專利名稱：一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種冬蟲夏草培養(yǎng)方法，更具體的說涉及一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc 又名蟲草,系麥角菌科蟲草屬真菌中國(guó)被毛孢寄生蝙蝠蛾屬昆蟲幼蟲體內(nèi)形成的蟲菌復(fù)合體，是我國(guó)特有珍稀名貴中藥材。具有補(bǔ)肺益腎、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、陽痿遺精、病后體虛、老年慢性咳嗽等疾病。冬蟲夏草主產(chǎn)于我國(guó)西藏、青海、云南、四川和甘肅等省區(qū)海拔3500-5200m局部高寒山區(qū)草甸地帶。天然資源十分有限，近年來采挖過度造成生態(tài)環(huán)境的惡化，天然資源日趨枯竭。因此， 人工栽培冬蟲夏草勢(shì)在必行。人工培殖的關(guān)鍵是冬蟲夏草菌能否侵染寄主昆蟲，進(jìn)入到寄主的體腔內(nèi)，并在體腔中繁殖生長(zhǎng)，最后產(chǎn)生子座，形成冬蟲夏草藥材。野生冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾幼蟲的的感染途徑為，蝙蝠蛾屬昆蟲幼蟲在野生環(huán)境中通過體表或食道感染中華被毛孢菌，但是上述方法，染菌率低，周期長(zhǎng)，而且不能進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。目前寄主人工感染方法為將中國(guó)被毛孢孢子菌液采用涂抹于寄主體表、注射到寄主體內(nèi)、灌注或通過飼料從寄主食道進(jìn)入寄主體內(nèi)。涂永勤等在期刊《食用菌》2010 (3)中發(fā)表的《蝠蛾屬幼蟲感染冬蟲夏草茵的實(shí)驗(yàn)研究》公開了多種以中華被毛孢孢子菌液作為冬蟲夏草寄主感染的菌種材料。但是上述方法存在中華被毛孢菌種分離純化難度大，且幼蟲染菌率和染菌后存活率較低的問題。專利申請(qǐng)人在國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“冬蟲夏草寄主幼蟲適應(yīng)飼料的機(jī)理及其生態(tài)適合度評(píng)估”(編號(hào)為81072997)、“冬蟲夏草寄主昆蟲擬青霉病的分子流行病學(xué)研究”(編號(hào)為81173479)和國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目“人工繁育冬蟲夏草寄主幼蟲發(fā)育變異的影響因素研究”(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)為30901964)的資助下對(duì)冬蟲夏草寄主感染的菌種材料進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種采用冬蟲夏草菌皮代替中國(guó)被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料。具體內(nèi)容為一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，所述用于冬蟲夏草寄主飼養(yǎng)中寄主感染的菌種材料為冬蟲夏草菌皮。所述的冬蟲夏草菌皮為冬蟲夏草采挖出來時(shí)，冬蟲夏草僵蟲菌核表面覆蓋的菌膜。所述冬蟲夏草菌皮的提取方法為將挖出來且未經(jīng)過任何清理的冬蟲夏草清理掉表面的顆粒狀土塊以及雜物，保留冬蟲夏草僵蟲菌核表面與僵蟲菌核外形相似的一層與土混合的菌膜外殼；將與土混合的菌膜外殼剝落收集得到冬蟲夏草菌皮。一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，為將上所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料的溶混懸液體灌注到冬蟲夏草寄主蟲口中或拌到冬蟲夏草寄主飼料中，對(duì)冬蟲夏草寄主進(jìn)行飼養(yǎng)。一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，為將上所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料或粉末直接拌入冬蟲夏草寄主飼料或直接喂到冬蟲夏草寄主蟲口。一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，所述的寄主感染的方法為將權(quán)利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體注射到蟲體中。
一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，為將上所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體直接噴淋到冬蟲夏草寄主蟲體上或?qū)⒍x夏草寄主感染的菌種材料混入到冬蟲
夏草寄主的培養(yǎng)基中。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是本發(fā)明提供的采用冬蟲夏草菌皮代替中國(guó)被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料的方法，菌種材料的制備成本更低；更重要的是，冬蟲夏草菌作為菌種材料，冬蟲夏草寄主的存活率和感染率較接種中國(guó)被毛孢孢子菌菌液，寄主幼蟲的感染率和存活率都顯著提高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料的制備方法采集長(zhǎng)成的冬蟲夏草，具體的采集方法為撬起冬蟲夏草周圍的表土，不能觸及冬蟲夏草的僵蟲菌核表面；剝落冬蟲夏草周圍的土塊，得到被一層外形與僵蟲菌核形態(tài)相似的菌膜與泥土混合物構(gòu)成的外殼包裹的冬蟲草夏草；收集上述菌膜與泥土混合物構(gòu)成的外殼，得到冬蟲夏草菌皮。將冬蟲夏草菌皮用水超聲融化，得到冬蟲夏草菌皮的混懸液，過濾混懸液中的泥土，得到第一次水溶液；將過濾出的泥土用水洗滌，過濾得到第二次水溶液，合并第一次和第二次水溶液，濃度為每Ig菌皮制備3mL菌皮水溶液，得到用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料。實(shí)施例2冬蟲夏草寄主的感染方法的考察I從已感染中國(guó)被毛孢菌的蝙蝠蛾幼蟲活體得到蝙蝠蛾幼蟲體液，將體液用接種針粘上在無菌條件下涂抹(即接種)于平板培養(yǎng)基上。將涂抹了帶菌活幼蟲體液的平板培養(yǎng)基置于8 18°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。3天后，每天觀察一次，及時(shí)汰除雜菌，10 16天后方在平板培養(yǎng)基的接種處形成深灰、繼而轉(zhuǎn)變成棕黃乃至黑色的中國(guó)被毛孢菌落。將分離出來的中國(guó)被毛孢菌，從平培養(yǎng)基板上轉(zhuǎn)入行的培養(yǎng)基上，置18°C條件下培養(yǎng)，接種體中心呈黃褐色、菌落堅(jiān)硬，有稀疏平貼的纖細(xì)菌絲，進(jìn)而形成冬蟲夏草菌的分生孢子。用無菌水將其孢子洗下，配制成孢子懸浮液；濃度為每毫升105個(gè)孢子。收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼蟲,2400條蟲六等分放于8個(gè)Im2干凈的經(jīng)消毒的搪瓷盤中，每組300條蟲，上一些經(jīng)消毒的干樹葉，以利蟲子活動(dòng)和隱蔽，噴一些蒸餾水保持濕度。先用無菌的珠芽寥、胡蘿卜、紅苕、菜葉飼喂7d,使蟲體恢復(fù)生長(zhǎng)。然后清除剩余全部食用。停喂2 3d后，取上述任意3組飼喂孢子懸浮液噴淋過的珠芽寥、胡蘿卜、紅苕、菜葉，作為對(duì)照組I ;取任意4組飼喂實(shí)施例I得到的冬蟲夏草寄主感染的菌種材料噴淋過的珠芽寥、胡蘿卜、紅苕、菜葉，作為實(shí)驗(yàn)組I ;每天清除剩余物，第2d用同樣方法飼喂，連喂30d，觀察蟲生長(zhǎng)和活動(dòng)情況，這時(shí)剔除那些生長(zhǎng)健壯。活動(dòng)敏捷，反應(yīng)靈敏的蟲，然后上覆IOcm幼蟲生長(zhǎng)區(qū)采回的高山草甸土及草皮，控制溫度在I 5°C，繼續(xù)飼喂，分別在I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和I年后，分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組個(gè)一組挖出蟲體，計(jì)算感染僵化的成活的和死亡的蟲體數(shù)；得到混合飼料飼喂方法組數(shù)據(jù)。按I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和I年的時(shí)間階段定期收集幼蟲群體內(nèi)隨機(jī)抽取10頭幼蟲進(jìn)行調(diào)查。將幼蟲體表面消毒后，采用特制的工具在無菌條件下抽取微量的血淋巴制片，鏡檢觀察，記錄血淋巴內(nèi)菌體的形態(tài)。追蹤觀察幼蟲僵化情況。在對(duì)菌體進(jìn)行觀察的同時(shí)，抽取微量帶菌血淋巴涂抹在滅菌PDA培養(yǎng)基平板上,置于18°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每日一次取出培養(yǎng)皿鏡檢觀察菌體生長(zhǎng)發(fā)育的狀態(tài)，或挑取菌體及其培養(yǎng)物制片觀察。待涂布菌體處形成菌落，挑取菌落表面的菌絲體制片鏡檢觀察；具體結(jié)果如表I所示。表I不同菌種材料幼蟲的感染情況 菌種材料檢測(cè)時(shí)間接種幼蟲數(shù)/頭存活幼蟲數(shù)/頭感染幼蟲數(shù)/頭感染率/%
對(duì)照組I I個(gè)月后 3002908930.68
3 個(gè)月后 30024511546.93
6 個(gè)月后 30020816880. 10
_I 年后_300_ITl_155_90. 64_
實(shí)驗(yàn)組I I個(gè)月后 300 284 231 81.333 個(gè)月后 300 221 210 95.026 個(gè)月后 300 187 187 100.00_I 年后_300_180_180_100. 00_結(jié)果表明，寄主幼蟲感染冬蟲夏草菌是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要一定的時(shí)間，才能完成整個(gè)侵染過程。由表I可知，采用實(shí)施例I所述的用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，寄主幼蟲接種I個(gè)月后即可感染上冬蟲夏草菌。接種6個(gè)月后感染達(dá)高峰，感染率為100%。實(shí)施例3冬蟲夏草寄主的感染方法的考察2收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼蟲，2400條蟲六等分放于8個(gè)Im2干凈的經(jīng)消毒的搪瓷盤中，每組300條蟲，上一些經(jīng)消毒的干樹葉，以利蟲子活動(dòng)和隱蔽，噴一些蒸餾水保持濕度。先用無菌的珠芽寥、胡蘿卜、紅苕、菜葉飼喂7d,使蟲體恢復(fù)生長(zhǎng)。將上述6組，清洗蟲子表面，用3%雙氧水作表面消毒后；選取任意4組，用微型注射槍，在顯微鏡下將實(shí)施例2制備的孢子懸浮液通過蟲體表面的微孔道注入蟲體血腔內(nèi)，作為對(duì)照組II ;選取任意4組，用微型注射槍，在顯微鏡下將實(shí)施例I所述的用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料通過蟲體表面的微孔道注入蟲體血腔內(nèi)，作為實(shí)驗(yàn)組II ；30d后觀察蟲生長(zhǎng)和活動(dòng)情況，這時(shí)剔除那些生長(zhǎng)健壯，活動(dòng)敏捷，反應(yīng)靈敏的蟲，然后上覆IOcm幼蟲生長(zhǎng)區(qū)采回的高山草甸土及草皮，控制溫度在I 5°C，繼續(xù)飼喂，分別在I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和I年后，挖出蟲體，計(jì)算感染僵化的、成活的和死亡的蟲體數(shù)；得到注射方法組數(shù)據(jù)。按I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和I年的時(shí)間階段定期收集幼蟲群體內(nèi)隨機(jī)抽取10頭幼蟲進(jìn)行調(diào)查。采用是實(shí)施例2所述的檢測(cè)方法，具體結(jié)果如表2所示。表2不同菌種材料幼蟲的感染情況
權(quán)利要求
1.一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，其特征在于所述用于冬蟲夏草寄主飼養(yǎng)中寄主感染的菌種材料為冬蟲夏草菌皮。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，其特征在于所述的冬蟲夏草菌皮為冬蟲夏草采挖出來時(shí)，冬蟲夏草僵蟲菌核表面覆蓋的菌膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于冬蟲夏草寄主感染得菌種材料，其特征在于所述冬蟲夏草菌皮的提取方法為將挖出來且未經(jīng)過任何清理的冬蟲夏草清理掉表面的顆粒狀土塊以及雜物，保留冬蟲夏草僵蟲菌核表面與僵蟲菌核外形相似的一層與土混合的菌膜外殼；將與土混合的菌膜外殼剝落收集得到冬蟲夏草菌皮。
4.一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法為將權(quán)利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料的溶混懸液體灌注到冬蟲夏草寄主蟲口中或拌到冬蟲夏草寄主飼料中，對(duì)冬蟲夏草寄主進(jìn)行飼養(yǎng)。
5.一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法為將權(quán)利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料或粉末直接拌入冬蟲夏草寄主飼料或直接喂到冬蟲夏草寄主蟲口。
6.一種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法為將權(quán)利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體注射到蟲體中。
7.—種冬蟲夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于所述的寄主感染的方法為將權(quán)利要求3所述冬蟲夏草寄主感染的菌種材料溶混懸液體直接噴淋到冬蟲夏草寄主蟲體上或?qū)⒍x夏草寄主感染的菌種材料混入到冬蟲夏草寄主的培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種采用冬蟲夏草菌皮代替中國(guó)被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料。具體內(nèi)容為一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料，所述用于冬蟲夏草寄主飼養(yǎng)中寄主感染的菌種材料為冬蟲夏草菌皮；本發(fā)明提供的采用冬蟲夏草菌皮代替中國(guó)被毛孢孢子菌作為冬蟲夏草寄主染菌的菌種材料的方法，菌種材料的制備成本更低；更重要的是，冬蟲夏草菌作為菌種材料，冬蟲夏草寄主的存活率和感染率較接種中國(guó)被毛孢孢子菌菌液，寄主幼蟲的感染率和存活率都顯著提高。
文檔編號(hào)A01K67/033GK102792855SQ20121033858
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者劉飛, 張德利 申請(qǐng)人:重慶市中藥研究院