用于生物控制假單胞菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于控制假單胞菌的增殖的方法，其中向人體或動物體施加的處理方法除外，其特征在于其使用Willaertia magna種的原生動物，并且還涉及包含這種原生動物的消毒劑。
PTA-7824
2006.08.21

PTA-7825
2006.08.21
【專利說明】用于生物控制假單胞菌的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于生物控制假單胞菌（Pseudomonas)的存在及其增殖的新方法。

【背景技術】
[0002] 假單胞菌是屬于假單胞菌科的革蘭氏陰性細菌。在人中，這種細菌是形成各種皮 膚、內臟和肺部感染，特別是囊性纖維化的原因（4, 19)。這些細菌能夠抵抗眾多防腐劑和抗 生素（2) (7)，這無疑部分解釋了它們在醫(yī)院的日益頻繁的存在，在那里它們可以從潮濕的 環(huán)境（水槽、U型彎、花瓶、毛巾和洗滌物、含水容器等）分離到。一些種（species)也具有 對于植物（8)、線蟲（10)和變形蟲（1，11，16)的致病能力。因此，這種細菌的監(jiān)測和控制構 成了日益重要的當務之急。
[0003] 通常，已知在環(huán)境中，假單胞菌具有普遍分布（5)，因為這種細菌已經從土壤、從污 水或從工業(yè)廢水和生物膜分離到，其特征在于它與自由生活的變形蟲共享。幾種潛在的致 病細菌（嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila)、分枝桿菌屬（Mycobacterium spp)和大 腸桿菌0157:H7)已經發(fā)展了在自由生活的變形蟲內部存活和復制的機制（15)。此外，已 經表明，細菌，包括假單胞菌，可以發(fā)展各種策略，允許它們逃避自由生活的變形蟲的捕食 (12, 13, 18)。具體而言，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)形成生物膜是允許細菌 有效逃避自由生活的變形蟲諸如多食棘變形蟲（Acanthamoeba polyphaga)的捕食的機制 之一（18)。盡管已知某些自由生活的變形蟲諸如棘變形蟲（Acanthamoeba)能夠發(fā)展針對 假單胞菌的趨化響應且能夠以這些細菌為食（17, 18)，但也表明，銅綠假單胞菌快速抑制 這些變形蟲的生長并通過分泌毒素誘導它們的胞囊形成和它們的死亡（11-13, 17, 18)。也 已經在纖毛原生動物上證實了假單胞菌的毒性作用（9)。
[0004] 因此，其清楚地顯示，自由生活的原生動物和變形蟲構成假單胞菌的生態(tài)學的重 要因素。此外，假單胞菌感染原生動物和在原生動物中細胞內存活的能力強烈表明，這些原 生動物是促進假單胞菌耐受目前使用的殺生物處理的因素，如Michel等人所指出（14)。


【發(fā)明內容】

[0005] 在這種背景下，本發(fā)明人已經表明，完全出乎意料的是，該變形蟲屬Willaertia magna根除假單胞菌細菌。將這種殺生物效果添加至已經證實的Willaertia magna對其它 變形蟲試劑的捕食的能力，這可以充當假單胞菌的載體（3)。
[0006] 因此，本發(fā)明的一個主題首先是用于控制假單胞菌的增殖的方法，其使用 Wi 11 aert ia magna屬的原生動物。根據本發(fā)明的方法不包括向人體或動物體施加的處理方 法。在根據本發(fā)明的方法中，其最通常是用Willaertia屬，特別是Willaertia magna種的 原生動物處理的氣體或液體流。
[0007] 根據本發(fā)明的方法可以特別用在衛(wèi)生用水或工業(yè)用水分配網絡、用于工業(yè)廠房的 冷卻回路或空調網絡的消毒中?？梢詫⒃鷦游镏苯犹砑又链幚淼墓芑蚓W絡中循環(huán)的水 或液體。也可以將它們例如作為氣溶膠的水溶液形式噴霧在待消毒的工業(yè)網絡、煙囪和工 廠中，和待消毒的工業(yè)表面上。
[0008] 有利地，在本發(fā)明的上下文中使用的原生動物對應于在2006年8月21日以 編號PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或者在2006年8月21日以編號PTA 7825保藏于 ATCC 的菌株，這兩種菌株以 Centre National de la Recherche Scientifique(CNRS) [French National Center for Scientific Research]-3rue Michel Ange-75794 Paris Cedex 16/France-和 Uinversite Lyon lClaude Bernard[Lyon lClaude Bernard University]_43Boulevard du llNovembre 1918_69622Villeurbanne Cedex/France 的名 義保藏。
[0009] 對應于以編號PTA7824保藏于ATCC的菌株或以編號PTA7825保藏于ATCC的菌 株的屬于Willaertia屬的原生動物是本發(fā)明的組成部分。所述保藏的菌株PTA7824和 PTA7825還描述于PCT國際申請W02008/043969的公布說明書中。
[0010] 因此這種原生動物可以用于消毒劑中，特別是用于消除假單孢菌細菌和用于控制 假單胞菌的增殖和污染。
[0011] 此外，本發(fā)明的一個主題是含有Willaertia屬、特別是Willaertia magna種的 原生動物的消毒劑。對應于以編號PTA7824保藏于ATCC的菌株或以編號PTA7825保藏于 ATCC的菌株的原生動物將是優(yōu)選的。有利地，根據本發(fā)明的消毒劑是例如在蒸餾水中的水 溶液或懸浮液的形式。消毒劑可以是可噴霧的形式，例如作為氣溶膠或任何其它施用方式。
[0012] 本發(fā)明人已經通過將用作變形蟲模型的棘變形蟲（Acanthamoeba)屬和哈氏蟲 (Hartmannella)屬中假單胞菌的復制與Willaertia變形蟲屬中觀察到的復制進行比較 而證實了 Willaertia屬、特別是Willaertia magna種的原生動物的假單胞菌增殖抑制 活性。還通過證實Willaertia magna對銅綠假單胞菌形成的生物膜的捕食作用而證實 Willaertia屬、特別是Willaertia magna種的原生動物的活性。
[0013] 本發(fā)明的一個主題還是消毒劑或如上所述的原生動物作為對假單胞菌的殺生物 劑的用途。
[0014] 考慮到變形蟲在外部環(huán)境中假單胞菌的增殖和維持中發(fā)揮的至關重要的作用，根 據本發(fā)明的方法和消毒劑在成本、有效性和特別是環(huán)境友好的方面具有眾多優(yōu)點。
[0015] 下文實施例可以說明本發(fā)明，但不具有限性質。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1顯示在以10的初始變形蟲/細菌比率置于與假單胞菌的共培養(yǎng)后，蠕形 哈氏蟲（Hartmannella vermiformis)( "方形"符號)、卡氏棘變形蟲（Acanthamoeba castellanii)( "菱形"符號?)和 Willaertia(Willaertia magna- "三角"符號▲)變形 蟲的各群體的自發(fā)進化。
[0017] 如材料和方法部分中所述，以10的比率（10個細菌/1個變形蟲）將各種自由生 活的變形蟲置于與假單胞菌的共培養(yǎng)中（時間〇小時=T0)。每3小時采集共培養(yǎng)懸浮液 的等分試樣：即T0，T0+3h，T0+6h?；钭冃蜗x的百分比通過臺盼藍排斥試驗和使用Malassez 細胞的顯微鏡觀察來測定。該數(shù)據表示為在臺盼藍排斥試驗中陰性的活細胞的％。
[0018] 圖2顯示與棘變形蟲和哈氏蟲但不與Willaertia共培養(yǎng)的假單胞菌的生長。
[0019] 將變形蟲（5X104個）懸浮在水中并接種至孔中。1小時后，將假單胞菌添加至孔 中，以便實現(xiàn)如小圖A中所示的各種MOI。將共培養(yǎng)物在30°C孵育并在24小時和48小時 后檢查。A.注意在含有Willaertia與假單胞菌的孔中不存在細菌增殖。B.將含有100個 細菌/1個變形蟲和10個細菌/1個變形蟲（分別為M01100和M0110)的孔的100 yl上清 液連續(xù)稀釋（用無菌去離子水的稀釋度范圍為1〇_6至1〇_8)，并接種到TSA瓊脂上。注意， 在與Willaertia magna(W)共培養(yǎng)的上清液中不存在細菌菌落的生長，以及，相反地，在哈 氏蟲（H)存在的情況下假單胞菌的強烈生長。
[0020] 圖3顯示在與各種變形蟲屬包括Willaertia屬（Willaertia magna- "交叉"符 號X)共培養(yǎng)獲得的假單胞菌（"菱形"符號?)的生長的比較動力學
[0021] 以10的比率（10個細菌/1個變形蟲）將各種自由生活的變形蟲分別置于與假 單胞菌的共培養(yǎng)中（時間0小時=T0)。每3小時采集共培養(yǎng)懸浮液的等分試樣：即T0， T0+3h，T0+6h，并且如材料和方法部分中所述測定假單胞菌濃度。僅包含濃度等于共培養(yǎng)的 濃度的假單胞菌細菌的陽性對照將充當培養(yǎng)基中假單胞菌的生長的對照。注意與卡氏棘 變形蟲（"方形"符號)和蠕形哈氏蟲（"三角"符號▲)的共培養(yǎng)中的細菌增殖。
[0022] 圖4顯示Willaertia magna對假單胞菌形成的生物膜的殺生物作用。
[0023] 將假單胞菌和Willaertia magna接種至TSA瓊脂上，并在30°C孵育24小時。A.如 圖4A中的箭頭所示，假單胞菌生物膜裂解斑塊在Willaertia magna的沉積物上形成并超 出沉積物形成。B.由箭頭所示的生物膜裂解斑塊之前。注意，在右邊，在細菌膜不存在的情 況下Willaertia magna沉積物的部位。注意，在左邊，假單胞菌的層。

【具體實施方式】
[0024] 1.材料和方法
[0025] 1. 1. #用的菌株:
[0026] 假單胞菌：使用的菌株是CL5210菌株（Oxoid，F(xiàn)rance)。
[0027] -將其以每周一次亞培養(yǎng)的速度維持在TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂）（批號 P05012,0xoid，F(xiàn)rance)上。將該菌株以寬條紋接種到TSA板上，并在30°C下孵育2天。
[0028] _變形蟲：使用的菌株屬于三種不同的變形蟲種：
[0029] 〇 蠕形哈氏蟲，
[0030] 〇 卡氏棘變形蟲（ATCC30010)
[0031] 〇 Willaertia magna(以編號 PTA7824 和 PTA7825 保藏于 ATCC 的菌株）
[0032] 將這三種菌株在SCGYEM培養(yǎng)基（血清酪蛋白葡萄糖酵母提取物培養(yǎng)基）上在存 在10%胎牛血清的情況下無菌培養(yǎng)，以3ml/每管的比例分布在Falcon?管（3033)中。在 維持中，將繁殖形式每8-9天亞培養(yǎng)。對于共培養(yǎng)，使用3至4天亞培養(yǎng)，以便正好在指數(shù) 生長期中具有活動體。
[0033] 如下獲得SCGYEM培養(yǎng)基：
[0034] > 酪蛋白（Merck 1.02244.010) 10 g Na2HP04 1.325 g KH2P〇4 0.8 g 葡萄糖 2.5 g 酵母提取物(Difco 0127-17-9) 5 g 蒸餾水 900 ml 胎牛血清 100 ml
[0035] 將2. 5ml NaOH(IN)，然后Na2HP04和KH2P04添加至900ml蒸餾水中。將混合物在 熱板上略加熱，然后在磁力攪拌的情況下逐漸添加酪蛋白。酪蛋白溶解后，加入葡萄糖和酵 母提取物。
[0036] 完全溶解后，將混合物依次在玻璃纖維（Sartorius SM6513400)，然后在1 y m膜 (Whatman7190004)上過濾。然后將培養(yǎng)基等分分裝到玻璃瓶中。將瓶子在120°C下在高壓 滅菌器中滅菌20分鐘。在培養(yǎng)基的最終用途和分配之前，在層流罩中以最終體積10%的比 例無菌添加胎牛血清。
[0037] 1. 2.假單朐菌的單奪形蟲共培養(yǎng)
[0038] 1. 2. 1.細菌接種物的制各：
[0039] 從TSA上的2天培養(yǎng)物制備無菌蒸餾水中假單胞菌的懸浮液，從而獲得在550nm 處個1光密度單位，即l〇9CFU(集落形成單位）/ml的濃度。
[0040] 1. 2. 2.講行單奪形蟲共培養(yǎng)
[0041] 在含有3ml高壓滅菌水的細胞培養(yǎng)管（Falcon K_ 3033)中進行共培養(yǎng)。從在 Malassez血細胞計數(shù)器上事先計數(shù)的無菌變形蟲懸浮液以IX 105個變形蟲/ml的比例進 行管的接種。用假單胞菌侵染變形蟲通過固定10的假單胞菌/變形蟲比率，即1 X 106個 細菌/ml接種培養(yǎng)基而進行。侵染后，立即將共培養(yǎng)管以低速離心（760g持續(xù)lOmin)，以促 進變形蟲和細菌之間的接觸。l〇min后，將管手動重懸，并在30°C下在培養(yǎng)箱中以傾斜位置 孵育。
[0042] 置于共培養(yǎng)中的變形蟲和假單胞菌的命運通過以下方式確定：
[0043] 共培養(yǎng)在細菌侵染后監(jiān)測6個小時。在每個時間間隔（每3小時），將共培養(yǎng)管 取樣，并在渦旋器上劇烈攪拌以便從壁分離變形蟲后從變形蟲觀點和細菌觀點兩者進行檢 查。對于每個檢查的管：
[0044] _變形蟲直接在Malassez細胞上計數(shù)。
[0045] _假單胞菌濃度通過在Eppendorf微管中在無菌蒸饋水中10倍連續(xù)稀釋后直接在 TSA上將培養(yǎng)基鋪出來測定。每個稀釋度以100 ill/每板的比例一式三份在TSA上鋪出。 然后將板在30°C下孵育最少48小時。TSA的第一個讀數(shù)在鋪出后24小時通過計數(shù)集落而 進行；隨后在第2天第二次讀數(shù)以確認。假單胞菌濃度以CFU/ml孵育培養(yǎng)基表示，其考慮 稀釋因子，并假設各集落對應于稀釋的懸浮液中初始存在的一個細菌。
[0046] 對于每種變形蟲屬，將假單胞菌生長曲線表示為時間的函數(shù)。
[0047] 此外，假單胞菌對各種變形蟲種可能的細胞毒性作用以如下方式測定：
[0048] ?通過計數(shù)在臺盼藍排斥試驗中陽性的變形蟲的比例。該試驗在顯微鏡下通過計 數(shù)Malassez細胞中臺盼藍陽性細胞的數(shù)目/總細胞的數(shù)目而進行。
[0049] 1. 3. Willaertia magna對假單胞菌牛.物膜的影口向
[0050] 將Willaertia沉積在剛剛在TSA上鋪出的假單胞菌層上。將瓊脂在30°C下放 置24小時，以便使細菌膜在瓊脂表面上生長。然后在光學顯微鏡（放大倍數(shù)X400)下觀 察瓊脂，以檢測其內可能的細菌層裂解斑塊的形成。
[0051] 2?結果
[0052] 2. L Willaertia magna表現(xiàn)耐受假單胞菌
[0053] 假單胞菌對測試的各種變形蟲種存活的影響通過臺盼藍排斥試驗來測定。非?？?速地，將卡氏棘變形蟲置于與細菌的共培養(yǎng)中后，主要的細胞毒性作用發(fā)生在這種變形蟲 種中，其中共培養(yǎng)3小時后存活力下降?30% (參見圖1)。相反，當將Willaertia magna 置于與假單胞菌的共培養(yǎng)中（包括以維持接近100%存活力孵育長達9小時）時，從未觀察 到這種現(xiàn)象（圖1)。像Willaertia magna，自由生活的懦形哈氏變形蟲在通過臺盼藍排斥 測定的存活力方面沒有表現(xiàn)出任何下降（圖1)。所有這些觀察（無胞囊形成和無假單胞菌 誘導的細胞毒性）清楚地表明，Willaertia magna和蠕形哈氏蟲，與卡氏棘變形蟲類型的 其它變形蟲種相反，表現(xiàn)出抵抗假單胞菌的初始能力。
[0054] 2. 2Willaertia magna 捕食假單胞菌
[0055] 在存在屬于哈氏蟲屬和棘變形蟲屬的變形蟲的情況下進行的假單胞菌共培養(yǎng)的 結果表明在存在這兩種變形蟲屬的情況下的相當?shù)脑鲋?，因為?小時內注意到細菌濃度 的增加（見圖2)。相反（盡管共培養(yǎng)在嚴格相同的條件下進行），與僅含有假單胞菌的對 照相比，在存在Willaertia magna變形蟲的情況下注意到可檢測的假單胞菌濃度降低約1 個對數(shù)（參見圖2和圖3)。所測量的假單胞菌濃度下降表明Willaertia magna針對假單 胞菌的大量捕食作用。
[0056] Willaertia magna和懦形哈氏蟲存活，但只有Willaertia magna防止細菌增殖。 Willaertia magna對假單胞菌的這種作用在圖3和圖4中進一步說明。在水中孵育48小 時后，棘變形蟲和哈氏蟲與細菌的共培養(yǎng)表明假單胞菌的增殖（注意由于細菌的增殖導 致的含有假單胞菌和哈氏蟲或棘變形蟲的孔的渾濁外觀）（圖3,小圖A)。當假單胞菌以10 的M0I (10個細菌/1個變形蟲）孵育時，在共培養(yǎng)孔的上清液中測定的所述細菌濃度表明 不存在細菌與Willaertia magna(圖3,小圖B)。
[0057] 圖4還表明Willaertia magna對假單胞菌的捕食作用。事實上，在存在 Willaertia magna的情況下24小時后，其中細菌層已經消失的瓊脂表面顯得非常清楚 (這些區(qū)域在此被稱為細菌層/生物膜裂解斑塊-圖4,小圖A)。瓊脂的顯微鏡檢查也顯 示，Willaertia magna集中在這個裂解斑塊的限度；這種效應也顯示在圖4,小圖B，其中在 Willaertia magna作用下的細菌層的消失是清楚明顯的。所有這些數(shù)據和觀察結果清楚地 表明Willaertia magna針對已經形成生物膜的致病細菌假單胞菌的捕食作用。
[0058] 參考文獻
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【權利要求】
1. 用于控制假單胞菌的增殖的方法，其中向人體或動物體施加的處理方法除外，其特 征在于其使用Willaertia屬的原生動物。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于氣體或液體流或固體表面用Willaertia屬， 特別是Willaertia magna種的原生動物處理。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于這些原生動物有利地對應于以編號 PTA7824保藏于ATCC的菌株或以編號PTA7825保藏于ATCC的菌株。
4. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于其實施用于衛(wèi)生用水或工業(yè)用水 分配網絡、用于工業(yè)廠房的冷卻回路或空調網絡的消毒中。
5. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于其實施用于控制水管，或可能與 人或動物食品接觸的表面中生物膜的形成。
6. 含有Willaertia屬、特別是Willaertia magna種的原生動物的消毒劑作為對假單 胞菌的殺生物劑的用途，其中向人體或動物體施加的處理用途除外。
7. 如權利要求6所述的用途，其特征在于所述原生動物對應于以編號PTA7824保藏于 ATCC的菌株或以編號PTA7825保藏于ATCC的菌株。
8. 如權利要求6或7所述的用途，其特征在于所述消毒劑為水溶液或懸浮液的形式。
【文檔編號】A01N63/00GK104302182SQ201280062183
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2012年12月20日 優(yōu)先權日:2011年12月20日
【發(fā)明者】F·普拉松, S·博德納克 申請人:阿莫巴