專利名稱：煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病毒基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及馬鈴薯Y病毒屬的煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)HN39分離物侵染性克隆的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒致病機(jī)理的重要工具。獲得了侵染性cDNA克隆后，可利用反向遺傳學(xué)方法分析病毒基因在侵染和致病等過(guò)程中的作用，進(jìn)而可以獲得弱毒株系用來(lái)保護(hù)植物免受強(qiáng)毒株系的危害。植物病毒侵染性cDNA克隆也可以改造為表達(dá)載體，用來(lái)生產(chǎn)抗病毒蛋白、醫(yī)用獸用疫苗和抗體。利用病毒載體表達(dá)外源蛋白在植物體內(nèi)表達(dá)具有產(chǎn)量高、費(fèi)用低、無(wú)動(dòng)物病原菌污染的優(yōu)點(diǎn)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，抗齲齒抗體、新城疫病毒疫苗及葡糖腦苷脂酶等已經(jīng)利用植物病毒載體成功表達(dá)。植物病毒載體一般用17啟動(dòng)子或CaMV35S啟動(dòng)子。17啟動(dòng)子非常小，可以設(shè)計(jì)到引物上，但需要在體外轉(zhuǎn)錄成RNA后再接種。基于CaMV35S啟動(dòng)子構(gòu)建的侵染性克隆主要有以下優(yōu)點(diǎn)1.無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄；2.侵染性cDNA克隆易于制備，可直接摩擦接種，也可用基因槍或者農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)的方法接種；3.侵染性cDNA克隆在體外穩(wěn)定，便于保存。煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬，主要侵染煙草等茄科作物。目前TVBMV在山東、安徽、河南、云南等地的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。TVBMV在田間主要由蚜蟲以非持久方式傳播，并且TVBMV和馬鈴薯X病毒(PVX)有協(xié)生作用，一旦復(fù)合侵染會(huì)引起嚴(yán)重癥狀，導(dǎo)致更大損失
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建及應(yīng)用，通過(guò)基因插入重組的方式，將煙草脈帶花葉病毒HN39分離物的基因組克隆到35S啟動(dòng)子下游，獲得了具有強(qiáng)侵染力的侵染性克隆pCamTVBMV，為研究煙草脈帶花葉病毒TVBMV的基因功能奠定了基礎(chǔ)。利用侵染性克隆pCamTVBMV可以構(gòu)建植物表達(dá)載體，在煙草、馬鈴薯等茄科植物體內(nèi)穩(wěn)定、高效表達(dá)抗病毒蛋白、病毒疫苗或抗體；利用侵染性克隆pCamTVBMV還可以研制弱毒株系，用來(lái)保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系的侵染。本發(fā)明實(shí)施的具體技術(shù)方案是煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建，具體步驟如下a.煙草脈帶花葉病毒病毒粒子的提??；可采用常規(guī)提取方法獲得；b.從病毒粒子中提取病毒RNA，設(shè)計(jì)引物分三段對(duì)煙草脈帶花葉病毒基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Overlap-PCR方法分別將35S啟動(dòng)子融合到煙草脈帶花葉病毒的5'末端。C.用限制性酶切的方法將全長(zhǎng)cDNA克隆連接到pCambia0390載體，獲得pCamTVBMV ；d.將c中構(gòu)建的載體通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種寄主植物；
e.觀察癥狀及ELISA檢測(cè)。上述的方法綜合而言，主要提供了構(gòu)建煙草脈帶花葉病毒HN39的侵染性cDNA克隆，該克隆能系統(tǒng)侵染寄主植物。同時(shí)提供一種可以在植物體內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體，它以煙草脈帶花葉病毒基因組為外源蛋白的表達(dá)載體，通過(guò)構(gòu)建含有外源蛋白基因的重組cDNA，接種植物表達(dá)外源基因。采用本發(fā)明所述的技術(shù)方案，可以獲得如下的技術(shù)效果I)煙草脈帶花葉病毒不侵染動(dòng)物和人，對(duì)環(huán)境安全。2)本發(fā)明采用35S啟動(dòng)子，無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄，克服了 RNA酶對(duì)體外轉(zhuǎn)錄物降解的影響。3)該侵染性克隆可穩(wěn)定保存，可用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種。保藏信息保藏時(shí)間2012年I月10日保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 CGMCC保藏編號(hào)CGMCCNO. 5710
保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)分類命名大腸埃希氏菌


圖1為TVBMV基因組片段擴(kuò)增示意圖；圖2為TVBMV表達(dá)載體pCamTVBMV基因組結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為TVBMV病毒粒子(wtTVBMV)和侵染性克隆pCamTVBMV接種后第8天在寄主植物上的癥狀；圖4為pCamTVBMV-GFP接種后第14天本氏煙的癥狀，其中A為在可見光下觀察到的本氏煙表現(xiàn)；B為在紫外光下可以觀察到綠色熒光蛋白在本氏煙葉片中得到高效表達(dá)；圖5為挑戰(zhàn)接種10天后，不同弱毒株系對(duì)煙草植株的保護(hù)效果，用DEN、DEN + D198K、DEN + D198K + ART保護(hù)接種3天、5和10天后用強(qiáng)毒株系進(jìn)行挑戰(zhàn)接種，癥狀越重，熒光越強(qiáng)，在用弱毒株系處理的植株中，熒光越弱，說(shuō)明交叉保護(hù)效果越好；圖6用DEN、DEN + D198K、DEN + D198K + ART保護(hù)接種3天、5和10天后用強(qiáng)毒株系進(jìn)行挑戰(zhàn)接種，挑戰(zhàn)接種5天后，不同處理的煙草植株內(nèi)TVBMV病毒的濃度；
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)ー步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所提供的實(shí)施例，均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，其中所采用的引物序列如下表
權(quán)利要求
1.一種煙草脈帶花葉病毒的侵染性克隆，其序列如Seq ID No: 14所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于可通過(guò)以下步驟獲得 (1)煙草脈帶花葉病毒病毒粒子的提取，可采用常規(guī)提取方法進(jìn)行； (2)從病毒粒子中提取病毒RNA，設(shè)計(jì)引物分三段對(duì)煙草脈帶花葉病毒基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Overlap-PCR方法分別將35S啟動(dòng)子融合到煙草脈帶花葉病毒的5'末端； (3)用限制性酶切的方法將全長(zhǎng)cDNA克隆連接到pCambia0390載體，獲得pCamTVBMV。
3.如權(quán)利要求1所述載體在表達(dá)外源蛋白方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述載體在保護(hù)植物免受病毒強(qiáng)毒株系侵染方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物病毒基因工程領(lǐng)域，提供了一種煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建及應(yīng)用。通過(guò)基因重組的方式，將煙草脈帶花葉病毒HN39分離物的基因組克隆到35S啟動(dòng)子下游，獲得了具有強(qiáng)侵染力的侵染性克隆。利用該侵染性克隆可以構(gòu)建植物表達(dá)載體，在寄主植物體內(nèi)穩(wěn)定、高效表達(dá)外源蛋白，也可以將侵染性克隆改造為弱毒株系，以保護(hù)植株免受強(qiáng)毒株系的侵染。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103031325SQ20131000934
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者李向東, 高瑞, 田延平, 劉煥庭 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)