一種霍山石斛的快速繁殖方法
【專利摘要】一種霍山石斛的快速繁殖方法，取石斛果實(shí)內(nèi)種子或莖尖或帶腋芽的幼莖，果在純乙醇中浸一下，然后在酒精燈火焰上燃燒，然后用于接種；莖尖或幼莖經(jīng)清水沖洗后，分別用75％酒精、0.2％氯化汞(升汞)溶液進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3-4次，置于滅菌后的濾紙上吸干水分，于無菌條件下，將莖段剪成0.5-1.5cm的帶節(jié)小段，接種在培養(yǎng)基中，待種子萌發(fā)或莖尖和幼莖長成擬原球莖，進(jìn)行繼代培養(yǎng)大量增殖，然后將原球莖放在分化芽的培養(yǎng)基上，待芽條高2-3cm時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，待試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達(dá)6cm及以上時，出瓶移栽。
【專利說明】一種霍山石斛的快速繁殖方法
[0001]所屬領(lǐng)域:本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及霍山石斛的快速繁殖方法。
[0002]【背景技術(shù)】:霍山石斛是蘭科石解屬藥用植物，在自然條件下，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，發(fā)芽率極低。極低的繁殖率和人們長期無節(jié)制的采挖使野生鐵皮石斛資源日漸枯竭，市場急缺。解決霍山石斛市場需求問題的有效途徑就是要擴(kuò)大種植面積和種植地域，因此種苗來源尤其是優(yōu)質(zhì)種苗的篩選成為函待解決的問題。最有效的方法就是通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行人工快速繁優(yōu)良種苗。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
:本發(fā)明的目的在于提供一種石斛種苗快速繁殖方法，以挽救瀕危的石斛類物種，使之成為可再生藥源，并為石斛類GAP種植提供技術(shù)參考和實(shí)用價值。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
[0004]霍山石斛的快速繁殖方法:取石斛果實(shí)內(nèi)種子或莖尖或帶腋芽的幼莖，果在純乙醇中浸一下，然后在酒精燈火焰上燃燒，然后用于接種；莖尖或幼莖經(jīng)清水沖洗后，分別用75%酒精、0.2%氯化汞(升汞)溶液進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3-4次，置于滅菌后的濾紙上吸干水分，于無菌條件下，將莖段剪成0.5-1.5cm的帶節(jié)小段，接種在培養(yǎng)基中，待種子萌發(fā)或莖尖和幼莖長成擬原球莖，進(jìn)行繼代培養(yǎng)大量增殖，然后將原球莖放在分化芽的培養(yǎng)基上，待芽條高2-3cm時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，待試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達(dá)6cm及以上時，出瓶移栽。 [0005]具體地，取野外采集或雜交授粉所結(jié)的果實(shí)，在酒精燈燃燒滅菌后，在無菌條件下將果皮打開，將種子播種在花寶I號(N: P: K = 7: 6: 19)3g/L的瓊脂培養(yǎng)基上；而開裂果用尼龍布包裹散落種子，在0.2% HgCl2中消毒6-8min，無菌水沖洗干凈后播種在花寶I號(N:P:K = 7:6: 19) 3g/L的瓊脂培養(yǎng)基上；未成熟的果內(nèi)種子可播種在花寶I號3g/L+NAAlmg/L的瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000Lx，光照12h/d，培養(yǎng)基PH為5，培養(yǎng)8-12天種子由黃色轉(zhuǎn)綠，呈球形增大，基部有絲狀毛的原球莖，繼代培養(yǎng)在1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的瓊脂培養(yǎng)基上，30天后，分化出Icm小芽和0.5cm叢芽，又經(jīng)過1-2個月的培養(yǎng)可得到高約2-3cm芽條，轉(zhuǎn)入1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的生根壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)I個月后加強(qiáng)光照至4000LX，培養(yǎng)一個月，當(dāng)試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達(dá)6cm時，即可出瓶供移栽，出瓶時清除根系上的瓊脂，
3-5株一叢種植，種植基質(zhì)有鋸末、樹皮、苔薛和陶粒等，基質(zhì)要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消毒，栽后放在蔭蔽度70%大棚內(nèi)，棚內(nèi)溫度控制在20°C -28°C，注意保濕和排水，8-16天用1/10MS液噴施一次，待試管苗長出新根或新葉后便可定植。
[0006]具體地，將野外采集到的石斛莖尖或帶腋芽的幼莖切段滅菌后接種在l/2MS+NAAlmg/L+土豆泥3%十香蕉泥15%的瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度保持為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000LX，光照12h/d，培養(yǎng)基PH為5，培養(yǎng)30-60天，腋芽處可抽生新枝，新枝可切割重復(fù)培養(yǎng)，莖尖抽生新枝短呈叢芽狀，在上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，長成完整試管苗供移栽，出瓶時清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質(zhì)有鋸末、樹皮、苔鮮和陶粒等，基質(zhì)要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消毒，栽后放在大棚內(nèi)蔭蔽度70%，棚內(nèi)溫度控制在20°C _28°C，注意保濕和排水，8-16天用1/10MS液噴施一次?！揪唧w實(shí)施方式】:
[0007]實(shí)施例1:
[0008]I材料與方法
[0009]1.1供試材料
[0010]霍山石斛:選自廣南、思茅、浙江、盈江
[0011]1.2 方法
[0012]培養(yǎng)室溫度25±2°C，保存室溫度15-20°C，光照強(qiáng)度為1500-2000Lx，光照12h/d。培養(yǎng)基隨培養(yǎng)目的和不同發(fā)育階段有所不同。培養(yǎng)基PH為5。
[0013]外植體來源于石斛屬各種的果實(shí)內(nèi)種子或莖尖，果在純乙醇中浸一下，然后在酒精燈火焰上燃燒，然 后用于接種；莖尖或幼莖經(jīng)清水沖洗后，分別用75%酒精、0.2%氯化汞(升汞)溶液進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3-4次，置于滅菌后的濾紙上吸干水分，于無菌條件下，將莖段剪成0.5-1.5cm的帶節(jié)小段，接種在培養(yǎng)基中。
[0014]2 結(jié)果
[0015]2.1組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)
[0016]本發(fā)明為了保持遺傳性穩(wěn)定和規(guī)?；a(chǎn)目的，采用了種子無菌培養(yǎng)和莖尖、莖節(jié)分生組織培養(yǎng)兩種方式。
[0017]2.1.1種子無菌培養(yǎng)
[0018]種子來源于野外采集和自己雜交授粉所結(jié)的果實(shí)。野外采集的開裂果，收集種子用尼龍布包裹，在0.2%氯化汞中消毒7min，無菌水沖洗干凈后播種在花寶I號(N: P: K= 7:6: 19)3g/L的瓊脂培養(yǎng)基上。完整的果實(shí)在酒精燈燃燒滅菌后即可將果皮打開，將種子播種在上述培養(yǎng)基上。石斛屬種子大多呈黃色，培養(yǎng)約10天左右即可轉(zhuǎn)綠，增大，繼而長成頂端有葉尖或冒出的芽，基部有絲狀毛的原球莖，顯示種子萌發(fā)且萌發(fā)率較高(達(dá)95%以上)。
[0019]2.1.2分生組織培養(yǎng)
[0020]將野外采集到的石解屬莖尖或帶腋芽的幼莖切段滅菌后接種在l/2MS+NAAlmg/L+土豆泥3% +香蕉泥15%的瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30天左右，腋芽處可抽生新枝，新枝可切割重復(fù)培養(yǎng)，莖尖抽生新枝短呈叢芽狀。在此培養(yǎng)基上，它們可長成完整試管苗，供移栽。如果把莖尖和幼莖接種在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的瓊脂培養(yǎng)基上，外植體基部可分化出大量擬原球莖。擬原球莖在1/2MS+NAA1+ 土豆泥3% +香蕉泥15%的瓊脂培養(yǎng)基上，也可以長成大苗供移栽。
[0021]2.1.3繼代繁殖
[0022]石斛屬原球莖增殖速度25天至50天(依種量)平均可達(dá)1: 5_10倍。上一步驟原球莖和擬原球莖培養(yǎng)基培養(yǎng)30天左右，可得到10% Icm小芽和10% 0.5cm叢芽，又經(jīng)過1-2個月的培養(yǎng)可得到高約2-3cm芽條(占50%左右)，轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基(1/2MS十NAAl+土豆泥3%+香蕉泥15%)培養(yǎng)I個月后加強(qiáng)光照(4000LX及以上)，培養(yǎng)一個月左右，試管苗可達(dá)到移苗標(biāo)準(zhǔn)。整個生產(chǎn)周期月4.5個月到6個月。
[0023]2.1.4試管苗移栽
[0024]當(dāng)試管苗至少4-5片伸展葉根系正常，健康，高度達(dá)6cm左右時，即可出瓶供移栽，出瓶時要小心不能折傷葉片和根尖，清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質(zhì)有鋸末、樹皮、苔鮮和陶粒等，基質(zhì)要用20: I的水:甲醛密封消毒2411或用熱蒸汽消毒。栽后放在大棚內(nèi)蔭蔽度約70%，棚內(nèi)溫度控制在20°C -28°C，注意保濕和排水。待試管苗長出新根或新葉后，8-16天用1 /10MS液，噴施一次，促進(jìn)幼苗生長。
【權(quán)利要求】
1.一種霍山石斛的快速繁殖方法，其特征在于取石斛果實(shí)內(nèi)種子或莖尖或帶腋芽的幼莖，果在純乙醇中浸一下，然后在酒精燈火焰上燃燒，然后用于接種；莖尖或幼莖經(jīng)清水沖洗后，分別用75%酒精、0.2%氯化汞(升汞)溶液進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3-4次，置于滅菌后的濾紙上吸干水分，于無菌條件下，將莖段剪成0.5-1.5cm的帶節(jié)小段，接種在培養(yǎng)基中，待種子萌發(fā)或莖尖和幼莖長成擬原球莖，進(jìn)行繼代培養(yǎng)大量增殖，然后將原球莖放在分化芽的培養(yǎng)基上，待芽條高2-3cm時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，待試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達(dá)6cm及以上時，出瓶移栽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于取野外采集或雜交授粉所結(jié)的果實(shí)，完整的果實(shí)在酒精燈燃燒滅菌后，在無菌條件下將果皮打開，將種子播種在花寶I號((N: P: K= 7:6: 19) 3g/L的瓊脂培養(yǎng)基上；開裂果，用尼龍布包裹散落種子，在0.2% HgCl2中消毒6-8min，無菌水沖洗干凈后播種在花寶I號(N: P: K = 7: 6: 19)3g/L的瓊脂培養(yǎng)基上；未成熟的果內(nèi)種子可播種在花寶I號3g/L+NAAlmg/L的瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度25±2°C，光照強(qiáng)度為1500-2000LX，光照12h/d，培養(yǎng)基PH為5，培養(yǎng)8_12天種子由黃色轉(zhuǎn)綠，呈球形增大，基部有絲狀毛的原球莖，繼代培養(yǎng)在1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的瓊脂培養(yǎng)基上，30天后，分化出Icm小芽和0.5cm叢芽，又經(jīng)過1_2個月的培養(yǎng)可得到高約2-3cm芽條，轉(zhuǎn)入1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15 %的生根壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)I個月后加強(qiáng)光照至4000LX培養(yǎng)一個月，當(dāng)試管苗具4-S片伸展葉，根系正常，高度達(dá)6cm時，即可出瓶供移栽，出瓶時清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質(zhì)有鋸末、樹皮、苔鮮和陶粒等，基質(zhì)要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消毒，栽后放在蔭蔽度70%大棚內(nèi)，棚內(nèi)溫度控制在20°C _28°C，注意保濕和排水，8-16天用1/10MS液噴施一次，待試管苗長出新根或新葉后便可定植。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將野外采集到的石斛莖尖或帶腋芽的幼莖切段滅菌后接種在l/2MS+NAAlmg/L+ 土豆泥3% +香蕉泥15%的瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度保持為25±2°C，光 照強(qiáng)度為1500-2000LX，光照12h/d，培養(yǎng)基PH為5，培養(yǎng)30-60天，腋芽處可抽生新枝，新枝可切割重復(fù)培養(yǎng)，莖尖抽生新枝短呈叢芽狀，在上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，長成完整試管苗供移栽；也可接種在1/2MS或1/2MS+BA0.5+NAA0.2的瓊脂培養(yǎng)基上，外植體基部可分化出大量擬原球莖，擬原球莖在1/2MS+NAA1+土豆泥3% +香蕉泥15%的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天后，分化出Icm小芽和0.5cm叢芽，又經(jīng)過1_2個月的培養(yǎng)可得到高2-3cm芽條，再轉(zhuǎn)入1/2MS+NAA1+ 土豆泥3% +香蕉泥15%的生根壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)I個月，此時光照加強(qiáng)至4000LX，當(dāng)試管苗具4-5片伸展葉，根系正常，高度達(dá)6em時，即可出瓶供移栽，出瓶時清除根系上的瓊脂，3-5株一叢種植，種植基質(zhì)有鋸末、樹皮、苔醉和陶粒等，基質(zhì)要用20: I的水:甲醛密封消毒24h或用熱蒸汽消毒，栽后放在大棚內(nèi)蔭蔽度70%，棚內(nèi)溫度控制在20°C _28°C，注意保濕和排水，8-16天用1/10MS液噴施一次。
【文檔編號】A01H4/00GK104012401SQ201310061665
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月28日
【發(fā)明者】毛健, 姬中偉, 張敏, 牟穰, 陽志銳, 郭燕飛, 黎衛(wèi), 馮東陽, 鞏丹, 劉蕓雅 申請人:江南大學(xué)