用于增強(qiáng)植物中的線蟲(chóng)抗性的組合物和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于在植物或其部分中增強(qiáng)對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的抗性或耐受性的方法和組合物。提供了當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)賦予對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的抗性或耐受性的核苷酸序列、以及包含由這些核苷酸序列編碼的多肽的組合物、以及包含這些核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物及其部分。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于增強(qiáng)植物中的線蟲(chóng)抗性的組合物和方法
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[0003] 優(yōu)先權(quán)聲明
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[0005] 本發(fā)明涉及用于控制植物中的線蟲(chóng)有害生物的組合物和方法。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 線蟲(chóng)是構(gòu)成動(dòng)物界中最大且最成功的門(mén)之一的細(xì)長(zhǎng)的對(duì)稱(chēng)的蛔蟲(chóng)。很多線蟲(chóng)物種 是獨(dú)立生存并且以細(xì)菌為食的，而其他線蟲(chóng)已進(jìn)化為植物和動(dòng)物（包括人）的有害生物或 寄生蟲(chóng)。
[0008] 植物的線蟲(chóng)有害生物是造成每年幾十億美元經(jīng)濟(jì)損失的原因。線蟲(chóng)植物有害生物 以超過(guò)2, 000種蔬菜、水果、以及觀賞植物的莖、芽、葉、以及特別是根為食，在世界范圍內(nèi) 造成估計(jì)$1000-1250億的作物損失。線蟲(chóng)存在于整個(gè)美國(guó)（US)，但是在南部以及西部的 溫暖潮濕地區(qū)以及在沙壤土中是一個(gè)主要的問(wèn)題。大多數(shù)在經(jīng)濟(jì)上有害的植物線蟲(chóng)有害生 物屬屬于墊刃目（order Tylenchida)的異皮線蟲(chóng)（Heterderidae)科，并且包括胞囊線蟲(chóng) [異皮線蟲(chóng)屬（genera Heterodera)和球胞囊屬（genera Globodera)，例如，大豆胞囊線蟲(chóng) (大豆異皮線蟲(chóng)（Heterodera glycines)，SCN)和馬鈴薯胞囊線蟲(chóng)（白線蟲(chóng)（G. pallida)和 金線蟲(chóng)（G.rostochiensis)]和根結(jié)線蟲(chóng)（root-knot nematode)(根結(jié)線蟲(chóng)屬）。
[0009] 根結(jié)線蟲(chóng)侵染數(shù)千種不同的植物物種，包括蔬菜、水果以及行間作物。已知胞 囊線蟲(chóng)侵染煙草、谷物、甜菜、馬鈴薯、稻、玉米、大豆、以及很多其他作物。甜菜胞囊線蟲(chóng) (Heterodera schachtii)(BCN)主要攻擊甜菜，并且禾谷胞囊線蟲(chóng)（Heterodera avenae) 是谷物的有害生物。玉米胞囊線蟲(chóng)（Heterodera zeae)以玉米為食，并且馬鈴薯金線蟲(chóng) (Globodera rostochiensis)和白線蟲(chóng)以馬鈴薯為食。大豆胞囊線蟲(chóng)（SCN)存在于美國(guó)每 個(gè)產(chǎn)大豆的州，并且每年引起的總大豆產(chǎn)量損失估計(jì)將近$10億。一旦SCN存在于大田里， 便不能使用已知方法可行地根除之。盡管大豆是受SCN攻擊的主要經(jīng)濟(jì)作物，然而SCN還 攻擊總計(jì)約50種宿主，包括大田作物、蔬菜、觀賞植物、以及雜草。
[0010] 棉花根結(jié)線蟲(chóng)（RKN)是一種破壞性線蟲(chóng)，它在棉花植物的根上形成蟲(chóng)癭。病原 體是南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita(Kofoid and White)Chitwood)，一種可侵 染多種植物物種的線蟲(chóng)。在受侵染的植物中營(yíng)養(yǎng)物和水?dāng)z取有所減少，并且植物可易受 病原體的影響，特別是枯萎病。因此，被RKN侵染的植物的產(chǎn)量有所減少。僅在美國(guó)， 在2004年，估計(jì)有10. 93 %的棉花產(chǎn)量損失是歸因于RKN(布拉辛格姆（Blasingame) 和帕特爾（Patel)，美國(guó)產(chǎn)棉區(qū)大會(huì)會(huì)議記錄（Proceedings of the Beltwide Cotton Conferences) 1:259-262 (2005)。RKN廣泛分布于整個(gè)美國(guó)產(chǎn)棉區(qū)。減輕RKN損害的方法包 括將棉花作物與不易受影響的作物進(jìn)行輪作并且施用昂貴的殺線蟲(chóng)劑。然而，對(duì)于棉花種 植者來(lái)說(shuō)減少由于RKN所致的產(chǎn)量損失和作物損害的最有效方式是種植RKN抗性的棉花栽 培品種。
[0011] 線蟲(chóng)損害的跡象包括葉的發(fā)育不良和黃化，以及在炎熱時(shí)節(jié)植物的萎蔫。然而，線 蟲(chóng)（包括SCN)可能導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，同時(shí)沒(méi)有明顯的地上癥狀。例如，SCN對(duì)植物的 侵染可能導(dǎo)致矮化的或發(fā)育不良的根、根上的固氮根瘤的數(shù)目減少，和/或使根更易受其 他土傳植物有害生物或病原體的攻擊。
[0012] 與很多病毒和細(xì)菌病原體相比，關(guān)于線蟲(chóng)-植物相互作用的分子基礎(chǔ)知之甚少， 這限制了適用于控制線蟲(chóng)的可用方法。適用于控制線蟲(chóng)植物有害生物的化學(xué)劑包括現(xiàn)存最 老的殺線蟲(chóng)劑類(lèi)別有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯，它們靶向乙酰膽堿酯酶。咪唑衍生物如苯并 咪唑通過(guò)結(jié)合微管蛋白發(fā)揮它們的殺線蟲(chóng)作用。左旋咪唑用作煙堿乙酰膽堿受體的激動(dòng) 齊IJ，并且阿維菌素用作谷氨酸門(mén)控的氯離子通道的不可逆性激動(dòng)劑。不幸的是，存在某些弱 化的線蟲(chóng)侵染，這些線蟲(chóng)侵染難以（如果有可能的話）用現(xiàn)有的控制措施來(lái)根除。此外，現(xiàn) 有可用的線蟲(chóng)控制劑在功效、成本以及環(huán)境安全方面具有缺點(diǎn)。例如，在美國(guó)用于在很多高 投入、高價(jià)值的作物中控制線蟲(chóng)的有效播前土壤熏蒸劑甲基溴由于環(huán)境和人的健康問(wèn)題而 被逐步淘汰。然而，因?yàn)榧谆逡烟峁┯糜诰€蟲(chóng)控制的投資的可靠回報(bào)，所以如果不鑒別替 代物，則可能對(duì)很多高價(jià)值作物的種植者產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，環(huán)境問(wèn)題，主要為地下水污 染、臭氧消耗、以及食物中的殺有害生物劑殘留，已促使美國(guó)環(huán)境保護(hù)署從市場(chǎng)上去除涕滅 威、DGBCP、以及其他毒性殺線蟲(chóng)劑。已使用物理控制措施（如日曬和熱水處理）、生物控制 措施（例如，作物輪作）、以及綜合手段來(lái)減輕由植物線蟲(chóng)有害生物引起的損害，但單一方 法或措施的組合不是一致有效的。
[0013] 線蟲(chóng)抗性種質(zhì)和轉(zhuǎn)基因植物也被認(rèn)為是化學(xué)控制措施的替代或補(bǔ)充。例如，表 達(dá)蛋白酶抑制劑的轉(zhuǎn)基因植物顯示針對(duì)胞囊線蟲(chóng)和根結(jié)線蟲(chóng)的一定抗性（厄溫（Urwin) 等人，1997.植物雜志（Plant J. ) 12:455-461)。這類(lèi)替代控制措施的使用需要更多線 蟲(chóng)-植物相互作用的知識(shí)，以實(shí)現(xiàn)滿意的結(jié)果。若干研究已生成基因表達(dá)數(shù)據(jù)，表明很多 宿主植物基因響應(yīng)于線蟲(chóng)侵入而向上或向下調(diào)節(jié)（薩卡希奇（Szakasits)等人，2009. 植物雜志57:771-784 ;帕特霍夫（Puthoff)等人，2003.植物雜志33:911-921 ;貝特克 (Bethke)等人，2009.美國(guó)科學(xué)院院刊（Proc. Natl. AcacL Sci. ) 106:8067-8072 ;史蒂潘 諾娃（St印anova)等人，2007.植物細(xì)胞雜志（Plant Cell) 19:2169-2185;以及基利恩 (Kilian)等人，2007.植物雜志50:347-363)。然而，這些研究未能幫助技術(shù)人員預(yù)測(cè)，（如 果有的話）這類(lèi)基因能否成功地用于控制線蟲(chóng)，尤其是用于在轉(zhuǎn)基因植物中部署的嵌合基 因構(gòu)建體。
[0014] 因此，本發(fā)明通過(guò)提供包含重組核酸分子和它們所編碼的多肽的組合物和方法用 于控制植物中的線蟲(chóng)有害生物侵染來(lái)克服本領(lǐng)域中的缺點(diǎn)。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 以上所列出的需要是通過(guò)本發(fā)明來(lái)滿足的，在多個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了控制 經(jīng)濟(jì)上重要的線蟲(chóng)有害生物的新組合物和方法。具體地說(shuō)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)本發(fā)明的至少一種重 組核酸分子（其調(diào)節(jié)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)）的轉(zhuǎn)基因植物和/或植物部分減小了線蟲(chóng) 有害生物存活、生長(zhǎng)以及繁殖的能力或者限制了對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植物的線蟲(chóng)相關(guān)的損害或損 失。本發(fā)明還涉及在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)度表達(dá)或者具有減少表達(dá)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因 線蟲(chóng)抗性植物并且涉及單獨(dú)使用該轉(zhuǎn)基因植物或與其他線蟲(chóng)控制措施組合使用而在減小 的環(huán)境影響下賦予最大的線蟲(chóng)控制效率的方法。具有過(guò)度表達(dá)或受抑制（例如，與對(duì)照相 t匕，減少的數(shù)量和/或降低的活性等）的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物和植物部分具有對(duì) 線蟲(chóng)有害生物侵染更大的耐受性或抗性。例如，可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因大豆植物控制經(jīng)濟(jì)上重要 的線蟲(chóng)有害生物大豆胞囊線蟲(chóng)（大豆異皮線蟲(chóng)），這些轉(zhuǎn)基因大豆植物過(guò)度表達(dá)本發(fā)明的 一種蛋白質(zhì)或者包含減少本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的本發(fā)明的一種核酸分子。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種控制線蟲(chóng)植物有害生物的方法，該方法包 括使該線蟲(chóng)有害生物與一種轉(zhuǎn)基因植物或其部分接觸，將調(diào)節(jié)一種或多種具有SEQ ID N0:29-42、SEQIDN0:135-209、SEQIDN0:243-260、SEQIDN0:665-1046、或其任意組合的 氨基酸序列的多肽的表達(dá)的重組核酸分子并入到其基因組中，從而控制該線蟲(chóng)植物有害生 物。在本發(fā)明的另一方面，該重組核酸分子能夠產(chǎn)生一種包含反義鏈和有義鏈的雙鏈RNA， 其中該反義鏈與編碼一種或多種多肽的核苷酸序列的一部分互補(bǔ)，該部分包含與SEQ ID NO: 1-28、SEQ ID NO: 43-134、SEQ ID NO: 210-242、SEQ ID NO: 261-664、或其任意組合的核 苷酸序列中的任一個(gè)具有實(shí)質(zhì)上一致性的約18個(gè)至約25個(gè)連續(xù)核苷酸，基本上由其組成， 由其組成。
[0018] 在本發(fā)明的又一方面，提供了一種重組核酸分子，該核酸分子包含可操作地連接 至在植物或植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子上的一種核苷酸序列，其中該核苷酸序列是：(a) SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-664 中任一 項(xiàng)的一種核苷酸序列；(b)編碼一種包含 SEQ ID N0:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO: 243_260、SEQ ID NO:665-1046中任一項(xiàng)的氨基酸序列的多肽的一種核苷酸序列；（c)與 以上（a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一種核苷酸序列；(d)在嚴(yán)格雜 交條件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；(e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn) 并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；或者（f) (a)至 (e)的核苷酸序列的任意組合。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種多肽，該多肽包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046、或其任意組合中任一項(xiàng)的氨基酸序 列，基本上由其組成，或由其組成。
[0020] 在本發(fā)明的又一方面，提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，該方法包括將一 種重組核酸分子引入到植物細(xì)胞中，該重組核酸分子包含可操作地連接至在植物或植物 細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子上的一種核苷酸序列，其中該核苷酸序列是：（a)SEQ ID N0:1-28、 SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644 中任一項(xiàng)的一種核苷酸序 列；（b)編碼一種包含 SEQ ID NO:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO:243-260、SEQ ID N0:665-1046的氨基酸序列中任一項(xiàng)的氨基酸序列的多肽的一種核苷酸序列；（c)與以上 (a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一種核苷酸序列；(d)在嚴(yán)格雜交條 件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；(e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性 而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；或者（f) (a)至（e)的 核苷酸序列的任意組合，從而產(chǎn)生可以再生一種對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物具有增強(qiáng)的抗性的植 物的一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明的又一方面提供了一種產(chǎn)生對(duì)由線蟲(chóng)植物有害生物的侵染具有增強(qiáng)的抗 性的大豆植物的方法，該方法包括以下步驟：(a)使本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物與其自身或另一 種植物雜交以產(chǎn)生包含本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體的種子；(b)從所述種子生長(zhǎng)后 代植物以產(chǎn)生一種對(duì)于由線蟲(chóng)植物有害生物的侵染具有增強(qiáng)的抗性的植物。
[0022] 在本發(fā)明的另外的方面，提供了包含一種核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植 物以及其部分，該核酸分子包含本發(fā)明的核苷酸序列中的一種或多種；并且提供了使用它 們來(lái)控制、抑制、和/或降低線蟲(chóng)植物有害生物的侵染性的方法。進(jìn)一步提供了本發(fā)明的多 肽以及使用這些多肽來(lái)控制、抑制、和/或降低線蟲(chóng)植物有害生物的侵染性、侵染性和/或 胞囊發(fā)育的方法，該方法包括使線蟲(chóng)植物有害生物與有效量的一種或多種多肽接觸。在一 些實(shí)施例中，使該線蟲(chóng)植物有害生物與有效量的一種多肽接觸包括使該線蟲(chóng)植物有害生物 與一種包含本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物接觸。
[0023] 本發(fā)明另外提供一種作物，該作物包括在農(nóng)田中栽種在一起的多個(gè)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基 因植物。在一些方面，本發(fā)明提供了一種提高與線蟲(chóng)植物有害生物接觸的植物作物的產(chǎn)量 的方法，該方法包括栽培包含本發(fā)明的核酸分子的多個(gè)植物作為植物作物，其中所述植物 作物的該多個(gè)植物對(duì)線蟲(chóng)侵染具有增強(qiáng)的抗性，從而提高所述植物作物的產(chǎn)量。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種提高與線蟲(chóng)植物有害生物接觸的作物中的產(chǎn)量的方法，該 方法包括使該線蟲(chóng)植物有害生物與有效量的本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的殺線蟲(chóng)組合物接觸， 其中該作物的產(chǎn)量有所提高。
[0025] 在下文本發(fā)明的描述中更詳細(xì)地闡述本發(fā)明的這些方面和其他方面。
[0026] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0027] 圖1是適用于用本發(fā)明的重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物和/或植物細(xì)胞的一個(gè)二元載 體。
[0028] 圖2是適用作植物和/或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照的一個(gè)空載體。
[0029] 圖3是適用于用本發(fā)明的重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物和/或植物細(xì)胞的一個(gè)二元載 體。
[0030] 圖4是適用作植物和/或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照的一個(gè)空載體。
[0031] 圖5是包含可以用于表達(dá)本發(fā)明的分離的多核苷酸序列的At6669啟動(dòng)子和⑶S 內(nèi)含子的修飾的PGI二元質(zhì)粒（PQYN6669)的示意圖。RB-T-DNA右邊界；LB-T-DNA左邊界； MCS-多克隆位點(diǎn)；RE-任何限制酶；NOS pro =胭脂堿合酶啟動(dòng)子；NPT-II =新霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶基因 ；NOS ter =胭脂堿合酶終止子；聚-A信號(hào)（聚腺苷酸化信號(hào)）；⑶S內(nèi)含子-GUS 報(bào)道基因（編碼序列和內(nèi)含子）。在一些實(shí)施例中，將本發(fā)明的分離的多核苷酸序列克隆到 該載體中，同時(shí)置換GUS內(nèi)含子報(bào)道基因。
[0032] 圖6是包含用于表達(dá)本發(fā)明的分離的多核苷酸序列的At6669啟動(dòng)子的修飾的pGI 二元質(zhì)粒（pQFN或pQFNc)的示意圖。RB-T-DNA右邊界；LB-T-DNA左邊界；MCS-多克隆位 點(diǎn)；RE-任何限制酶；NOS pro =胭脂堿合酶啟動(dòng)子；NPT-II =新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；N0S ter =胭脂堿合酶終止子；聚-A信號(hào)（聚腺苷酸化信號(hào)）；GUS內(nèi)含子-GUS報(bào)道基因（編 碼序列和內(nèi)含子）。在一些實(shí)施例中，將本發(fā)明的分離的多核苷酸序列克隆到該載體的MCS 中。
[0033] 圖7是pQXNc質(zhì)粒的示意圖，該質(zhì)粒是用于表達(dá)本發(fā)明的一些實(shí)施例的分離的多 核苷酸序列的修飾的PGI二元質(zhì)粒。RB-T-DNA右邊界；LB-T-DNA左邊界；NOS pro =胭脂 堿合酶啟動(dòng)子；NPT-II=新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 ；NOS ter=胭脂堿合酶終止子；RE=任何 限制酶；聚-A信號(hào)（聚腺苷酸化信號(hào)）；35S-35S啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，將該分離的多 核苷酸序列克隆到該載體的MCS(多克隆位點(diǎn)）中。
[0034] 在序列表中的序列的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0035] SEQ ID N0:1-14是包含非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的本發(fā)明的核苷酸序列。
[0036] SEQ ID N0:15-28是編碼SEQ ID NO :29-42的氨基酸序列的本發(fā)明的編碼序列。
[0037] SEQ ID N0:29-42是當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)度表達(dá)或受抑制時(shí)賦予對(duì)線蟲(chóng)的耐受性 或抗性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID N0:43-134是編碼SEQ ID N0:29-42、135-209的氨基酸序列的核苷酸序 列。
[0039] SEQ ID N0:135-209 是 SEQ ID N0:29-42 的同源物的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID N0:210-223是包含非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的本發(fā)明的核苷酸序列。
[0041] SEQ ID NO :224-242是編碼SEQ ID NO :243-260的氨基酸序列的本發(fā)明的編碼序 列。
[0042] SEQ ID N0:243-260是當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)度表達(dá)或者數(shù)量或活性減小時(shí)賦予對(duì) 線蟲(chóng)的耐受性或抗性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0043] SEQ ID N0:261-664是編碼SEQ ID N0:210-242的同源物的本發(fā)明的核苷酸序列。
[0044] SEQ ID N0:665-1046是當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)度表達(dá)或者數(shù)量或活性減小時(shí)賦予 對(duì)線蟲(chóng)的耐受性或抗性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0045] 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明
[0046] 本說(shuō)明不意在是一個(gè)本發(fā)明以其而實(shí)施的所有不同方式，或可以加入本發(fā)明中的 所有特征的詳細(xì)目錄。例如，關(guān)于一個(gè)實(shí)施例所說(shuō)明的特征可以結(jié)合入其他實(shí)施例中，并且 關(guān)于一個(gè)具體實(shí)施例所說(shuō)明的特征可以從那個(gè)實(shí)施例刪除。因此，本發(fā)明考慮了，在本發(fā)明 的一些實(shí)施例中，可以排除或省略在此陳述的任何特征或特征的組合。另外，鑒于本披露 內(nèi)容，對(duì)在此建議的不同實(shí)施例的眾多變體以及附加對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員是明顯 的，這不脫離本發(fā)明。因此，以下說(shuō)明旨在闡明本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，并不旨在完全列 舉出其所有排列、組合以及變型。
[0047] 除非另外定義，否則所有在此使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。在本發(fā)明的在此說(shuō)明中使用的術(shù)語(yǔ)是僅出于描述具 體實(shí)施例的目的，且并不旨在限制本發(fā)明。
[0048] 在本說(shuō)明書(shū)中提到的所有公開(kāi)文件和專(zhuān)利申請(qǐng)對(duì)于本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域的技術(shù) 人員的技術(shù)水平是指示性的。此外，公開(kāi)、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利、以及其他在此提到的參考文獻(xiàn)通 過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。
[0049] 如在本發(fā)明的實(shí)施例的說(shuō)明和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式"一個(gè)（a) "、 "一種（an)"和"該（the)"旨在也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清楚地另外指明。
[0050] 如在此使用的，"和/或"是指并且涵蓋相關(guān)列出項(xiàng)目中的一個(gè)或多個(gè)的任何和所 有可能的組合。
[0051] 如在此使用的術(shù)語(yǔ)"約"當(dāng)是指一個(gè)可測(cè)量的值如化合物的量、劑量、時(shí)間、溫度等 時(shí)意在涵蓋20%、10%、5%、1%、0. 5%、或甚至0. 1 %的指定量的變化。
[0052] 術(shù)語(yǔ)"包含（comprise) "、"包含了（comprises) " 和 / 或"包含的（comprising) " 當(dāng)用于本說(shuō)明書(shū)中時(shí)指示所說(shuō)明的特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、和/或組分的存在，但并 不排除一個(gè)或多個(gè)其他特征、整數(shù)、步驟、操作、要素、組分、和/或其組的存在或添加。
[0053] 如在此使用的，連接詞"基本上由...組成"（以及語(yǔ)法變體）意指，權(quán)利要求書(shū) 的范圍有待被解讀為涵蓋權(quán)利要求書(shū)中所列舉的指定材料或步驟以及不實(shí)質(zhì)上改變所要 求的發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)基本和新穎特征的那些。因此，在本發(fā)明的權(quán)利要求中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ) "基本上由...組成"不旨在被解讀為等同于"包含"。
[0054] 本發(fā)明部分是針對(duì)以下發(fā)現(xiàn)：通過(guò)在植物中過(guò)度表達(dá)或減少表達(dá)至少一種在此所 述的多肽來(lái)調(diào)節(jié)表達(dá)可以產(chǎn)生對(duì)線蟲(chóng)有害生物具有增強(qiáng)的抗性的植物。在本發(fā)明的上下文 中術(shù)語(yǔ)"進(jìn)行調(diào)節(jié)（modulating)"或"調(diào)節(jié)（modulates)"意指通過(guò)過(guò)度表達(dá)一種蛋白質(zhì)或 減少該蛋白質(zhì)表達(dá)而改變本發(fā)明的該蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0055] 因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋了一種控制線蟲(chóng)植物有害生物的方法，該方法 包括使該線蟲(chóng)有害生物與一種轉(zhuǎn)基因植物或其部分接觸，將調(diào)節(jié)一種或多種具有SEQ ID NO:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO:243-260、SEQ ID NO:665-1046、或其任意組合 的氨基酸序列中任一項(xiàng)的多肽的表達(dá)的一種重組核酸分子并入到其基因組中，從而控制該 線蟲(chóng)植物有害生物。在另一個(gè)實(shí)施例中，該重組核酸分子包含可操作地連接至在植物或植 物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子上的一個(gè)核苷酸序列，其中該核苷酸序列包含以下、基本上由以 下組成、或由以下組成：（a) SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID NO: 261-644中任一項(xiàng)的一種核苷酸序列；（b)編碼一種包含SEQ ID NO: 29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046 中任一項(xiàng)的氨基酸序列的多肽的 一種核苷酸序列；（c)與（a)或（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一種核苷酸 序列；(d)在嚴(yán)格雜交條件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列、或 其一個(gè)互補(bǔ)序列；（e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸 序列的一種核苷酸序列；以及（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意組合。在更具體的實(shí)施 例中，該核苷酸序列可包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：（a)SEQ ID N0:15、17、 20、22、23、24、26、226、227、228、230、232、233 中任一項(xiàng)的一種核苷酸序列；（b)編碼一種包 含 SEQ ID N0:29-38、40-42、52、243、244、245、246、248-252、254、256-259 中任一項(xiàng)的氨基 酸序列的多肽的一種核苷酸序列；(c)與（a)或（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致 性的一種核苷酸序列；（d)在嚴(yán)格雜交條件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一種 核苷酸序列、或其一個(gè)互補(bǔ)序列；（e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或 (d)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；以及（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意組合。在 另外的實(shí)施例中，該核苷酸序列可包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：(a)SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一項(xiàng)的一種核苷酸序列；（b)編碼一種 包含 SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一項(xiàng)的氨基酸序列的多肽 的一種核苷酸序列；（c)與（a)或（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一種核苷 酸序列；（d)在嚴(yán)格雜交條件下退火至（a)、(b)或（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列、或 其一個(gè)互補(bǔ)序列；（e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸 序列的一種核苷酸序列；以及（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意組合。
[0056] 在又一個(gè)實(shí)施例中，該重組核酸分子能夠產(chǎn)生一種包含反義鏈和有義鏈的雙鏈 RNA，其中該反義鏈與編碼一種或多種多肽的核苷酸序列的一部分互補(bǔ)，該部分包含與SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644、或其任意組合 的核苷酸序列中的任一個(gè)具有實(shí)質(zhì)上一致性的約18個(gè)至約25個(gè)連續(xù)核苷酸（例如，約18、 19、20、21、22、23、24、或25個(gè)連續(xù)核苷酸），基本上由其組成，由其組成。在又一個(gè)實(shí)施例 中，該重組核酸分子通過(guò)引起本發(fā)明的一種或多種多肽在轉(zhuǎn)基因植物中的過(guò)度表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié) 該一種或多種多肽（例如，SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID NO:665-1046)的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，該重組核酸分子通過(guò)引起本發(fā)明的一種或多 種多肽在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)減少或減少其表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)該一種或多種多肽（例如，SEQ ID NO: 29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO: 243-260、SEQ ID NO:665-1046)的表達(dá)。
[0057] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分是轉(zhuǎn)基因大豆植物、轉(zhuǎn)基因 甜菜植物、轉(zhuǎn)基因玉米植物、轉(zhuǎn)基因棉花植物、轉(zhuǎn)基因卡羅拉（canola)植物、轉(zhuǎn)基因小麥植 物、轉(zhuǎn)基因甘蔗植物、或轉(zhuǎn)基因稻植物、或其部分。
[0058] 在又一個(gè)實(shí)施例中，線蟲(chóng)有害生物是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：胞囊線 蟲(chóng)（異皮線蟲(chóng)屬物種（Heterodera spp·))、根結(jié)線蟲(chóng)（根結(jié)線蟲(chóng)屬物種（Meloidogyne spp·))、群矛線蟲(chóng)（紐帶線蟲(chóng)屬物種（Hoplolaimus spp·))、矮化線蟲(chóng)（矮化線蟲(chóng)屬物種 (Tylenchorhynchus spp·))、螺旋線蟲(chóng)（螺旋線蟲(chóng)屬物種（Helicotylenchus spp·))、腐 線蟲(chóng)（短體線蟲(chóng)屬物種（Pratylenchus spp·))、刺線蟲(chóng)（刺線蟲(chóng)屬物種（Belonoluimus spp·))、腎形線蟲(chóng)（腎形腎狀線蟲(chóng)（Rotylenchulus reniformis))、穿孔線蟲(chóng)（香蕉穿孔線 蟲(chóng)（Radopholus similis))、環(huán)線蟲(chóng)（環(huán)線蟲(chóng)屬物種（Criconema spp·))、以及其任意組合。 在另一個(gè)實(shí)施例中，該線蟲(chóng)是一種大豆胞囊線蟲(chóng)或一種甜菜胞囊線蟲(chóng)。
[0059] 在此所述的多肽的過(guò)度表達(dá)或減少表達(dá)可以產(chǎn)生對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物具有增強(qiáng) 的抗性的植物。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包含一個(gè)或多個(gè)（例如，1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)等）核苷酸序列的重組核酸分子，每個(gè)核苷酸序列當(dāng)在植 物中表達(dá)時(shí)賦予對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的增強(qiáng)的抗性，其中該一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列包含 以下、基本上由以下組成、或由以下組成：（a)SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644中任一項(xiàng)的一種核苷酸序列；（b)編碼一種包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046 中任一項(xiàng)的氨 基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的多肽的一種核苷酸序列；（c)與以上（a)和（b) 的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一種核苷酸序列；（d)在嚴(yán)格雜交條件下退火至 (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；（e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以 上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；或者（f) (a)至（e)的核苷酸序 列的任意組合。在更具體的實(shí)施例中，這些核苷酸序列可包含以下、基本上由以下組成、或 由以下組成：（a)SEQ ID N0:15、17、20、22、23、24、26、226、227, 228、230、232、233 中任一項(xiàng) 的一種核苷酸序列；（b)編碼一種包含 SEQ ID N0:29、31、34、36-38、40、244-246、250、251 中任一項(xiàng)的氨基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的多肽的一種核苷酸序列；（c)與以 上（a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一種核苷酸序列；（d)在嚴(yán)格雜交 條件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；（e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并 性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；或者（f) (a)至（e) 的核苷酸序列的任意組合。在另外的實(shí)施例中，這些核苷酸序列可包含以下、基本上由以下 組成、或由以下組成：（a)SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一項(xiàng)的 一種核苷酸序列；（b)編碼一種包含 SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一項(xiàng)的氨基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的多肽的一種核苷酸序列；（c)與以 上（a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一種核苷酸序列；（d)在嚴(yán)格雜交 條件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；（e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并 性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；或（f) (a)至（e)的 核苷酸序列的任意組合。
[0060] 在一些實(shí)施例中，除了以上所述的核苷酸序列之外，本發(fā)明的核酸分子還可以包 含當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)在植物中賦予對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的增強(qiáng)的抗性的一個(gè)或多個(gè)核苷 酸序列，該一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：SEQ ID NO: 1-28、SEQ ID NO: 43-134、SEQ ID NO: 210-242、SEQ ID NO: 261-644、或其任意組合中任 一項(xiàng)的核苷酸序列。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子可以包含當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí) 在植物中賦予對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的增強(qiáng)的抗性的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，該一個(gè)或多個(gè) 核苷酸序列包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：SEQ ID N0:15、17、20、22、23、24、 26、226、227、228、230、232、233、或其任意組合中任一項(xiàng)的核苷酸序列。
[0061] 因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的重組核 酸分子，其中該一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成：(a) SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644 中任一 項(xiàng)的一種核苷酸序列；(b)編碼一種包含 SEQ ID N0:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046中任一項(xiàng)的氨基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的 多肽的一種核苷酸序列；（c)與以上（a)、（b)的核苷酸序列具有顯著序列一致性的一種核 苷酸序列；(d)在嚴(yán)格雜交條件下退火至以上（a)至（c)的核苷酸序列的一種核苷酸序列； (e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上（a)至（d)的核苷酸序列的一種核苷酸序列；或 者（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意組合。
[0062] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，提供了與本發(fā)明的核苷酸序列具有顯著序列一致性的 多個(gè)核苷酸序列。"顯著的序列一致性"或"顯著的序列相似性"意指與另一個(gè)核苷酸序列有 至少約 70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、和/或100%-致性或相似性。因此，在另 外的實(shí)施例中，"顯著的序列一致性"或"顯著的序列相似性"意指與另一個(gè)核苷酸序列有 約70%至約100%、約75%至約100%、約80%至約100%、約81 %至約100%、約82%至 約100%、約83%至約100%、約84%至約100%、約85%至約100%、約86%至約100%、 約87%至約100%、約88%至約100%、約89%至約100%、約90%至約100%、約91 %至 約100%、約92%至約100%、約93%至約100%、約94%至約100%、約95%至約100%、約 96%至約100%、約97%至約100%、約98%至約100%、和/或約99%至約100%-致性或 相似性的范圍。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的核苷酸序列是與SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644中任一項(xiàng)的核苷酸序列具有顯著序列 一致性的一種核苷酸序列。在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的核苷酸序列是與SEQ ID NO: 15、 17、20、22、23、24、26、226、227、228、230、232和/或233中任一項(xiàng)的核苷酸序列具有顯著序 列一致性的一種核苷酸序列。
[0063] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可以表達(dá)本發(fā)明的這些核苷酸序列和/或核酸分子以 產(chǎn)生多種多肽，每種多肽當(dāng)在植物中產(chǎn)生時(shí)造成對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的抗性增強(qiáng)。因此，在 本發(fā)明的其他方面，提供了一種多肽，該多肽包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、 SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046中任一項(xiàng)的氨基酸序列、基本上由其組成、或由 其組成，其中所述多肽在植物中的產(chǎn)生造成該植物對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的抗性增強(qiáng)。
[0064] 本發(fā)明的又一方面是一種包含一種或多種本發(fā)明的多肽的殺線蟲(chóng)組合物。在一些 實(shí)施例中，該組合物包含一種多肽，該多肽包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046、或其任意組合中任一項(xiàng)的氨基酸序列、基本上由其組 成、或由其組成。
[0065] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽包含一個(gè)氨基酸序列、基本上由其組成、或由其組 成，該氨基酸序列與 SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046中任一項(xiàng)的氨基酸序列至少70%-致，例如，至少70%、75%、80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%、和/或100%-致。
[0066] 可以在用包含本發(fā)明的核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明的多肽 并且從這些細(xì)胞中收集這些多肽。因此，可以分離這些多肽并將其作為部分或完全純化的 全長(zhǎng)多肽或者作為其活性變體或片段提供在本發(fā)明的一種組合物中，或者可以作為來(lái)自產(chǎn) 生所述一種或多種多肽的一個(gè)或多個(gè)有機(jī)體細(xì)胞中的細(xì)胞提取物或細(xì)胞裂解物提供這些 多肽。在任何情況下都不要求完全純化。該多肽、其變體或片段可以是至少約5%、10%、 15 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %, 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%純的（界/^)，或更純。
[0067] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽或核苷酸序列可以是一種保守修飾的變體。如在 此使用的，"保守修飾的變體"是指含有單獨(dú)取代、缺失或添加的多肽或核苷酸序列，這些取 代、缺失或添加在該序列中改變、添加或缺失一個(gè)單個(gè)氨基酸或核苷酸或小百分比的氨基 酸或核苷酸，其中該改變導(dǎo)致一個(gè)氨基酸被一個(gè)化學(xué)上相似的氨基酸取代。提供功能上相 似的氨基酸的保守取代表在本領(lǐng)域中是熟知的。
[0068] 如在此使用的，一種多肽的保守修飾的變體是有生物活性的并且因此具有如在此 所述的參考多肽的所希望的活性（例如，賦予對(duì)線蟲(chóng)植物有害生物的增強(qiáng)的抗性、減少線 蟲(chóng)植物有害生物的生長(zhǎng)、減少線蟲(chóng)胞囊發(fā)育）。該變體可以產(chǎn)生于例如遺傳多態(tài)性或產(chǎn)生 于人工操縱。該參考多肽的一種生物活性變體可以與該參考多肽的氨基酸序列具有至少 約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、或更大的序列一致性或相似性（例如，約40%至約99%或更 大的序列一致性或相似性以及其中的任何范圍），如通過(guò)在此的其他地方描述的序列比對(duì) 程序和參數(shù)所測(cè)定的。一種活性變體不同于該參考多肽序列的氨基酸殘基可以是盡可能少 的1-15個(gè)氨基酸殘基，盡可能少的1-10個(gè)、如6-10個(gè)，盡可能少的5個(gè)，盡可能少的4個(gè)、 3個(gè)、2個(gè)、或甚至1個(gè)氨基酸殘基。
[0069] 天然存在的變體可以存在于一個(gè)群體內(nèi)。此類(lèi)變體可以通過(guò)使用熟知的分子生物 學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定，如使用如以下描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)以及雜交。合成來(lái)源的核苷酸 序列，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變或PCR-介導(dǎo)的誘變生成的、仍編碼本發(fā)明的多肽的序列也作為變 體包括在內(nèi)?？梢詫⒁粋€(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸取代、添加、或缺失引入在此所披露的核苷 酸或氨基酸序列中，以使得將這些取代、添加、或缺失引入所編碼的蛋白中。這些添加（插 入）或缺失（截短）可以在天然蛋白的N-末端或C-末端進(jìn)行，或者在該天然蛋白的一個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行。類(lèi)似地，一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸的取代可以在該天然蛋白的一個(gè) 或多個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行。
[0070] 例如，保守的氨基酸取代可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的、優(yōu)選是非必需氨基酸殘基處 進(jìn)行。"非必需的"氨基酸殘基是一種可以與蛋白質(zhì)的野生型序列不同但不改變生物活性的 殘基，而一種"必需的"氨基酸是生物活性所要求的。"保守的氨基酸取代"是其中用一種具 有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換該氨基酸殘基的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本 領(lǐng)域內(nèi)是已知的。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸（例如，賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸）、 具有酸性側(cè)鏈的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸（例 如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非極性側(cè)鏈的氨 基酸（例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、具有 β -分支側(cè)鏈的氨基酸（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）、以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸 (例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。此類(lèi)取代不會(huì)針對(duì)保守的氨基酸殘基、或針對(duì) 位于保守基序中的氨基酸殘基進(jìn)行，在這些地方此類(lèi)殘基對(duì)于蛋白質(zhì)活性是必需的。
[0071] 例如，可以通過(guò)使編碼酶的核苷酸序列突變來(lái)制備參考多肽的氨基酸序列變體。 可以在植物中將所得到的突變體進(jìn)行重組表達(dá)，并且利用在此所述的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定技術(shù)通過(guò)測(cè) 定針對(duì)線蟲(chóng)和植物的活性來(lái)篩選保留生物活性的那些。用于誘變與核苷酸序列改變的方法 在本領(lǐng)域中是已知的。參見(jiàn)，例如，孔克爾（Kunkel) (1985)美國(guó)科學(xué)院院刊82:488-492; 孔克爾等人，（1987)酶學(xué)方法（Methods in Enzymol. ) 154:367-382 ;以及分子生物學(xué)技 術(shù)（Techniques in Molecular Biology)(瓦爾克（Walker)和嘉世寶（Gaastra)編輯， 麥克米蘭出版公司（MacMillan Publishing Co. ) 1983)以及其中所引用的參考文獻(xiàn)；以 及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 873, 192。清楚的是，在編碼該變體的DNA內(nèi)所進(jìn)行的突變一定不能破壞 閱讀框并且優(yōu)選地不會(huì)生成互補(bǔ)區(qū)，這些互補(bǔ)區(qū)會(huì)產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)，歐洲專(zhuān)利 申請(qǐng)
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