專利名稱：一種霍山石斛種苗繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及通過試管開花、人工授粉結(jié)果來達到霍山石斛、Dendrobium huoshanense C. Ζ. Tang et S. J. Cheng)種苗高效繁殖的方法。
背景技術(shù)：
霍山石斛、Dendrobium huoshanense C. Ζ. Tang et S. J. Cheng)是我國瀕臨滅絕的珍稀物種，被譽為“中華仙草”之首，是霍山縣獨有的、擁有原產(chǎn)地地理標(biāo)志的名貴中藥材，具有極高的藥用保健價值，具有生津益明、清熱養(yǎng)陰、消炎止痛、清音明目功能及抗癌、抗衰老、抗輻射和增強免疫力等功效，尤其石斛多糖具有極高的保健和醫(yī)療作用。但由于其生境狹窄，繁殖困難，植株數(shù)量極少，因此人工種植霍山石斛具有廣闊的前景，但缺乏優(yōu)質(zhì)種苗是霍山石斛種植業(yè)的瓶頸之一。雖然國內(nèi)早有關(guān)于霍山石斛種苗生產(chǎn)的專利和文獻報道，但是卻沒有見到利用試管開花授粉結(jié)果的方法來繁殖霍山石斛的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種能高效率地繁殖霍山石斛種苗的方法。選取生長健壯的霍山石斛開花株，通過人工授粉得到果實，然后將果實中的種子播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在種子萌發(fā)成原球莖并進一步分化成小苗后，再將小苗用試管開花培養(yǎng)基培養(yǎng)，待所培養(yǎng)的植株開花后在無菌條件下進行人工授粉，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)的果實成熟后，再進行無菌播種，待種子萌發(fā)后長成小植株，最后將小植株在壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)成可出瓶種植的種苗，種苗出瓶成活率可達96%以上，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種霍山石斛種苗繁殖方法，其特征在于，包括以下的工藝步驟
(1)外植體獲取在人工種植的霍山石斛開花時，選取生長健壯的母株進行人工授粉， 并將人工授粉而來的成熟果實作為外植體；
(2)原球莖誘導(dǎo)將外植體依次用酒精浸泡觀-32秒，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 的升汞溶液消毒 25-35分鐘，無菌水漂洗4-5次后切開，將胚接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基KnPl上萌發(fā)成原球莖， 并進一步分化成小苗；
(3)人工授粉將步驟(2)分化出的小苗轉(zhuǎn)移到試管開花培養(yǎng)基KnP2上培養(yǎng)，待開花后，選取生長健壯的開花株在無菌條件下進行人工授粉；
(4)無菌播種果實成熟后切開進行無菌播種，種子萌發(fā)形成原球莖，并進一步形成完整的小植株；
(5)壯苗培養(yǎng)將小植株轉(zhuǎn)移到玻璃瓶壯苗培養(yǎng)基ΚηΡ3上培養(yǎng)，形成成苗；
(6)試管苗出瓶移栽將栽有成苗的玻璃瓶轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗8-12天，光照度 1500 20001χ，光照9-12小時/天，然后將成苗從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在用木屑的基質(zhì)中栽培，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，1000株成活960-970株，移栽的成活率均可達96-97%。
上述步驟中培養(yǎng)基組分及含量配比如下
種子萌發(fā)培養(yǎng)基KnPl MgS04 · 7H20230-260mg/LKH2P04230-260mg/LCa(N03)2. 4H20950-1050 mg/L(NH4)2S04450-550mg/L鐵鹽 FeS04 · 7H2027. 5-30.0 mg/LNa2-EDTA37. 1- 37.5 mg/LZnS04. 7H200. 330-0.332 mg/'LCuS04. 5H200. 035-0.045 mg/'LH3B030. 055-0.057 mg/'LNa 2MoO4. 2H200. 035-0.039 mg/'L甘氨酸1. 8-2. 2mg/L煙酸0. 3-0. 5mg/LVBl0. 8-1. 2mg/LVB60. 4-0. 6mg/L香蕉145-155g/L蔗糖180-220g/L瓊脂5. 0-7. 0g/L ；試管開花培養(yǎng)基KnP2:KnPl培養(yǎng)基
6-BA1. 0 mg/L
NAA0. 1 mg/L ；
壯苗培養(yǎng)基KnP3 MS或Β5培養(yǎng)基 6-ΒΑ0. 4-0. 6 mg/L
NAA0. 8-1. 2 mg/L ；
上述步驟中所有的培養(yǎng)基PH 5. 1 5. 4，培養(yǎng)溫度U6士2) °C。所述的一種霍山石斛種苗繁殖方法，其特征在于步驟(1)所述的果實成熟期為 120 140天，步驟(2)所述的種子萌發(fā)溫度為25 ^°C，步驟(；3)所述的小苗的高度為 2. 5 3. 5cm,所述的果實成熟期為60 70天，步驟( 所述的開花期為55 63天，步驟 (5)所述的成苗高3 5cm，每叢有2 3個小苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的方法的優(yōu)點
1、縮短了霍山石斛果實的成熟期，自然狀態(tài)下，霍山石斛的果實成熟其為120 140 天，而本發(fā)明方法將霍山石斛的果實的成熟期縮短到為60 70天；
2、本發(fā)明方法繁殖霍山石斛具有高效且無病蟲害的特點，能終年生產(chǎn)霍山石斛種子；
3、成活率高，成苗的移栽成活率可達96%以上，從而為霍山石斛種苗的繁殖開辟了一條新的途徑；
4、本發(fā)明方法操作簡單，成本低廉。
具體實施方法
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。實施例1
1.外植體獲取開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后120天果實成熟，將果實作為外植體用于播種；
2.原球莖誘導(dǎo)播種時，將外植體依次用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡30秒，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0. 2%的升汞溶液中消毒30分鐘，無菌水漂洗5次，然后切開果實，將粉末狀胚接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基KnPl上，10天后種子萌發(fā)，形成原球莖，70天后形成小苗；
3.人工授粉將2.5 3. 5cm高的小苗100株轉(zhuǎn)瓶到試管開花培養(yǎng)基KnP2上，58天時 21株開花，開花率可達21%，選取試管內(nèi)生長健壯的植株進行試管內(nèi)人工授粉；
4.無菌播種人工授粉后70天果實成熟，采下果實，切開果實進行無菌播種，7天左右種子萌發(fā)形成原球莖，80天時能形成完整的小植株，每個果實形成完整的小植株的數(shù)量在 4萬株以上；
5.壯苗培養(yǎng)將無菌播種獲得的密集的小植株分開后轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基ΚηΡ3上培養(yǎng)， 80天形成株高3 km，每叢有2 3個苗；
6.試管苗移栽將成苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗10天，光照度1500 20001x，光照11小時/天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在用木屑的基質(zhì)中栽培，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，1000株成活960株，移栽的成活率均可達96%。在上述實驗中所用的培養(yǎng)基均為pH 5. 1 5. 4，培養(yǎng)溫度U6士2) °C。實施例2:
1.外植體制備開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后130天果實成熟，將果實作為外植體用于播種；
2.原球莖誘導(dǎo)播種時，將外植體依次用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡30秒，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0. 2%的升汞溶液中消毒30分鐘，無菌水漂洗5次，然后切開果實，用接種針將黃白色粉末狀胚接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基KnPl上，10天后種子萌發(fā)，形成原球莖，為了在生產(chǎn)過程中獲得更多的種苗，將原球莖形成芽和類原球莖的混合組織，在繼代增殖培養(yǎng)基KnPl上繼代增殖，40天后增殖4倍，形成的類原球莖繼續(xù)進行增殖，得到帶根的小苗，每個果實所得的種苗數(shù)量在4萬株以上；
3.人工授粉將2.5 3. 5cm高帶根的小苗100轉(zhuǎn)瓶到試管開花培養(yǎng)基KnP2上，62天時22株開花，開花率可達22%，選取試管內(nèi)生長健壯的植株進行試管內(nèi)人工授粉；
4.無菌播種人工授粉后60天果實成熟，采下果實，果實無需消毒，切開果實進行無菌播種，7天左右種子萌發(fā)形成原球莖，80天時能形成完整的小植株，每個果實的數(shù)量在4萬株以上；
5.壯苗培養(yǎng)將無菌播種獲得的密集的小植株分開后轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基ΚηΡ3上培養(yǎng)， 70天形成株高3 km，每叢有2 3個芽的成苗；
6.試管苗移栽將成苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗8天，光照度1500 20001x，光照10小時/天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在用木屑的基質(zhì)中栽培，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，1000株成活968株，移栽的成活率均可達96. 8%。在上述實驗中所用的培養(yǎng)基均為pH 5. 1 5. 4，培養(yǎng)溫度( 士2) °C。
實施例3:
1.外植體制備開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后140天果實成熟，將果實作為外植體用于播種；
2.原球莖誘導(dǎo)播種時，將外植體依次用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡30秒，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0. 2%的升汞溶液中消毒30分鐘，無菌水漂洗5次，然后切開果實，用接種針將黃白色粉末狀胚接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基KnPl上，10天后種子萌發(fā)，形成原球莖，為了在生產(chǎn)過程中獲得更多的種苗，將原球莖形成芽和類原球莖的混合組織，在繼代增殖培養(yǎng)基KnPl上繼代增殖，40天后增殖4倍，形成的類原球莖繼續(xù)進行增殖，得到帶根的小苗，每個果實的數(shù)量在 4萬株以上；
3.人工授粉將2.5 3. 5cm高的小苗100株轉(zhuǎn)瓶到試管開花培養(yǎng)基KnP2上，60天時 35株開花，開花率可達35 %，選取試管內(nèi)生長健壯的植株進行試管內(nèi)人工授粉；
4.無菌播種人工授粉后60天果實成熟，采下果實，切開果實進行無菌播種，7天左右種子萌發(fā)形成原球莖，80天時能形成完整的小植株，每個果的數(shù)量在4萬株以上；
5.壯苗培養(yǎng)將無菌播種獲得的密集的小植株分開后轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基ΚηΡ3上培養(yǎng)， 60天形成株高3 5cm，每叢有2 3個芽的成苗；
6.試管苗移栽將成苗轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗12天，光照度1500 20001x，光照12小時/天，然后將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，在用木屑的基質(zhì)中栽培，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，1000株成活970株，移栽的成活率均可達97%。在上述實驗中所用的培養(yǎng)基均為pH 5. 1 5. 4，培養(yǎng)溫度U6士2) °C。
權(quán)利要求
1. 一種霍山石斛種苗繁殖方法，其特征在干，包括以下的エ藝步驟(1)外植體獲取在人工種植的霍山石斛開花時，選取生長健壯的母株進行人エ授粉， 并將人工授粉而來的成熟果實作為外植體；(2)原球莖誘導(dǎo)將外植體依次用酒精浸泡觀-32秒，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 的升汞溶液消毒 25-35分鐘，無菌水漂洗4-5次后切開，將胚接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基KnPl上萌發(fā)成原球莖， 并進一歩分化成小苗；(3)人工授粉將步驟(2)分化出的小苗轉(zhuǎn)移到試管開花培養(yǎng)基KnP2上培養(yǎng)，待開花 后，選取生長健壯的開花株在無菌條件下進行人エ授粉；(4)無菌播種果實成熟后切開進行無菌播種，種子萌發(fā)形成原球莖，并進一歩形成完 整的小植株；(5)壯苗培養(yǎng)將小植株轉(zhuǎn)移到玻璃瓶壯苗培養(yǎng)基KnP3上培養(yǎng)，形成成苗；(6)試管苗出瓶移栽將栽有成苗的玻璃瓶轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗8-12天，光照度 1500 20001x，光照9-12小吋/天，然后將成苗從玻璃瓶中取出，洗浄根部的培養(yǎng)基，在 用木屑的基質(zhì)中栽培，保持適當(dāng)通風(fēng)和足夠的濕度，上述步驟中培養(yǎng)基組分及含量配比如下 種子萌發(fā)培養(yǎng)基KnPl MgS04 . 7H20230-260 mg/LKH2P04230-260 mg/LCa(NCXB) 2. 4H20950-1050 mg/L(NH4)2S04450-550 mg/L鐵鹽 FeS04 . 7H2027. 5-30. 0 mg/LNa2-EDTA37. 1- 37. 5 mg/LZnS04. 7H200. 330-0. 332 mg/LCuS04. 5H200. 035-0. 045 mg/LH3B030. 055-0. 057 mg/LNa 2MoO4. 2H200. 035-0. 039 mg/L甘氨酸1. 8-2. 2 mg/L畑酸0. 3-0. 5 mg/LVBl0. 8-1. 2 mg/LVB60. 4-0. 6 mg/L香蕉145-155g/L蔗糖180-220g/L瓊脂5. 0-7. 0 g/L ；試管開花培養(yǎng)基KnP2: KnPl培養(yǎng)基 6-BA1. 0 mg/LNAA0. 1 mg/L ；壯苗培養(yǎng)基KnP3: MS或Β5培養(yǎng)基 6-ΒΑ0. 4-0. 6 mg/LNAA0. 8-1. 2 mg/L ；上述步驟中所有的培養(yǎng)基PH 5. 1 5. 4，培養(yǎng)溫度U6士2) °C。 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霍山石斛種苗繁殖方法，其特征在于步驟(2)所述的種子萌發(fā)溫度為25 ^°C，步驟(3)所述的小苗的高度為2. 5 3. 5cm,所述的果實成熟期為60 70天，步驟C3)所述的開花期為55 63天，步驟( 所述的成苗高3 5cm，每叢有2 3個小苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種霍山石斛種苗的繁殖方法，本方法包括外植體的獲取、無菌播種、原球莖誘導(dǎo)、人工授粉、壯苗培養(yǎng)及試管苗移栽各步驟。選取生長健壯的開花的霍山石斛株作為母株，通過人工授粉獲得果實，再從成熟的果實中取出種子，用種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，使種子萌發(fā)成原球莖并進一步形成小苗，再將小苗用試管開花培養(yǎng)基培養(yǎng)，開花后在無菌條件下進行人工授粉，從成熟的果實中取出種子進行無菌播種，使種子長成小植株，形成可出瓶種植的種苗，進一步將種苗出瓶移栽，即可。本發(fā)明操作簡單，成本低廉，縮短霍山石斛果實的成熟期，高效、無病蟲害，能終年生產(chǎn)霍山石斛種子，成苗的移栽成活率可達96%以上，為霍山石斛種苗的繁殖開辟了一條新的途徑。
文檔編號A01H4/00GK102283120SQ20111019141
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者湯海榮 申請人:安徽康順名貴中草藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司