 Rhizoctonia solani，Helminthosporium maydis，F(xiàn)usarium oxysporium, Botrytis cinereapers， Gibberella zeae， Dothiorella gregaria， Colletotrichum gossypii等植物病原真菌都有明顯的抗菌效果。發(fā)酵液對油茶炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)抑制效果顯著。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌的制備方法，對該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件和發(fā)酵液的后處理方法進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，對發(fā)酵液進(jìn)行低壓濃縮和噴霧干燥后處理，噴霧干燥后得到的粉末藥效存留率為86. 2%。該粉劑使用方便，可長期儲存于室溫，藥效穩(wěn)定，兌水稀釋后噴霧施用，可用于田間大面積防治油茶炭疽病等真菌病害。本發(fā)明的還有一個的目的是在于提供了一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌在制備治療或預(yù)防油茶炭疽病藥物中的應(yīng)用。苗圃實驗證明，噴霧干燥粉末能夠很好的防治油茶炭疽病。粉劑稀釋1000倍后用于田間苗圃實驗，防治油茶炭疽病菌，解淀粉芽胞桿菌 (B. amyloliquefaciens)CHl粉劑的防效高于常用的化學(xué)農(nóng)藥，防效高達(dá)74. 4% ；70%甲基托布津可濕性粉劑，防效達(dá)59. O%，50%多菌靈可濕性粉劑僅為48. %。表明該菌可有效防治油茶炭疽病菌，且與化學(xué)農(nóng)藥相比，對環(huán)境無污染，對人畜不會造成傷害。該菌可用于防治油茶炭疽病，有利于生產(chǎn)高品質(zhì)的無公害植物油。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌的制備方法，其步驟是1.解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的篩選分離從水稻田采集分蘗期的中花11水稻，將水稻根部外表面以自來水沖洗干凈，再以無菌水沖洗2-4次，然后以70% (ν/ν)乙醇浸泡消毒^-3 ，以無菌水沖洗2-4次后，將水稻根部切成約Imm大小的碎塊，置于PDA培養(yǎng)基(含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L)上于培養(yǎng)46-50h，獲得單菌落。2.檢測細(xì)菌的抑菌活性將分離得到的細(xì)菌以PD液體培養(yǎng)基(含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，加蒸餾水至1L)于觀！，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵上清液以0. 22 μ m濾膜過濾后， 與PDA培養(yǎng)基按體積比混合倒平皿接種水稻紋枯病菌(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系植物病理教研室)，見參考文獻(xiàn)(云月利，徐冠軍.斑蝥素對植物病原菌抑制作用的研究.湖北大學(xué)學(xué)報 自然科學(xué)版，2003，25 (4) =342-345)，檢測抗菌活性。3.細(xì)菌的分類鑒定對檢測到顯著抗真菌活性的細(xì)菌進(jìn)行16SrRNA和形態(tài)鑒定。用常規(guī)方法提取細(xì)菌的基因組DNA，見參考文獻(xiàn)(薩姆布魯克等著，金冬雁等譯.分子克隆實驗指南第二版.北京科學(xué)出版社，1999)，以16SrRNA的通用引物進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定后在NCBI中經(jīng)Blast比較分析確定為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) 04.細(xì)菌培養(yǎng)和保存方法培養(yǎng)解淀粉芽胞桿菌的條件為PD培養(yǎng)基或者LB培養(yǎng)基，28°C -37°C培養(yǎng)。菌株保存方法取培養(yǎng)好的Bacillus, amyloliquefaciens CHl菌液添加滅菌甘油至終濃度25%于-80°C保存。申請人:通過對湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏的一株解淀粉芽胞桿菌(保藏編號為CCTCC NO :M208127)進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化和發(fā)酵放大，并對發(fā)酵液進(jìn)行低壓濃縮和噴霧干燥后處理，發(fā)現(xiàn)噴霧干燥后保留了大部分抑菌活性，苗圃實驗證明，噴霧干燥粉末能夠很好的防治油茶炭疽病。一株分離的產(chǎn)促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌菌株，解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciensKHl，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC :M208127，保藏單位地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2008年9月5日。解淀粉芽胞桿菌CHl (Bacillus, amyloliquefaciens CHl)的菌學(xué)特征解淀粉芽胞桿菌CHl革蘭氏陽性，菌體桿狀，菌體大小1-1. 4 μ mX 2. 3-3. 5 μ m， 在PDA(含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L)平板上能快速擴(kuò)散， 不形成特定的菌落形態(tài)，邊緣不規(guī)則，呈灰白色，粘稠有莢膜，培養(yǎng)4 后表面有小皺褶。 在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直徑3-5mm，表面干燥有皺褶，中間塌陷，邊緣波狀。 37°C生長明顯快于^°C。芽胞近端生，鞭毛周生。對多種植物病原菌有顯著抑菌活性，檢測72h時的抑菌率，對油菜灰霉病菌(Botryotini fuckeliana)的抑菌率為96. 9%，對辣 ￠(^11^1 ' (Col letotrichum gloeosporioides) ^ 77. O %, MW^&SMM (Cytospora chrysosperma)為 57. O%,對甘蔴鳳梨病菌(Thielaviopsis paradoxa)為 65. 1%,對蘋果輪紋病菌(Dothiorella gregaria)為 62. O%，對小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum) 為65. 8 %，對油菜核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)為85. 3 %，對玉米小斑病菌 (Bipolaris maydis)為 93. 4 %，對油茶炭 Iil 病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)為100%。PDB以及豆粕培養(yǎng)基培養(yǎng)的CHl培養(yǎng)液對植物病原菌都具有較好的抑菌效果，但2%豆粕培養(yǎng)基OOg豆粕粉，蒸餾水定容至1L)發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果明顯優(yōu)于PDB 培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水定容至1L)的發(fā)酵產(chǎn)物。解淀粉芽胞桿菌CHl可產(chǎn)生一種Surfactin類的環(huán)狀脂肽，命名為WHlfunginJg 肽能明顯抑制真菌細(xì)胞的葡聚糖合成酶活性，經(jīng)WHlfimgin處理后，水稻紋枯病菌和假絲酵母的某些細(xì)胞能被依文思藍(lán)染色，表現(xiàn)出細(xì)胞膜穿孔、細(xì)胞質(zhì)滲漏等現(xiàn)象。脂肽序列如下
權(quán)利要求
1.一株分離的產(chǎn)促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌菌株，其特征在于解淀粉芽胞桿 M (.Bacillus amyloliquefaciens ) CHl，CCTCC :M208127。
2.權(quán)利要求1所述的一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌的制備方法，其步驟是A、解淀粉芽胞桿菌的篩選分離從水稻田采集分蘗期的水稻，將水稻根部外表面以自來水沖洗干凈，再以無菌水沖洗2-4次，然后以70%v/v乙醇浸泡消毒^-3 ，以無菌水沖洗 2-4次后，將水稻根部切成Imm大小的碎塊，置于PDA培養(yǎng)基含200g馬鈴薯煮出液，20g葡萄糖，20g瓊脂，加蒸餾水至1L，上于培養(yǎng)46-50h，獲得單菌落；B、檢測細(xì)菌的抑菌活性將分離得到的細(xì)菌以PD液體培養(yǎng)基含200g馬鈴薯煮出液， 20g葡萄糖，加蒸餾水至仏，于觀！，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵上清液以0.22 μ m濾膜過濾后，與 PDA培養(yǎng)基按體積比混合倒平皿接種水稻紋枯病菌，檢測抗菌活性；C、細(xì)菌的分類鑒定對檢測到顯著抗真菌活性的細(xì)菌進(jìn)行16SrRNA和形態(tài)鑒定；用常規(guī)方法提取細(xì)菌的基因組DNA，以16SrRNA的通用引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定后在NCBI中經(jīng)Blast比較分析確定為解淀粉芽胞桿菌；D、細(xì)菌培養(yǎng)和保存方法培養(yǎng)解淀粉芽胞桿菌的條件為PD培養(yǎng)基或者LB培養(yǎng)基， 280C _37°C培養(yǎng)，菌株保存取培養(yǎng)好的feciB^s. amyloliquefaciens CHl菌液添加滅菌甘油至終濃度25%于-80°C保存。
3.權(quán)利要求1所述的一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌在制備治療或預(yù)防油茶炭疽病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞桿菌及制備方法和應(yīng)用，其步驟A、解淀粉芽胞桿菌的篩選分離采集分蘗期的水稻，將水稻根部沖洗，以乙醇浸泡消毒，將水稻根部切塊，置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得單菌落；B、檢測細(xì)菌的抑菌活性將分離得到的細(xì)菌以PD液體培養(yǎng)，檢測抗菌活性；C、細(xì)菌的分類鑒定對檢測到顯著抗真菌活性的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)鑒定；D、細(xì)菌培養(yǎng)和保存培養(yǎng)解淀粉芽胞桿菌的條件為PD培養(yǎng)基，菌株于低溫保存。該菌在制備治療或預(yù)防油茶炭疽病藥物中的應(yīng)用方法易行，操作簡便，脂肽以其抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、穩(wěn)定性好，防治效果穩(wěn)定，其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)-脂肽活性穩(wěn)定，抗高溫、抗蛋白酶解，是一種高效穩(wěn)定的抗菌物質(zhì)。
文檔編號A01P3/00GK102268390SQ20111018978
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者信姍姍, 李菁菁, 王圣英, 祁高富, 趙秀云 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)