專(zhuān)利名稱(chēng)：一種油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬種苗組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及是一種油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法。
背景技術(shù)：
油棕屬多年生單子葉植物，屬于棕櫚科油棕屬，是重要的熱帶木本油料作物，我國(guó)油棕主要分布在海南、兩廣南部、臺(tái)灣南部、云南南部等地區(qū)。油棕是世界上生產(chǎn)效率最高的產(chǎn)油植物，產(chǎn)油量是椰子的2 3倍，花生的7 8倍，大豆的9 10倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它油料作物，所以被人們譽(yù)為“世界油王”。棕櫚油是世界油脂市場(chǎng)的一個(gè)重要組成部分，目前它在世界油脂總產(chǎn)量中的比例超過(guò)30%，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)及化工工業(yè)，并成為生物能源(生物柴油)最有競(jìng)爭(zhēng)潛力的生產(chǎn)原料。目前我國(guó)已經(jīng)成為世界最大的棕櫚油消費(fèi)國(guó)，而 且主要依賴(lài)進(jìn)口。油棕的繁殖方法通常是傳統(tǒng)的種子進(jìn)行繁殖，但種子繁殖所需周期長(zhǎng)，種子發(fā)芽過(guò)程中如處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致發(fā)芽率低、出苗不整齊等不利因素，而且需要消耗大量的人力、物力和財(cái)力。由于油棕樹(shù)只有一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，基本不分枝，難以實(shí)現(xiàn)無(wú)性繁殖，國(guó)內(nèi)油棕的組織培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。上世紀(jì)80年代在油棕組織培養(yǎng)方面取得了些成績(jī)，但從幼胚誘導(dǎo)出愈傷組織并分化成植株是國(guó)內(nèi)空白，之后中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院有油棕組織培養(yǎng)的類(lèi)似報(bào)道，但無(wú)公開(kāi)詳細(xì)的關(guān)鍵技術(shù)，故有必要尋找一種快捷而創(chuàng)新、有效而經(jīng)濟(jì)的方法提高繁育種苗的品質(zhì)和數(shù)量，加速油棕產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法，以油棕的幼胚為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)分化獲得再生植株，解決目前油棕增殖分化率低、增殖緩慢、不能滿(mǎn)足大規(guī)模種植的問(wèn)題，有效地縮短種苗組織培養(yǎng)時(shí)間，具有很強(qiáng)的可實(shí)施性與重復(fù)性，為油棕工廠化、規(guī)?；绲於肆己玫睦碚摶A(chǔ)，為油棕產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供先決條件。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案一種油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法，其步驟如下I、取開(kāi)花期后6 12周采集的皮半紅色、未發(fā)育到硬核期的種果，洗凈后取出種核中帶幼胚的胚乳塊，消毒后用無(wú)菌水沖洗，然后將幼胚接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，暗室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 27°C，培養(yǎng)60 85天，得到愈傷組織。所述誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基是以N6I培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性碳3. Og/L、蔗糖30g/L、卡拉膠4. 5g/L、2，4_D
2.5mg/L。2、將愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度23 27°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500 20001ux ;培養(yǎng)時(shí)間為75 85天，待不定芽生成后再進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，繼代增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間與不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程相同。所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以N6I培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性碳3. Og/L、鹿糖 30g/L、卡拉膠 4. 5g/L、NAA0. 3mg/L。3、將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的不定芽切下，接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度23 27°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500 20001ux，培養(yǎng)25 30天后便開(kāi)始生根。所述生根培養(yǎng)基是以R68培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性碳3. Og/L、蔗糖30g/L、卡拉膠4.5g/L、NAA 7mg/L、PBZ 9 mg/L、氨節(jié)青霉素 I. 2mg/L。4、將生根數(shù)為5條根以上的生根苗進(jìn)行開(kāi)蓋煉苗，使其與空氣接觸，溫度23 27°C下生長(zhǎng)5 10d，然后用流水洗去再生苗根上的培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，薄膜覆蓋，每5d澆一次水以保持土壤濕潤(rùn)，獲得油棕再生植株。所述栽培基質(zhì)是將蛭石、珍珠巖和營(yíng)養(yǎng)土按質(zhì)量比為1:1:2的比例混合。
所述生苗根在消毒栽培基質(zhì)中培養(yǎng)的條件為溫度為25V，光照周期為12h/d，光照強(qiáng)度為20001ux 25001ux。本發(fā)明以油棕的幼胚為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)分化獲得再生植株，解決目前油棕增殖分化率低、增殖緩慢、不能滿(mǎn)足大規(guī)模種植的問(wèn)題，有效地縮短種苗組織培養(yǎng)時(shí)間，具有工藝簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期短、生根率高、移栽成活率高等特點(diǎn)，為油棕工廠化、規(guī)?；绲於肆己玫幕A(chǔ)，為油棕產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供先決條件。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一I、取開(kāi)花期后6 12周采集的大小基本一致、皮半紅色，未發(fā)育到硬核期的種果80個(gè)，在室內(nèi)用自來(lái)水洗凈后除去果肉，切開(kāi)種核取出帶胚的胚乳塊，先用70%的酒精浸泡幾秒鐘，然后用滅菌水沖洗3遍，再用飽和漂白粉消毒液消毒10 30分鐘，消毒后的材料均須用無(wú)菌水沖洗3遍后將接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基(N6I培養(yǎng)基+活性碳3. Og/L+蔗糖30g/L+卡拉膠4. 5g/L+2, 4-D 2. 5mg/L),暗室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24°C，培養(yǎng)80天，得到愈傷組織，結(jié)果見(jiàn)表I。其中N6I培養(yǎng)基可參照Ruslan Abdullah在2004年第七期0717~3458發(fā)表的 Electronic Journal of Biotechnology 的 Immature embryo: A useful tool foroil palm (Elaeis guineensis Jacq. ) genetic transformation studies 一文,其配制方法相同。2、取愈傷組織50個(gè)接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6I培養(yǎng)基+活性碳3. 0g/L+蔗糖30g/L +卡拉膠4. 5g/L+NAA0. 3mg/L)中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度26°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度17001ux ;培養(yǎng)時(shí)間為78天，生成不定芽，結(jié)果見(jiàn)表I。待不定芽生成后再進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，繼代增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間與不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程相同。3、將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的不定芽切下，取30個(gè)不定芽接種到生根培養(yǎng)基(R68培養(yǎng)基+ 活性碳 3. 0g/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉膠 4. 5g/L+NAA 7mg/L+PBZ 9 mg/L+ 氨節(jié)青霉素 I. 2mg/L)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度27°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度16001UX，培養(yǎng)25 30天后便開(kāi)始生根，生根個(gè)數(shù)見(jiàn)表I。4、取生根數(shù)為5條根以上的生根苗20棵進(jìn)行開(kāi)蓋煉苗，使其與空氣接觸，溫度26°C下生長(zhǎng)6d，然后用流水洗去再生苗根上的培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)(將蛭石、珍珠巖和營(yíng)養(yǎng)土按質(zhì)量比為1: 1:2的比例混合)中培養(yǎng)，置于溫度為25°C，光照周期為12h/d,光照強(qiáng)度為24001UX的生長(zhǎng)室內(nèi)，薄膜覆蓋，每5d澆一次水以保持土壤濕潤(rùn)，獲得油棕再生植株，移栽成活結(jié)果見(jiàn)表I。實(shí)施例二I、取開(kāi)花期后6 12周采集的大小基本一致、皮半紅色，未發(fā)育到硬核期的種果80個(gè)，在室內(nèi)用自來(lái)水洗凈后除去果肉，切開(kāi)種核取出帶胚的胚乳塊，先用70%的酒精浸泡2 10分鐘，然后用滅菌水沖洗3遍，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10 20分鐘，消毒后的材料均須用無(wú)菌水沖洗3遍后將接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基(N6I培養(yǎng)基+活性碳
3.Og/L+蔗糖30g/L+卡拉膠4. 5g/L+2, 4-D 2. 5mg/L),暗室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)75天，得到愈傷組織，結(jié)果見(jiàn)表I。其中N6I培養(yǎng)基可參照Ruslan Abdullah在2004年第七期0717~3458 發(fā)表的 Electronic Journal of Biotechnology 的 Immature embryo: A usefultool for oil palm (Elaeis guineensis Jacq. ) genetic transformation studies 一文，其配制方法相同。2、取愈傷組織50個(gè)接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6I培養(yǎng)基+活性碳3. 0g/L+蔗糖30g/L +卡拉膠4. 5g/L+NAA0. 3mg/L)中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度25°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度20001ux;培養(yǎng)時(shí)間為80天，生成不定芽，結(jié)果見(jiàn)表I。待不定芽生成后再進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，繼代增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間與不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程相同。3、將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的不定芽切下，取30個(gè)不定芽接種到生根培養(yǎng)基(R68培養(yǎng)基+ 活性碳 3. 0g/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉膠 4. 5g/L+NAA 7mg/L+PBZ 9 mg/L+ 氨節(jié)青霉素 I. 2mg/L)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度25V，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度19001ux，培養(yǎng)25 30天后便開(kāi)始生根，生根個(gè)數(shù)見(jiàn)表I。4、取生根數(shù)為5條根以上的生根苗20棵進(jìn)行開(kāi)蓋煉苗，使其與空氣接觸，溫度25°C下生長(zhǎng)8d，然后用流水洗去再生苗根上的培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)(將蛭石、珍珠巖和營(yíng)養(yǎng)土按質(zhì)量比為1: 1:2的比例混合)中培養(yǎng)，置于溫度為25°C，光照周期為12h/d,光照強(qiáng)度為23001UX的生長(zhǎng)室內(nèi)，薄膜覆蓋，每5d澆一次水以保持土壤濕潤(rùn)，獲得油棕再生植株，移栽成活結(jié)果見(jiàn)表I。實(shí)施例三I、取開(kāi)花期后6 12周采集的大小基本一致、皮半紅色，未發(fā)育到硬核期的種果80個(gè)，在室內(nèi)用自來(lái)水洗凈后除去果肉，切開(kāi)種核取出帶胚的胚乳塊，先用70%的酒精浸泡幾秒鐘，然后用滅菌水沖洗3遍，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10 20分鐘，消毒后的材料均須用無(wú)菌水沖洗3遍后將接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基(N6I培養(yǎng)基+活性碳3. 0g/L+蔗糖30g/L+卡拉膠4. 5g/L+2, 4-D 2. 5mg/L),暗室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27°C，培養(yǎng)65天，得到愈傷組織，結(jié)果見(jiàn)表I。其中N6I培養(yǎng)基可參照Ruslan Abdullah在2004年第七期0717~3458發(fā)表的 Electronic Journal of Biotechnology 的 Immature embryo: A useful tool foroil palm (Elaeis guineensis Jacq. ) genetic transformation studies 一文,其配制方法相同。2、取愈傷組織50個(gè)接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6I培養(yǎng)基+活性碳3. Og/L+蔗糖30g/L +卡拉膠4. 5g/L+NAA0. 3mg/L)中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度23°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度19001ux ;培養(yǎng)時(shí)間為83天，生成不定芽，結(jié)果見(jiàn)表I。待不定芽生成后再進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，繼代增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間與不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程相同。3、將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的不定芽切下，取30個(gè)不定芽接種到生根培養(yǎng)基(R68培養(yǎng)基+ 活性碳 3. Og/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉膠 4. 5g/L+NAA 7mg/L+PBZ 9 mg/L+ 氨節(jié)青霉素 I. 2mg/L)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度23°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度20001ux，培養(yǎng)25 30天后便開(kāi)始生根，生根個(gè)數(shù)見(jiàn)表I。4、取生根數(shù)為5條根以上的生根苗20棵進(jìn)行開(kāi)蓋煉苗，使其與空氣接觸，溫度23°C下生長(zhǎng)9d，然后用流水洗去再生苗根上的培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)(將蛭石、 珍珠巖和營(yíng)養(yǎng)土按質(zhì)量比為1: 1:2的比例混合)中培養(yǎng)，置于溫度為25°C，光照周期為12h/
d,光照強(qiáng)度為21001ux的生長(zhǎng)室內(nèi)，薄膜覆蓋，每5d澆一次水以保持土壤濕潤(rùn)，獲得油棕再生植株，移栽成活結(jié)果見(jiàn)表I。對(duì)照試驗(yàn)分兩組進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，其中對(duì)照組一I、愈傷組織培養(yǎng)基采用N6I培養(yǎng)基+2. 4-D2. 5mg/L+NAA0. 3 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠4. 5g/L+活性碳3g/L。其它步驟同實(shí)施例一。2、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)采用將N6I培養(yǎng)基+6-BA0. 5 g/L+活性碳3g/L+蔗糖30g/L +卡拉膠4. 5g/L，pH為5. 8-6. 5。培養(yǎng)12個(gè)星期，誘導(dǎo)不定芽，其它步驟同實(shí)施例一。3、生根培養(yǎng)基采用R68培養(yǎng)基+活性碳3g/L +蔗糖30g/L +卡拉膠4. 5g/L+氨芐青霉素L2mg/L +NAA7mg/L+PBZ3mg/L，pHS5.8-6.5。其它步驟同實(shí)施例一。培養(yǎng)4個(gè)星期形成種苗。4、煉苗及移栽過(guò)程同實(shí)施例一。對(duì)照組二 I、愈傷組織培養(yǎng)基采用N6I培養(yǎng)基+2. 4-D2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉膠4. 5g/L+活性碳3g/L，其它步驟同實(shí)施例一。2、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)采用將N6I基本培養(yǎng)基+6-BA0. 2 g/L+活性碳3g/L+蔗糖30g/L+卡拉膠4. 5g/L，pH為5. 8-6. 5。培養(yǎng)12個(gè)星期，誘導(dǎo)不定芽，其它步驟同實(shí)施例一。3、生根培養(yǎng)基采用R68基本培養(yǎng)基+活性碳3g/L +蔗糖30g/L +卡拉膠4. 5g/L+氨芐青霉素I. 2mg/L +NAA7mg/L+PBZ6mg/L, pH為5· 8-6. 5。其它步驟同實(shí)施例一。培養(yǎng)4個(gè)星期形成種苗。4、煉苗及移栽過(guò)程同實(shí)施例一。表I不同培養(yǎng)基的油棕組織培養(yǎng)的結(jié)果對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于，其步驟如下 1)、取開(kāi)花期后6 12周采集的皮半紅色、未發(fā)育到硬核期的種果，洗凈后取出種核中帶幼胚的胚乳塊，消毒后用無(wú)菌水沖洗，然后將幼胚接種到誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，暗室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 27°C，培養(yǎng)60 85天，得到愈傷組織；所述誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基是以N6I培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性碳3. Og/L、蔗糖30g/L、卡拉膠4. 5g/L、2，4_D2.5mg/L ； 2)、將愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度23 27°C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500 20001ux ;培養(yǎng)時(shí)間為75 85天，待不定芽生成后再進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，繼代增殖培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間與不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程相同；所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以N6I培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性碳3. Og/L、鹿糖 30g/L、卡拉膠 4. 5g/L、NAA0. 3mg/L ； 3)、將經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的不定芽切下，接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度23 270C，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500 20001UX，培養(yǎng)25 30天后便開(kāi)始生根；所述生根培養(yǎng)基是以R68培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加活性碳3. Og/L、蔗糖30g/L、卡拉膠4. 5g/L、NAA 7mg/L、PBZ 9 mg/L、氨節(jié)青霉素 I. 2mg/L ； 4 )、將生根數(shù)為5條根以上的生根苗進(jìn)行開(kāi)蓋煉苗，使其與空氣接觸，溫度23 27 °C下生長(zhǎng)5 10d，然后用流水洗去再生苗根上的培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒的栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，薄膜覆蓋，每5d澆一次水以保持土壤濕潤(rùn)，獲得油棕再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于所述栽培基質(zhì)是將蛭石、珍珠巖和營(yíng)養(yǎng)土按質(zhì)量比為1:1:2的比例混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于所述生苗根在消毒栽培基質(zhì)中培養(yǎng)的條件為溫度為25 V，光照周期為12h/d，光照強(qiáng)度為20001UX 25001ux。
全文摘要
本發(fā)明屬種苗組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及是一種油棕組織培養(yǎng)的繁殖方法，是取油棕幼胚為外植體，滅菌后誘導(dǎo)愈傷組織；將愈傷組織進(jìn)行不定芽培養(yǎng)，之后進(jìn)行增殖培養(yǎng)；將增殖培養(yǎng)后的不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)；將生根苗煉苗，移栽到消毒栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，獲得油棕再生植株。本發(fā)明以油棕的幼胚為外植體,通過(guò)誘導(dǎo)分化獲得再生植株，解決目前油棕增殖分化率低、增殖緩慢、不能滿(mǎn)足大規(guī)模種植的問(wèn)題，有效地縮短種苗組織培養(yǎng)時(shí)間，具有工藝簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期短、生根率高、移栽成活率高等特點(diǎn)，為油棕工廠化、規(guī)模化育苗奠定了良好的基礎(chǔ)，為油棕產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供先決條件。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102715091SQ20121023963
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者周煥起, 楊耀東, 沈雁, 陳衛(wèi)軍, 馬子龍 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所, 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所