專利名稱：一種解淀粉芽胞桿菌wh3及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于免疫學領(lǐng)域，更具體地是涉及一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株，同時還涉及一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株的制備方法，還涉及一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株在制備免疫佐劑中的應(yīng)用，同時也適用于其它微生物產(chǎn)生的具有類似結(jié)構(gòu)的環(huán)肽。
背景技術(shù)：
免疫佐劑是指與抗原同時或預先應(yīng)用，能增強抗原物質(zhì)免疫原性，增強機體針對抗原的免疫應(yīng)答能力，或改變免疫反應(yīng)類型，而本身并無抗原性的物質(zhì)。佐劑的作用機制極為復雜，目前的研究認為主要有(1)抗原貯存作用，礦物膠體、乳膠類佐劑等可在注射部位形成抗原儲池，使抗原免受肝臟清除并延緩其釋放速率，以便于疫苗抗原能充分地、高水平地、長時間地與免疫細胞接觸作用，進而誘導有意義的免疫應(yīng)答；(2)抗原提呈作用，佐劑能夠保持抗原構(gòu)象完整并將其提呈給適當?shù)拿庖咝?yīng)細胞， 同時影響抗原提呈細胞(APC)攝取抗原和分泌細胞因子；(3)免疫調(diào)節(jié)作用，佐劑可以調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)，不同的佐劑誘導APC分泌不同的細胞因子；(4)靶向作用，佐劑通過激發(fā)APC 攝取和傳遞抗原，進而向免疫細胞呈遞抗原；( 誘導T細胞免疫應(yīng)答，指有目的地使用具有抗原或T細胞表位的佐劑類物質(zhì)，此物質(zhì)所具有的優(yōu)先誘導或僅誘導T細胞應(yīng)答的特性。佐劑的種類豐富，因此分類的方式也很多，沒有統(tǒng)一的標準。根據(jù)其來源分為微生物來源佐劑、天然藥物佐劑、生理性產(chǎn)物佐劑、合成佐劑和營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)其物理和化學性質(zhì)，可以把佐劑分為凝膠型佐劑、微粒型佐劑、微生物來源佐劑、乳劑和合成佐劑。根據(jù)佐劑作用方式則可分為免疫調(diào)節(jié)劑、運輸型佐劑和靶向型佐劑。按照其性能差別，又可分為免疫刺激型佐劑、顆粒型佐劑、粘膜佐劑和治療性疫苗佐劑。伴隨著生物科學的快速發(fā)展，免疫佐劑的應(yīng)用范圍不斷擴大，免疫效果也逐漸提高，但它們依然有著各種不可避免的缺點。這些缺陷主要體現(xiàn)為(1)毒副作用突出，如弗氏佐劑、Quil A等；(2)對于抗原的應(yīng)用范圍有限，如鋁佐劑；(3)免疫作用機制單一，如鋁佐劑不能誘導產(chǎn)生Thl型反應(yīng)；(4)穩(wěn)定性不高、制作工藝復雜，如CpG寡核苷酸片段、脂質(zhì)體等；( 免疫作用機制研究不徹底，如絕大多數(shù)的中藥佐劑。這些缺點限制了佐劑的廣泛應(yīng)用，也影響著佐劑整體的發(fā)展。理想疫苗佐劑需要具有安全、有效、靶向和經(jīng)濟的特點。開發(fā)研制新型的免疫佐劑以增強疫苗的免疫效力并減少疫苗的毒副作用將是未來的發(fā)展趨勢，新型疫苗佐劑是研究其免疫佐劑性與毒性的最佳平衡。它是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中的免疫調(diào)節(jié)劑，非特異性免疫刺激作用是發(fā)揮其免疫佐劑性，使機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答所必需的基本條件，但如果這種作用過度或過強，則必然呈現(xiàn)毒副作用。因此，如果能尋找一種既具有強佐劑活性，又具有極低非特異性免疫刺激作用的物質(zhì)，那么對于佐劑研究來說將具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有疫苗佐劑在安全性、穩(wěn)定性等方面的缺陷，本發(fā)明通過大量實驗和創(chuàng)造性勞動，目的是在于提供了一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株，該菌株可通過發(fā)酵生產(chǎn)一種環(huán)肽用于制備免疫佐劑，制備的新型免疫佐劑具有高效性、多能性、良好的安全性、低成本、 性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點，能激發(fā)有效的體液和細胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株的制備方法，該菌株是從油菜苗中分離得到具有抗真菌活性的植物內(nèi)生菌，可產(chǎn)生抗真菌活性的環(huán)狀多肽表面活性素，命名為賽弗諾(Safenour)。WH3經(jīng)抗真菌活性檢測、形態(tài)觀察、生理生化試驗鑒定和16S rDNA序列分析，鑒定為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefacien)。解淀粉芽孢桿菌是革蘭氏陽性芽孢桿菌屬，在食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，被認為無毒素和無致病性。WH3菌株產(chǎn)生的含堿性氨基酸精氨酸的Mfenour多肽，具有非常顯著的免疫佐劑活性。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用，通過發(fā)酵培養(yǎng)WH3菌株，可產(chǎn)生含精氨酸的環(huán)狀多肽表面活性素Safenour。 Safenour可用作免疫佐劑，無論是口服還是注射給藥途徑，Safenour都能激發(fā)有效的體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答。Mfenour用作疫苗佐劑安全性高，口服免疫達到1. 5g/kg體重的劑量，試驗動物為無死亡、無中毒、無器官組織病變，具有很高的安全性。Mfenour多肽用作佐劑具有多能性，既能用于口服免疫，也能用于注射免疫；既能激發(fā)強烈的體液免疫，又能激發(fā)有效的細胞免疫。Mfenour多肽用作佐劑還具有高效性，用作口服佐劑，每只小鼠Mfenour的口服劑量為50-200 μ g，抗原蛋白谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)劑量為 50-200 μ g ；注射免疫Mfenour為1_20μ g，抗原蛋白GST劑量為2_5 μ g就能激發(fā)高效的免疫應(yīng)答，其中口服免疫在血清中誘導產(chǎn)生的抗GST抗體的效價為12000倍，而注射免疫誘導產(chǎn)生的抗體效價更是高達400000倍。^fenour多肽佐劑激發(fā)的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的特異性抗體在小鼠體內(nèi)可持續(xù)存在2個月以上，形成記憶性淋巴細胞，當再次免疫時可迅速激發(fā)強烈的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高滴度的抗體，效價可達400000倍。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株的制備方法，其步驟是1.細菌的分離篩選與鑒定從中國湖北省武漢市湖北農(nóng)科院油菜田(任一油菜田)中選取3葉期的油菜苗分離具有抗油菜菌核病的細菌。對檢測到具有顯著抗真菌活性的細菌進行16S rDNA、生理生化和形態(tài)鑒定，確定分離得到的WH3菌株是一株解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。2.抗真菌活性物質(zhì)Mfenour的分離純化及鑒定對上述獲得的解淀粉芽胞桿菌 WH3培養(yǎng)2天后的發(fā)酵液用“兩步萃取法”(見實施例2、提取抗菌活性物質(zhì)，將萃取后液體經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并溶于IOml蒸餾水中。用葡聚糖G-25柱進一步分離純化，繪制洗脫曲線。利用洗脫曲線各峰值的組分進行抗菌活性檢測。在抗真菌活性分析后，對有活性的抗菌物質(zhì)進行真空冷凍干燥進行濃縮，并經(jīng)MALDI-T0F質(zhì)譜分析，得到抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)為一種特殊的環(huán)狀多肽(表面活性素)，含堿性氨基酸Arg，命名為賽弗諾(Safenour)。實施結(jié)果從油菜苗中共分離得到細菌菌株86株，其中命名為WH3的菌株具有顯著的抗油菜菌核病的抗性。WH3菌株經(jīng)形態(tài)觀察和16S rDNA分析，發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陽性，菌體桿狀，菌體大小1-1. 4 μ mX 2. 3-3. 5 μ m，在PDA平板上能快速擴散，不形成特定的菌落形態(tài)，邊緣不規(guī)則，呈灰白色，粘稠有莢膜，培養(yǎng)4 后表面有小皺褶。在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直徑3-5mm，表面干燥有皺褶，中間塌陷，邊緣波狀。37°C生長明顯快于。芽胞近端生，鞭毛周生。WH3菌株的接觸酶、酪朊水解、厭氧生長、明膠水解、淀粉水解、V-P反應(yīng)和硝酸鹽還原均為陽性；酪氨酸水解、苯丙氨酸脫氨酶、吲哚產(chǎn)生、檸檬酸鹽利用均為陰性；可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖、蔗糖。結(jié)合，上述形態(tài)特征及染色結(jié)果，判斷WH3 為芽孢桿菌屬。再結(jié)合16S rDNA序列分析(與解淀粉芽胞桿菌的同源性為99. 4%)表明為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyl0liquefaCienS)WH3，保存于中國典型物保藏中心，保藏地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年7月洸日，保藏編號CCTCC NO :M2011266, 分類命名解淀粉芽胞桿菌 WH!3B acillus amyloliquefaciens WH3。WH3產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)經(jīng)“兩步萃取法”萃取后，再經(jīng)凝膠柱分離，獲得的具有抗真菌活性的物質(zhì)進一步經(jīng)MALDI-T0F-MS分析，發(fā)現(xiàn)其分子量為1065 Da，為含精氨酸的環(huán)狀多肽表面活性素，命名為賽弗諾(Mfenour)，結(jié)構(gòu)式如下圖。其特征為含有一個堿性氨基酸精氨酸，具有很強的熱穩(wěn)定性，對酸堿環(huán)境不敏感，可長期儲存。
權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)WH3，CCTCC :M201U66。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種解淀粉芽胞桿菌，其特征在于所述的解淀粉芽胞桿菌所產(chǎn)環(huán)狀環(huán)肽，分子量為1065Da，該環(huán)肽結(jié)構(gòu)式如下
3.權(quán)利要求1所述的一種解淀粉芽胞桿菌在制備免疫佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種解淀粉芽胞桿菌WH3菌株及制備方法和用途，其步驟1.細菌的分離與鑒定從油菜苗中分離得到具有抗油菜菌核病的細菌，經(jīng)16SrDNA和形態(tài)鑒定，確定分離得到的WH3菌株為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。2.抗真菌活性物質(zhì)賽弗諾(Safenour)的分離純化及鑒定將WH3菌株發(fā)酵后萃取抗菌活性物質(zhì)，再用葡聚糖凝膠柱分離純化，對有活性的抗菌物質(zhì)進行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，推斷為一環(huán)狀多肽。3.該菌株在制備疫苗及免疫佐劑中的應(yīng)用。將Safenour用作佐劑，與蛋白抗原混合后分別經(jīng)口服和注射途徑免疫小鼠，可激活有效的體液和細胞免疫應(yīng)答，在血清中可檢測到高滴度的特異性抗體。Safenour生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性高，與抗原混合不需乳化，免疫增強效果優(yōu)于弗氏佐劑及霍亂弧菌毒素B亞單位。
文檔編號C12R1/07GK102286408SQ20111022269
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者李菁菁, 祁高富, 蘇紀宇, 趙秀云 申請人:武漢光谷世傲生物科技有限公司