專利名稱：以badh作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
運(yùn)用基因工程技術(shù)實現(xiàn)植物性狀的遺傳改良已經(jīng)成為培育植物新品種的一種新趨勢。在植物轉(zhuǎn)基因過程中，有效的選擇系統(tǒng)的采用是植物轉(zhuǎn)基因成功與否的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前最常用的選擇系統(tǒng)為除草劑選擇系統(tǒng)和抗生素選擇系統(tǒng)，盡管這兩種選擇系統(tǒng)已經(jīng)成功地用于多種植物的遺傳轉(zhuǎn)化，但這兩種選擇系統(tǒng)的采用卻是引發(fā)公眾對轉(zhuǎn)基因生物安全性關(guān)注的一個重要原因。一方面，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因植物中的抗生素抗性基因會轉(zhuǎn)移到環(huán)境微生物中，結(jié)果會導(dǎo)致抗性病原體的增加；另一方面，抗除草劑基因可能會傳給野生雜草，從而使雜草獲得除草劑抗性。雖然這些擔(dān)心還沒有科學(xué)依據(jù)，但公眾對選擇標(biāo)記基因的潛在危害的擔(dān)心會嚴(yán)重影響植物基因工程的發(fā)展，所以，建立安全有效的植物遺傳轉(zhuǎn)化的選擇系統(tǒng)，培育無抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物在基因工程育種上有著重要意義。當(dāng)前，解決轉(zhuǎn)基因植物中抗性標(biāo)記基因安全性問題有兩種途徑(1)轉(zhuǎn)化時仍使用抗性標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)基因植物再生成功后，在釋放大田前將抗性標(biāo)記基因剔除；( 發(fā)展安全性標(biāo)記基因用于植物遺傳轉(zhuǎn)化(趙艷，王慧中，于彥春等.轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的安全性新策略[J].遺傳，2003,25(1) :119-122)。由于前一種途徑操作復(fù)雜，不利于轉(zhuǎn)基因植物的快速商品化應(yīng)用，因此目前在植物轉(zhuǎn)基因操作上多傾向于采用安全性標(biāo)記基因的遺傳轉(zhuǎn)化法。甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因是甜菜堿代謝途徑中的關(guān)鍵酶，該酶能把對植物有毒的甜菜堿醛(又名甲酰甲基三甲基氯化胺，英文名Betaine aldehyde chloride ；分子式C5H12C1N0)轉(zhuǎn)化為有利的甜菜堿，是國際上公認(rèn)的安全性基因，并可兼作標(biāo)記基因使用。許多轉(zhuǎn)基因成果表明外源BADH基因的導(dǎo)入可提高植物合成甜菜堿的能力，并增強(qiáng)植物的抗旱性、耐鹽性等(Sakamoto A, Murata N. The role of glycine betaine in protection of plants from stress clues from transgenic plants[J]. Plant Cell and Evironment,2002,25 :163-171 ；付光明，蘇喬，吳畏等.轉(zhuǎn)BADH基因玉米的獲得及其耐鹽性[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)氣，2006，四(3) :344-347)。目前，以甜菜堿醛脫氫酶基因兼作標(biāo)記 SHEliini ^ (H Daniell, B Muthukumar, S B Lee. Marker free transgenic plants engineeringthe chloroplast genome without the use of antibiotic selection[J]. Current Genetics, 2001, 39 (2) :109-116)、二色胡枝子(楊曉紅· BADH 基因、反義 4CL 基因?qū)Χψ拥倪z傳轉(zhuǎn)化研究[D].北京林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2009)上取得了成功。盡管這種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)被證實是可行的，但是該種轉(zhuǎn)化方法是以甜菜堿醛提供選擇壓， 而甜菜堿醛則是一種價格極其昂貴的選擇劑，國際市場價高達(dá)1000美元/克左右，國內(nèi)價格也達(dá)2500 3000元/克，造成該種遺傳轉(zhuǎn)化成本極高，進(jìn)而限制了這種遺傳轉(zhuǎn)化方法的廣泛使用。因此，探索以甜菜堿醛脫氫酶基因兼作標(biāo)記基因的低成本遺傳轉(zhuǎn)化方法，對促進(jìn)這種安全性遺傳轉(zhuǎn)化方法的廣泛使用和轉(zhuǎn)基因成果的快速商品化應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
NaCl是種對植物組織、細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生毒害的化合物，其產(chǎn)生的Na+在細(xì)胞中大量積累會破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡并抑制細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝過程，使植物光合作用能力下降， 最終因碳饑餓而死亡。植物在含有一定濃度的NaCl培養(yǎng)基上則不能進(jìn)行正常的組織分化， NaCl濃度高時，植物會死亡。但NaCl價格低廉，每500克才6 8元人民幣，在市場上很容易買到。在以BADH基因兼作選擇標(biāo)記基因時，由NaCl提供選擇壓，以這種成本低廉的化合物作為選擇劑，對擬轉(zhuǎn)化的植物外植體，先將其置于含有不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上，觀察 NaCl對植物組織分化的影響程度，找到正好能抑制植物組織進(jìn)行分化的NaCl濃度，以此濃度作為植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中NaCl選擇劑濃度。由于轉(zhuǎn)入BADH基因的植物組織或細(xì)胞具有提高耐鹽性的特點(diǎn)，因此，在含有一定濃度的NaCl培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)BADH基因的細(xì)胞或組織能夠正常分化生長，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織不能分化，從而可獲得具有NaCl抗性的抗性芽，這些抗性芽可作為轉(zhuǎn)入外源基因的植株初始材料。以后，使這些抗性芽進(jìn)一步在含有一定濃度的NaCl培養(yǎng)基上生長發(fā)育，并對其進(jìn)行分子檢測，就能夠獲得以BADH基因兼做標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株。為了解決目前在采用BADH作為外源基因的標(biāo)記基因、以甜菜堿醛提供選擇壓時， 所造成的遺傳轉(zhuǎn)化成本極高的問題，本發(fā)明提供了一種以BADH作為標(biāo)記基因時的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)并同時提供了這種植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)的應(yīng)用。以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)，包含外源基因和選擇劑，其中，所述外源基因中含有作為選擇標(biāo)記基因的BADH，所述選擇劑為NaCl。上述技術(shù)方案所述的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)，其中，所述植物為二色胡枝子或煙草。上述技術(shù)方案中所述的以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用，包括通過轉(zhuǎn)基因方法將以BADH作為選擇標(biāo)記基因的外源基因?qū)胫参镏校渲?，還包括下述步驟(1)、在轉(zhuǎn)基因前的植物的組織或細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制植物組織或細(xì)胞進(jìn)行分化的NaCl濃度；O)、將獲得的可能轉(zhuǎn)化了外源基因的具有NaCl抗性的組織或細(xì)胞放置在步驟 (1)所確定的NaCl濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，能夠生長發(fā)育的即為轉(zhuǎn)入了 BADH作為選擇標(biāo)記基因的外源基因的材料。上述技術(shù)方案中所述的應(yīng)用，其中，以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)在二色胡枝子或煙草轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。上述技術(shù)方案中所述的應(yīng)用，包括通過轉(zhuǎn)基因方法將以BADH為標(biāo)記基因的外源基因轉(zhuǎn)入二色胡枝子中的步驟，其中，還包括下述步驟(1)、在轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子子葉節(jié)不定芽分化的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl， 確定正好能抑制二色胡枝子子葉節(jié)不定芽分化的NaCl濃度；O)、將上述轉(zhuǎn)入了外源基因的二色胡枝子子葉節(jié)置于含有步驟(1)中確定的 NaCl濃度的相同培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇；(3)、在轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子不定芽增殖和生根的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl， 確定正好能抑制二色胡枝子不定芽增殖和生根的NaCl濃度；
(4)、將步驟O)中獲得的耐鹽抗性芽在步驟(3)所確定的NaCl濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性增殖和生根，以加強(qiáng)選擇效果。上述技術(shù)方案中所述的應(yīng)用，包括通過轉(zhuǎn)基因方法將以BADH為標(biāo)記基因的外源基因轉(zhuǎn)入煙草葉片中的步驟，其中，還包括下述步驟(1)、在轉(zhuǎn)基因前煙草葉片不定芽分化的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制煙草葉片不定芽分化的NaCl濃度；(2)、將轉(zhuǎn)入了外源基因的煙草葉片置于含有步驟⑴中確定的NaCl濃度的相同培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇；(3)、在轉(zhuǎn)基因前煙草莖段增殖和組培苗生根的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制煙草莖段增殖和組培苗生根的NaCl濃度；(4)、將步驟O)中獲得的煙草耐鹽抗性芽在步驟(3)所確定的NaCl濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性莖段增殖和組培苗生根，以加強(qiáng)選擇效果。上述技術(shù)方案中任一技術(shù)方案所述的應(yīng)用，其中，在經(jīng)過含NaCl培養(yǎng)基進(jìn)行選擇之后還包括經(jīng)分子檢測進(jìn)行確定的步驟；所述分子檢測優(yōu)選為PCR檢測或Southern檢測。本發(fā)明具有以下有益效果1、由于本發(fā)明采用NaCl作為選擇劑，與現(xiàn)在常用的甜菜堿醛相比，大大降低了在轉(zhuǎn)基因試驗中的成本投入；2、當(dāng)采用NaCl作為選擇劑，以BADH基因為標(biāo)記基因進(jìn)行外源基因遺傳轉(zhuǎn)化時，可以使甜菜堿醛脫氫酶基因在轉(zhuǎn)基因工程中大規(guī)模使用，解決了目前采用除草劑選擇系統(tǒng)和抗生素選擇系統(tǒng)所造成的轉(zhuǎn)基因生物安全性問題，為建立安全有效的植物遺傳轉(zhuǎn)化的選擇系統(tǒng)提供了低成本的可能性；3、以NaCl作為選擇劑，以BADH基因兼作標(biāo)記基因?qū)χ参镞M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，所得轉(zhuǎn)基因植物容易很快通過國家轉(zhuǎn)基因安全評價，進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)。


1、圖1為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子子葉節(jié)在不含NaCl的培養(yǎng)基上；2、圖2為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子子葉節(jié)在含0. 8g/L NaCl的培養(yǎng)基上；3、圖3為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子在不含NaCl的培養(yǎng)基上的莖段增殖；4、圖4為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子在含0. 8g/L NaCl的培養(yǎng)基上的增殖表現(xiàn)；5、圖5為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子在不含NaCl的培養(yǎng)基上生根；6、圖6為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子在含0. 5g/L NaCl的培養(yǎng)基上的生根表現(xiàn)；7、圖7為在NaCl選擇劑上轉(zhuǎn)基因二色胡枝子子葉節(jié)抗性芽；8、圖8為二色胡枝子轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測結(jié)果；9、圖9為二色胡枝子轉(zhuǎn)化植株Southern檢測結(jié)果；10、圖10為轉(zhuǎn)基因前煙草葉片在不含NaCl的培養(yǎng)基上分化；11、圖11為轉(zhuǎn)基因前煙草葉片在含2g/L的NaCl的培養(yǎng)基上分化情況；12、圖12為轉(zhuǎn)基因前煙草莖段在不含NaCl的培養(yǎng)基中增殖與生根；13、圖13為轉(zhuǎn)基因前煙草莖段在含2g/L的NaCl的培養(yǎng)基上表現(xiàn)情況；14、圖14為在NaCl選擇劑上的轉(zhuǎn)基因煙草抗性芽；
15、圖15為煙草轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測結(jié)果；16、圖16為煙草轉(zhuǎn)化植株Southern檢測結(jié)果；17、圖17為轉(zhuǎn)入基因之后的二色胡枝子在含1. Og/L NaCl的培養(yǎng)基上的增殖表現(xiàn)；18、圖18為轉(zhuǎn)入基因之后的二色胡枝子在含1. Og/L NaCl的培養(yǎng)基上的生根表現(xiàn)；19、圖19為轉(zhuǎn)入基因之后的煙草在含3g/L的NaCl的培養(yǎng)基上表現(xiàn)。
具體實施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。以下實施例中植物轉(zhuǎn)基因部分、外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化部分的試驗操作按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的操作方法進(jìn)行操作，也可以按照引證文件中所述的方法進(jìn)行操作。實施例1:以BADH基因兼做標(biāo)記基因，以NaCl作為選擇劑對二色胡枝子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化過程一、確定抑制二色胡枝子子葉節(jié)不定芽分化的NaCl濃度根據(jù)二色胡枝子遺傳轉(zhuǎn)化過程采用的外植體為子葉節(jié)，子葉節(jié)在MS+6-BA 0. aiig/L+3%蔗糖+6g/L瓊脂的培養(yǎng)基上不定芽分化效果最好，以此培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置含有不同濃度NaCl的培養(yǎng)基，如 MS+6-BA0. ang/L+3% 蔗糖+6g/L 瓊脂+NaCl 0. 4g/L、MS+6_BA 0. ang/L+3% 蔗糖+6g/L 瓊脂 +NaClO. 6g/L、MS+6-BA 0. 2mg/L+3%蔗糖+6g/L 瓊脂+NaCl 0. 8g/L、MS+6_BA 0. 2mg/L+3% 蔗糖+6g/L瓊脂+NaCl 1. Og/L等系列培養(yǎng)基，觀察子葉節(jié)在這些培養(yǎng)基上的不定芽分化情況，由于二色胡枝子子葉節(jié)在MS+6-BA 0. ang/L+3%蔗糖+6g/L瓊脂+NaCl 0. 8g/L培養(yǎng)基上不能分化出不定芽，因此，認(rèn)為培養(yǎng)基中添加0. 8g -L-1NaCl就能抑制不定芽分化，該濃度就是以NaCl作為選擇劑對二色胡枝子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時的選擇壓。在子葉節(jié)不定芽分化效果最好的MS+6-BA 0. ang/L+3%蔗糖+6g/L瓊脂的培養(yǎng)基上加入0. Sg · I^1NaCl,得到選擇培養(yǎng)基，將以BADH為標(biāo)記基因的外源基因轉(zhuǎn)化后的二色胡枝子子葉節(jié)放置在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選；圖1為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子子葉節(jié)在不含NaCl的培養(yǎng)基上表現(xiàn)，圖2為轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子子葉節(jié)在含0. 8g/L NaCl的培養(yǎng)基上表現(xiàn)，圖7為在NaCl選擇劑上轉(zhuǎn)基因二色胡枝子子葉節(jié)抗性芽。二、了解NaCl濃度對二色胡枝子不定芽增殖和生根的影響二色胡枝子不定芽增殖適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1. 0mg/L+NAA 0. lmg/L，生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0. 4mg/ L+NAA0. 2mg/L0在這些培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加不同濃度的NaCl，觀察不定芽增殖或生根情況， 發(fā)現(xiàn)不定芽在含有0. Sg · L-1NaCl的培養(yǎng)基上不能增殖，在含有0. 5g · L^NaCl的培養(yǎng)基上不能生根，因此，確定培養(yǎng)基中添加0. Sg · L-1NaCl作為遺傳轉(zhuǎn)化獲得的抗性芽增值過程中的選擇壓，培養(yǎng)基中添加0. 5g · L-1NaCl作為二色胡枝子抗性芽生根培養(yǎng)過程中的選擇壓， 圖3為轉(zhuǎn)化前二色胡枝子在不含NaCl的培養(yǎng)基上的莖段增殖，圖5為轉(zhuǎn)化前二色胡枝子在不含NaCl的培養(yǎng)基上生根，圖4為轉(zhuǎn)化前二色胡枝子在含0. 8g/L NaCl的培養(yǎng)基上的增殖表現(xiàn)，圖6為轉(zhuǎn)化前二色胡枝子在含0. 5g/L NaCl的培養(yǎng)基上的生根表現(xiàn)，圖8為二色胡枝子轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測結(jié)果，圖9為二色胡枝子轉(zhuǎn)基因植株Southern檢測結(jié)果，其中在圖 8和圖9中ck+為陽性對照(即含有外源基因的質(zhì)粒DNA)，ck-為陰性對照(即非轉(zhuǎn)基因株)，B2 B3 B4 B5代表基因轉(zhuǎn)入后出現(xiàn)4個能在NaCl選擇劑上生長的株系，經(jīng)過PCR檢測，有條帶的B3、B5株系才是轉(zhuǎn)基因植株。圖17為轉(zhuǎn)入基因之后的二色胡枝子在含l.Og/ L NaCl的培養(yǎng)基上的莖段增值表現(xiàn)；圖18為轉(zhuǎn)入基因之后的二色胡枝子在含1. Og/L NaCl 的培養(yǎng)基上生根。實施例2 以BADH基因兼做標(biāo)記基因，以NaCl作為選擇劑對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化一、了解NaCl濃度對煙草葉片不定芽分化能力的影響煙草葉片分化的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+3%蔗糖+6g/L瓊脂。在此培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加0,0. 4,0. 8,1. 2,1. 6,2. 0,3. Og/L的NaCl，觀察煙草葉片在各種培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)， 確定在培養(yǎng)基中添加2g/L NaCl就能夠抑制煙草葉片分化不定芽；在煙草葉片分化的適宜培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 2. Omg/L+NAA 0. lmg/L+3%蔗糖+6g/ L瓊脂上加入2g · I^1NaCl,得到選擇培養(yǎng)基，將以BADH為標(biāo)記基因的外源基因轉(zhuǎn)化后的煙草葉片放置在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選；圖10為轉(zhuǎn)基因前煙草葉片在不含NaCl的培養(yǎng)基上分化，圖11為轉(zhuǎn)基因前煙草葉片在含2g/L的NaCl的培養(yǎng)基上分化情況，圖14為在NaCl選擇劑上的轉(zhuǎn)基因煙草葉片抗性芽；二、了解NaCl濃度對煙草莖段增殖能力、組培苗生根能力的影響煙草莖段增殖的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0. lmg/L+3%蔗糖+6g/L瓊脂；生根適宜培養(yǎng)基為 1/2MS+IAA0. 5mg/L+3%蔗糖+6g/L 瓊脂。分別配制添加有 0. 4,0. 8,1. 2,1. 6,2. 0,3. Og/ L的NaCl的莖段增殖、生根培養(yǎng)基，確定在培養(yǎng)基中添加2g/L的NaCl就能夠抑制煙草莖段進(jìn)一步分化增殖和組培苗生根。因此，以培養(yǎng)基中添加2g/L的NaCl作為煙草葉片遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇壓和抗性芽增殖生根過程中的選擇壓，圖12為轉(zhuǎn)基因前煙草莖段在不含NaCl 的培養(yǎng)基中增殖與生根，圖13為轉(zhuǎn)基因前煙草莖段在含ang/L的NaCl的培養(yǎng)基上表現(xiàn)情況，圖15為煙草轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測結(jié)果，圖16為煙草轉(zhuǎn)化植株Southern檢測結(jié)果，在圖15 和圖16中ck+為陽性對照，ck-為陰性對照(即非轉(zhuǎn)基因株)，Y2 Υ3Υ4 Υ6 Υ8代表基因轉(zhuǎn)入后出現(xiàn)5個能在NaCl選擇劑上生長的株系編號，經(jīng)過PCR檢測，有條帶的Υ4、Υ6株系才是轉(zhuǎn)基因植株。圖19為基因轉(zhuǎn)入之后的煙草植株在含3g/L的NaCl培養(yǎng)基上的表現(xiàn)。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)，包含外源基因和選擇劑，其特征在于所述外源基因中含有作為選擇標(biāo)記基因的BADH，所述選擇劑為NaCl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)，其特征在于所述植物為二色胡枝子或煙草。
3.權(quán)利要求1所述的以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用，包括通過轉(zhuǎn)基因方法將包含BADH作為選擇標(biāo)記基因的外源基因?qū)胫参镏?，其特征在于還包括下述步驟(1)、在轉(zhuǎn)基因前的植物的組織或細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制植物組織或細(xì)胞進(jìn)行分化的NaCl濃度；O)、將獲得的可能轉(zhuǎn)化了外源基因的具有NaCl抗性的組織或細(xì)胞放置在步驟(1)所確定的NaCl濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，能夠生長發(fā)育的即為轉(zhuǎn)入了 BADH作為選擇標(biāo)記基因的外源基因的材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)在二色胡枝子或煙草轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，包括通過轉(zhuǎn)基因方法將包含BADH作為標(biāo)記基因的外源基因轉(zhuǎn)入二色胡枝子中的步驟，其特征在于還包括下述步驟(1)、在轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子子葉節(jié)不定芽分化的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制二色胡枝子子葉節(jié)不定芽分化的NaCl濃度；O)、將上述轉(zhuǎn)入了外源基因的二色胡枝子子葉節(jié)置于含有步驟(1)中確定的NaCl濃度的相同培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇；(3)、在轉(zhuǎn)基因前二色胡枝子不定芽增殖和生根的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制二色胡枝子不定芽增殖和生根的NaCl濃度；G)、將步驟O)中獲得的耐鹽抗性芽在步驟(3)所確定的NaCl濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性增殖和生根，以加強(qiáng)選擇效果。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，包括通過轉(zhuǎn)基因方法將包含BADH作為標(biāo)記基因的外源基因轉(zhuǎn)入煙草葉片中的步驟，其特征在于，還包括下述步驟(1)、在轉(zhuǎn)基因前煙草葉片不定芽分化的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制煙草葉片不定芽分化的NaCl濃度；O)、將轉(zhuǎn)入了外源基因的煙草葉片置于含有步驟(1)中確定的NaCl濃度的相同培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇；(3)、在轉(zhuǎn)基因前煙草莖段增殖和組培苗生根的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，確定正好能抑制煙草莖段增殖和組培苗生根的NaCl濃度；G)、將步驟O)中獲得的煙草耐鹽抗性芽在步驟(3)所確定的NaCl濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性莖段增殖和組培苗生根，以加強(qiáng)選擇效果。
7.根據(jù)權(quán)利要求3 6中任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于在經(jīng)過含NaCl培養(yǎng)基進(jìn)行選擇之后還包括經(jīng)分子檢測進(jìn)行確定的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述分子檢測為PCR檢測或Southern檢測。
全文摘要
本發(fā)明以BADH作為標(biāo)記基因的植物轉(zhuǎn)基因選擇系統(tǒng)及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該系統(tǒng)以BADH作為外源基因的標(biāo)記基因，以NaCl作為選擇劑；其應(yīng)用包括下述步驟(1)確定正好能抑制植物組織分化的NaCl濃度；(2)將含有BADH基因的外源基因轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞或組織中；(3)將轉(zhuǎn)化了BADH標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因組織或細(xì)胞放置在步驟(1)所確定的NaCl濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，能夠生長發(fā)育的即為可能轉(zhuǎn)化了BADH標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因組織或細(xì)胞，經(jīng)分子檢測進(jìn)行確定。本發(fā)明具有大大降低了在轉(zhuǎn)基因試驗中的成本投入；解決了轉(zhuǎn)基因生物安全性問題，為建立安全有效的植物遺傳轉(zhuǎn)化的選擇系統(tǒng)提供了低成本選擇的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A01H5/00GK102304506SQ201110260718
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者冷平生, 劉雯, 楊曉紅, 解小娟, 陳曉陽 申請人:北京農(nóng)學(xué)院