冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢蘋(píng)果酸脫氫酶b、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及兩個(gè)來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與三羧酸循環(huán)用于檸檬酸合成中的蘋(píng)果酸脫氫酶B，編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用。所述蘋(píng)果酸脫氫酶B的氨基酸序列與SEQ?ID?No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其編碼基因核苷酸序列與SEQ?ID?No.2所示序列具有90％以上同源性。本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)催化蘋(píng)果酸制備相應(yīng)的草酰乙酸的酶對(duì)應(yīng)編碼基因的表達(dá)，賦予宿主蘋(píng)果酸脫氫酶B的高表達(dá)性，為擴(kuò)大蘋(píng)果酸脫氫酶B的生物應(yīng)用提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢蘋(píng)果酸脫氫酶B、編碼基因及其應(yīng)用
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【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一個(gè)來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與三羧酸循環(huán)用于檸檬酸合成中的蘋(píng)果酸脫氫酶B (Malic dehydrogenase),編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用。
(二)

【背景技術(shù)】
[0002]冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬蟲(chóng)夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲(chóng)體)。冬蟲(chóng)夏草是一類(lèi)珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲(chóng)夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲(chóng)夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，主治腎虛，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥。現(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲(chóng)夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。
[0003]冬蟲(chóng)夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無(wú)性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無(wú)性階段的冬蟲(chóng)夏草菌，因而冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的鑒定非常重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲(chóng)夏草資源調(diào)查、無(wú)性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢已被證明是冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型存在形式，具有與天然冬蟲(chóng)夏草相同的活性成分和藥效。
[0004]但是，對(duì)冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢中蘋(píng)果酸脫氫酶的研究幾乎為空白，尤其在參與三羧酸循環(huán)用于檸檬酸合成中的蘋(píng)果酸脫氫酶的研究上。
[0005]蘋(píng)果酸脫氫酶(EC: 1.1.1.37)是催化L-蘋(píng)果酸脫氫變成草酰乙酸的酶。它以NAD+作為電子受體。廣義上也包括以NAD+或NADP+作為受體而生成丙酮酸和碳酸的蘋(píng)果酸酶(EC: 1.1.1.38-40)。與NADP+也有弱反應(yīng)，也可將其它羥酸脫氫。廣泛存在于線粒體、細(xì)菌細(xì)胞膜上，為三羧酸循環(huán)中的一種酶。由于酶的來(lái)源不同，其某些性質(zhì)也不一樣。蘋(píng)果酸在蘋(píng)果酸脫氫酶催化下脫氫生成草酰乙酸，脫下的氫由NAD+接受生成NADH+H+。再生的草酰乙酸可再次進(jìn)入三羧酸循環(huán)用于檸檬酸的合成。
[0006]蘋(píng)果酸脫氫酶普遍存在于動(dòng)物，植物，細(xì)菌各種生物體中，具有高度的保守性。蘋(píng)果酸脫氫酶不僅參與眾多生理活動(dòng)，包括C4循環(huán)，呼吸作用，脂肪酸的氧化，TCA循環(huán)等，而且在種子萌發(fā)，植物生長(zhǎng)，花粉發(fā)育，果實(shí)發(fā)育，植物抗逆等方面發(fā)揮重要作用。
[0007]1993年,F Cendrin等人從極端嗜鹽古細(xì)菌Haloarcula marismortui中分離和測(cè)序了一個(gè)編碼的酶蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的基因。該酶是由303個(gè)氨基酸組成，其分子量為32638道爾頓。
[0008]2008年，朱文滴等人以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)腸道cDNA文庫(kù)蘋(píng)果酸脫氫酶(cMDH)EST序列為基礎(chǔ)，采用末端快速擴(kuò)增法(RACE)，從健康雌性草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)腸道細(xì)胞RNA中獲得139Ibp的草魚(yú)腸道cMDH的cDNA序列(NCBI登錄號(hào):EU569765)。結(jié)果顯示:該序列包含62bp的5’非編碼區(qū)(5，-UTR)，330bp的3’非編碼區(qū)(3’ -UTR)，典犁加尾信號(hào)AATAA位于polyA起點(diǎn)上游16bp。開(kāi)放閱讀框ORF長(zhǎng)999bp，共編碼333個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白等電點(diǎn)為6.67，大小為36kDa。
[0009]2008年，姚玉欣等人從蘋(píng)果果實(shí)中分離了 cyMDH的全長(zhǎng)cDNA序列，該序列含有一個(gè)996bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)。序列同源性分析表明Mal-cyMDH與其他物種cyMDH有較高的同源性。原核表達(dá)得到一個(gè)37kD左右的融合蛋白，酶活測(cè)定表明該酶主要催化合成蘋(píng)果酸。
[0010]2011年，李倩等人以大腸桿菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到蘋(píng)果酸脫氫酶(mdh)編碼基因mdh，構(gòu)建了重組菌pET-28a-mdh/BL21并成功表達(dá)了蘋(píng)果酸脫氫酶，大小約36000。選用Ni柱親和層析法純化具有活性的蘋(píng)果酸脫氫酶，純化后比酶活達(dá)到112.5U/mg，純化倍數(shù)達(dá)2.62倍，回收率為59%。
[0011]2011年，G Nava等人從豬帶絳蟲(chóng)胞漿中克隆到了一個(gè)蘋(píng)果酸脫氫酶的完整編碼序列。這個(gè)蘋(píng)果酸脫氫酶的cDNA序列從豬帶絳蟲(chóng)基因組項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，編碼332個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量大約為36.5kDa。
[0012]2012年 ，李文爽等人利用電子克隆技術(shù)獲得大豆中的蘋(píng)果酸脫氫酶基因cDNA序列，并對(duì)基因及其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步克隆該基因、解決植物磷高效基因數(shù)量缺乏等問(wèn)題提供依據(jù)。結(jié)果表明，大豆中的蘋(píng)果酸脫氫酶基因(GmMDHl)cDNA序列長(zhǎng)度為1574bp，開(kāi)放閱讀框1230bp，編碼409個(gè)氨基酸殘基。
[0013]2013年，YY Chang等人從Thermus thermophilus的基因組中擴(kuò)增到了一個(gè)蘋(píng)果酸脫氫酶基因，并且克隆島pET21b載體上進(jìn)行了表達(dá)。該蛋白在大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中以可溶形式存在。
[0014]但是，目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中目前還檢索不到中國(guó)被毛孢中蘋(píng)果酸脫氫酶的基因相關(guān)信息。
(三)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明目的在于針對(duì)以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問(wèn)題，對(duì)“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢在參與三羧酸循環(huán)用于檸檬酸合成中的酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，提供了 “百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢在參與三羧酸循環(huán)用于檸檬酸合成中的一種蘋(píng)果酸脫氫酶B、以及編碼的基因及其應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0017]一種中國(guó)被毛孢參與三羧酸循環(huán)的檸檬酸合成中的蘋(píng)果酸脫氫酶B (Malicdehydrogenase),所述酶的氨基酸序列與SEQ ID N0.1所示序列具有90%以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
[0018]優(yōu)選的，所述蘋(píng)果酸脫氫酶B氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(記為mdhB蛋白)；該酶可催化蘋(píng)果酸制備相應(yīng)的草酰乙酸。
[0019]本發(fā)明述蘋(píng)果酸脫氫酶B來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢。
[0020]由蘋(píng)果酸經(jīng)過(guò)蘋(píng)果酸脫氫酶B的催化獲得對(duì)應(yīng)草酰乙酸的路徑如下所示:

【權(quán)利要求】
1.一種冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢蘋(píng)果酸脫氫酶B，其特征在于所述脫氫酶B的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.如權(quán)利要求1所述的蘋(píng)果酸脫氫酶B在生物催化蘋(píng)果酸制備草酰乙酸中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:以含蘋(píng)果酸脫氫酶B基因的重組工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體用pH8.0磷酸鹽緩沖液懸浮，超聲破碎，離心，取上清液為催化劑，以0.1M蘋(píng)果酸水溶液為底物，以3.75mM的NADH水溶液為輔酶，于pH值為7.0的磷酸緩沖液中，37°C下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上清液獲得含草酰乙酸的混合液。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述底物的用量以蘋(píng)果酸質(zhì)量計(jì)，所述蘋(píng)果酸的初始濃度為0.05M，所述催化劑的體積用量以破碎前濕菌體的質(zhì)量計(jì)為4.lg/L，所述NADH 的用量為 3.75 μ mol/L。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備:將含蘋(píng)果酸脫氫酶B的重組工程菌接種于含終濃度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)物，以體積濃度2%的接種量轉(zhuǎn)接于含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、250r/min培養(yǎng)至菌體濃度0D600為0.6~0.8，向培養(yǎng)物中加入終濃度0.05mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集濕菌體，將濕菌體在功率40%、破Is停Is條件下超聲破碎，離心，取上清液即為催化劑。
6.一種編碼權(quán)利要求1所述蘋(píng)果酸脫氫酶B的基因。
7.如權(quán)利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
8.如權(quán)利要求6或7所述的編碼基因在構(gòu)建能夠生物催化蘋(píng)果酸制備草酰乙酸的基因工程菌中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:構(gòu)建含有所述蘋(píng)果酸脫氫酶B基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有蘋(píng)果酸脫氫酶B基因的菌體細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104130986SQ201410309468
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】柳志強(qiáng), 鄭裕國(guó), 林善, 薛亞平, 吳暉, 李邦良, 許靜, 許峰, 袁水金, 王鴻艷 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司