淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備、檢測(cè)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淮山藥溫和花葉病毒（Yam?mild?mosaic?virus,YMMV）的多克隆抗體制備、檢測(cè)及其應(yīng)用?；赮MMV基因組，發(fā)明人通過原核表達(dá)純化YMMV的核包涵體蛋白/外殼蛋白（NIb/CP）并用于免疫家兔制備多克隆抗體，該多克隆抗體能特異性識(shí)別原核表達(dá)YMMV的NIb/CP蛋白和侵染淮山藥的YMMV病毒的NIb/CP蛋白，并產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。基于此，發(fā)明人還建立了一套高效、高靈敏和準(zhǔn)確的IC-RT-PCR、ELISA和Western?blot方法，可以特異性地從感染YMMV的淮山藥植株中檢測(cè)出YMMV。應(yīng)用本發(fā)明，可為YMMV與寄主相互作用研究以及該病毒的快速檢測(cè)、分型和分子生物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，為該病毒的流行監(jiān)測(cè)和防治打下扎實(shí)基礎(chǔ)。
【專利說明】淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備、檢測(cè)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種淮山藥溫和花葉病毒的NIb/CP蛋白原核表達(dá)、多克隆抗體制備、檢測(cè)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]淮山藥又稱山藥、淮山，為薯蕷科植物，其塊根富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸及多種藥用成分如膽堿、皂甙、粘多糖等，還含有Fe、Zn、Cu、Ca等多種礦物質(zhì)，依據(jù)種和品種的不同，可作藥用或食用，具有良好市場(chǎng)前景和產(chǎn)業(yè)開發(fā)潛勢(shì)。病毒病嚴(yán)重影響淮山藥的產(chǎn)量和品質(zhì)，在淮山藥生產(chǎn)上造成重大損失。文獻(xiàn)表明，全球范圍內(nèi)，自然條件下侵染淮山藥的病毒有桿狀DNA病毒屬的參暮桿狀病毒(Dioscorea alata bacilliform virus,DaBV)、淮山藥花葉病毒(Yam mosaic virus, YMV)、淮山藥溫和花葉病毒(Yam mild mosaicvirus, YMMV)、中國(guó)淮山藥壞死花葉病毒(Chinese yam necrotic mosaic virus, CYNMV)、日本淮山花葉病毒(Japanese yam mosaic virus, JYMV)、香豆萎蔫病毒 2 (Broad bean wiltvirus-2, BBWV-2)o我國(guó)已發(fā)現(xiàn)DaBV、YMMV、JYMV、CYNMV和BBWV-2侵染淮山藥，引發(fā)的癥狀包括花葉、斑駁、脈明、褪綠、生長(zhǎng)遲緩和葉片扭曲等。不同淮山藥病毒引起癥狀不同，也可以引起相似癥狀；其傳播介體不一樣，有不同的傳播途徑。為了保證淮山藥生產(chǎn)的正常進(jìn)行，首先要保證種薯不攜帶病毒，其次是在生產(chǎn)大田及時(shí)發(fā)現(xiàn)和鑒定病毒，以便制定有針對(duì)性的防治措施，包括控制傳播介體來切斷病毒病的傳播。因此，要求有靈敏度高、特異性好的病毒檢測(cè)技術(shù)來對(duì)淮山藥的種薯和田間樣本進(jìn)行檢測(cè)。目前，用于植物RNA病毒病原檢測(cè)的主要技術(shù)手段有 RT-PCR、IC-RT-PCR、qRT-PCR、LAMP-PCR、ELISA、Western blot 等，在病毒病原檢疫檢測(cè)方面應(yīng)用最多的是ELISA和qRT-PCR。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備、檢測(cè)及其應(yīng)用，以便用于快速檢測(cè)淮山藥溫和花葉病毒。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備方法，原核表達(dá)純化淮山藥溫和花葉病毒的NIb/CP蛋白并用于免疫家兔制備多克隆抗體。
[0005]NIb/CP蛋白具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列的基因所編碼。
[0006]上述的淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備方法，取純化后的NIb/CP蛋白，采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔，以后每2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入與蛋白等量的弗氏完全佐劑，后3次加入與蛋白等量的弗氏不完全佐劑；末次加強(qiáng)免疫7天后,心臟采血,分離血清；抗血清經(jīng)抗原親和純化獲得該病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗體。
[0007]所得淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體在檢測(cè)淮山藥溫和花葉病毒方面的應(yīng)用。
[0008]基于上述多克隆抗體的淮山藥溫和花葉病毒的ELISA檢測(cè)方法。[0009]上述ELISA檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0010](I)用ImL抗原包被緩沖液研磨0.1g淮山藥新鮮葉片，9000rpm離心5min,取上清液稀釋20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病葉為陽(yáng)性對(duì)照，未感染YMMV的健康葉為陰性對(duì)照，37°C孵育2h或4°C過夜；
[0011](2)用200 μ I PBST洗滌兩次后，用5%脫脂奶粉封閉30min ；
[0012](3)用200 μ I PBST洗滌兩次后，每個(gè)孔中加入用抗體稀釋緩沖液按照1:8000稀釋的YMMV多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室溫孵育3h ；
[0013](4)用200 μ I PBST洗滌兩次后，每個(gè)孔中加入用抗體稀釋緩沖液稀釋3000倍的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合物，100 μ I/孔，室溫孵育Ih ；
[0014](5)用200 μ I PBST洗滌三次后，用TMB底物顯色試劑盒(康為世紀(jì)公司)進(jìn)行顯色，室溫避光孵育25- 30min，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色，每孔再加入50 μ 10.5Μ H2SO4終止顯色，此時(shí)藍(lán)色產(chǎn)物變?yōu)榱咙S色，立即用酶標(biāo)儀讀取OD45tl的值，以與陰性O(shè)D值比值(Ρ/Ν)大于2.1為陽(yáng)性；
[0015]PBST 含 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl,0.05%Tween20,pH7.4 ;抗原包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液(30mM碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6);抗體稀釋緩沖液為 1%BSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
[0016]基于上述多克隆抗體的淮山藥溫和花葉病毒的Western blot檢測(cè)方法。
[0017]上述的Western blot檢測(cè)方法,包括以下步驟:
[0018](I)用TCA/丙酮沉淀法或采用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取淮山藥總蛋白樣品，用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL ；
[0019](2)制備蛋白電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE ；
[0020](3)半干式轉(zhuǎn)移:電泳結(jié)束后將凝膠割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5minX3次；預(yù)先裁好與凝膠同樣大小的濾紙和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，小心將膜放入雙蒸水中浸泡2min，再浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中IOmin ;轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、3層3mm濾紙、PVDF膜、凝膠、3層3mm濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，蓋好陰極碳板之后接通電源，恒流ImA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出；
[0021](4)免疫反應(yīng):用0.01M PBS洗膜，Imin ;加入封閉液,室溫封閉I~2h ;棄封閉液，用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗體稀釋緩沖液按照1:5000稀釋的YMMV多克隆抗體(一抗)，室溫孵育2h或4°C放置12h以上；陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同；棄一抗和1%834，用0.0現(xiàn)PBST分別洗膜，5minX4次；加入用抗體稀釋緩沖液稀釋3000倍的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合物(二抗)，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫孵育2h ；棄二抗，用0.01M PBST洗膜，5minX4次；采用ECL法進(jìn)行檢測(cè)；
[0022]轉(zhuǎn)膜緩沖液為25mM Tris, 192mM glycine, 0.01%SDS, 20%methanol, pH8.3 ；
0.01MPBS 含有 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl，135mM NaCl，pH7.4 ;封閉液為 5%脫脂奶粉或3%BSA。
[0023]基于上述多克隆抗體的淮山藥溫和花葉病毒的IC-RT-PCR檢測(cè)方法。
[0024]上述的IC-RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0025](I)用抗體稀釋緩沖液按照1:8000稀釋YMMV多克隆抗體，每個(gè)1.5mL的離心管中加入100 μ I稀釋好的抗體，37°C孵育Ih或室溫孵育3h ；
[0026](2)將淮山葉片與含2%PVP的0.02M PBS研磨緩沖液按質(zhì)量體積比0.2% (w/v)放入研缽中，研磨成葉汁勻衆(zhòng)，吸入1.5mL離心管中，9000rpm離心IOmin ；
[0027](3)將步驟(1)中包被好抗體的1.5mL離心管用PBST洗兩次，加入200 μ I步驟
(2)準(zhǔn)備好的葉汁上清液，37°C水浴3h，此時(shí)暴露的病毒顆粒特異性地附著于離心管內(nèi)壁上(免疫捕捉);
[0028](4)移去葉汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗畢作短暫離心去除管底余液；
[0029](5)用SuperRT —步法RT-PCR試劑盒(康為世紀(jì)公司)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè) YMMV，病毒檢測(cè)引物為 YMMV-F:5’ -GGCACACATGCAAATGAARGC-3’ 和 YMMV-R:5’ -CACCAGTAGAG TGAACATAG-3’，PCR 階段設(shè)置退火溫度為 55°C，35 個(gè)循環(huán)；
[0030](6) RT-PCR結(jié)束后，取5 μ I的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量體積濃度1.0% (w/v)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，預(yù)期片段大小為249bp。
[0031]抗體稀釋緩沖液為1%BSA, 0.01M PBS pH7.2。
[0032]為建立淮山藥溫和花葉病毒的檢測(cè)方法，發(fā)明人深入研究了 YMMV江西分離物(桂淮6號(hào)，采自江西省南昌市))的全長(zhǎng)基因組序列，該病毒的全長(zhǎng)基因組序列(見序列表SEQ.1D.N0.3)共有9536個(gè)核苷酸，5’非編碼區(qū)有137個(gè)堿基，3’非編碼區(qū)有144個(gè)堿基(不包括polyA的長(zhǎng)度)，編碼一個(gè)包含3084個(gè)氨基酸大的多聚蛋白，該多聚蛋白可被病毒自身編碼的蛋白酶剪切成10個(gè)蛋白質(zhì)，從5’端到3’端的順序編碼的蛋白分別為:P1 (320aa),HC-Pro (457aa)，P3 (348aa)，6Kl (51aa)，CI (643aa)，6K2 (52aa)，NIa VPg (191aa)，NIaPro (240aa), NIb (516aa)，CP (266aa)。基于YMMV基因組，發(fā)明人通過原核表達(dá)純化淮山藥溫和花葉病毒的核包涵體蛋白/外殼蛋白(NIb/CP)蛋白并用于免疫家兔制備多克隆抗體，該多克隆抗體能特異性識(shí)別原核表達(dá)YMMV的NIb/CP蛋白和侵染淮山藥的YMMV病毒的NIb/CP蛋白，并產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，其ELISA效價(jià)為1:64000，Western blot效價(jià)為1:10000。發(fā)明人更進(jìn)一步，基于針對(duì)YMMV外殼蛋白的特異性抗體，結(jié)合針對(duì)該病毒YMMV的基因組的特異性引物建立了 IC-RT-PCR方法，能夠高效、高靈敏和準(zhǔn)確地從感染YMMV的淮山藥植株中檢測(cè)出YMMV ;同理建立的ELISA和Westernblot方法也可以特異性地從感染YMMV的淮山藥植株中檢測(cè)出YMMV。應(yīng)用本發(fā)明提供的YMMV全基因組序列以及多克隆抗體，可為YMMV與寄主相互作用研究以及該病毒的快速檢測(cè)、分型和分子生物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，為該病毒的流行監(jiān)測(cè)和防治打下扎實(shí)基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1 是 YMMV 的 5’/3’RACE 電泳圖，圖中:M為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(O，GeneRulerlkbDNALadder, Thermo Scientific 公司)，I 為 5’ RACE 產(chǎn)物，2 為 3’ RACE 產(chǎn)物。
[0034]圖2是YMMV的分段PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中:M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(O，GeneRulerlkbDNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 為 YMMV 片段 2，2 為 YMMV 片段 3，3 為 YMMV 片段4，4為YMMV片段5。
[0035]圖3是YMMV的基因組結(jié)構(gòu)示意圖。
[0036]圖4是YMMV的多聚蛋白與其他馬鈴薯Y病毒屬病毒代表種的進(jìn)化關(guān)系圖。
[0037]圖5是YMMV的NIb/CP蛋白與其他不同地區(qū)和不同淮山藥品種中獲得的YMMV分離物的外殼蛋白進(jìn)化關(guān)系圖。
[0038]圖6是YMMV的外殼蛋白基因PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中:M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(O，GeneRulerlkb DNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，泳道 I ~3 為 3 個(gè)重復(fù)的 YMMV的NIb/CP蛋白基因的PCR產(chǎn)物。
[0039]圖7是原核表達(dá)載體pET30a-YMMV_Nib/CP的酶切驗(yàn)證電泳圖，圖中:M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(O，GeneRulerlkb DNA Ladder, Thermo Scientific 公司)，泳道 I ~3 為 3 個(gè)重復(fù)的連接上YMMV的NIb/CP蛋白基因的pET30a-YMMV-Nib/CP質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。
[0040]圖8是驗(yàn)證YMMV的NIb/CP基因的重組蛋白表達(dá)形式的SDS-PAGE圖，圖中:M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(PageRuler Unstained Protein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I 為未誘導(dǎo)樣品超聲波破碎細(xì)胞后離心收集的沉淀，2為誘導(dǎo)樣品超聲波破碎細(xì)胞后離心收集的沉淀，3為未誘導(dǎo)樣品超聲波破碎細(xì)胞后離心收集的上清，4為誘導(dǎo)樣品超聲波破碎細(xì)胞后離心收集的上清。
[0041]圖9是親和純化的YMMV的NIb/CP基因的重組蛋白的SDS-PAGE圖，圖中:M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(PageRuler Unstained Protein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I ~4為鎳柱純化的帶有6XHis標(biāo)簽的YMMV的NIb/CP蛋白的四次洗脫產(chǎn)物。
[0042]圖10是YMMV多克隆抗體效價(jià)測(cè)定圖，圖中:1為免疫前血清，2為純化抗體，3為檢測(cè)因子。
[0043]圖11是ACP-ELISA圖，圖中1_3是原核表達(dá)純化的YMMV_NIb/CP蛋白樣品，4-6是感染YMMV的淮山藥總蛋白樣品，7-9是未感染YMMV的健康淮山藥樣品，10-12是只加入蛋白裂解液的空白對(duì)照。
[0044]圖12 是 Western blot 圖，圖中:M 為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(PageRuler PrestainedProtein Ladder, Thermo Scientific 公司)，I ~6 為 YMMV 陰性樣品，7 ~9 為 YMMV 陽(yáng)性樣品。
[0045]圖13 是 IC-RT-PCR 圖，圖中:M 為 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(O，GeneRulerlOObp Plus DNALadder, Thermo Scientific公司)，I為空白對(duì)照,2為陰性對(duì)照(健康樣品),3為陽(yáng)性對(duì)照(YMMV感病樣品)，4-13為疑似YMMV病毒病的待測(cè)樣品(其中11的樣品經(jīng)ELISA檢測(cè)為YMMV陽(yáng)性)。
【具體實(shí)施方式】
[0046]以下所用材料包括:PrinK、STARKl HS高保真DNA聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。柱式 DNA膠回收試劑盒(Ε.Z.N.A* Gel Extraction Kit)購(gòu)自 OMEGA 公司。RNAplant
plus植物總RNA提取試劑、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，5’ /3’ RACE試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自Roche公司。TMB底物顯色試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。瓊脂糖為BIOWEST? Regular Agarose G-1O0胰蛋白胨、酵母提取物、尿素、BSA、PMSF、TEMED、DTT購(gòu)自Sigma公司。限制性內(nèi)切酶，RNase Inhibitor、IPTG、RevertAid?第一鏈cDNA合成試劑盒、dNTP、GeneRulerIkb DNA ladder、GeneRulerIkbplus DNA ladder、PageRuler Prestained Protein LadderΛPageRuIer Unstained ProteinLadder購(gòu)自Thermo Scientific公司。氨節(jié)青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、RNaseA、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、甘氨酸、溶菌酶等購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。其它試劑均為分析純。
[0047]一、YMMV的全長(zhǎng)基因組序列的克隆
[0048]1.1YMMV的3’端序列克隆
[0049]根據(jù)高通量測(cè)序獲得的YMMV的序列，設(shè)計(jì)一條正向引物(YMMV-8242F:5’-GAGGAAGAGCGGATTGTTGC-3’，見序列表 SEQ.1D.N0.4)，利用 5’/3’RACE 試劑盒(Roche 公司)合成 YMMV 的 3’端的 cDNA。在 20 μ I 的體系中加入 7 μ I (IdH2O(RNase-Free)JyUA5X cDNA synthesis buffer, I μ I NlT (10 μ Μ) (NIT:5’-GACCACGCGTATCGATGTCGAC(T) 17V-3’，見序列表SEQ .1D.N0.5，試劑盒提供)，5 μ I受YMMV侵染的桂淮6號(hào)總RNA (約I μ g)和2 μ I dNTP (IOmM), I μ I Transcriptor Reverse Transcriptase,混勻，55。。反應(yīng) 60min,然后在85°C反應(yīng)5min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以反轉(zhuǎn)錄獲得的第一鏈cDNA為模板，YMMV-8242F和 NI (N1:5’ -GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3’，見序列表 SEQ.1D.N0.6，試劑盒提供)為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出一條特異性預(yù)期大小為1290bp的帶(圖1，泳道2)。利用pCR2.1PCR產(chǎn)物克隆試劑盒直接克隆3’RACE PCR產(chǎn)物。連接反應(yīng)體系為:1 μ I新鮮PCR產(chǎn)物，2 μ 15X連接酶Buffer，I μ I pCR2.lvector,5y I ddH20和I μ I T4DNA連接酶。連接反應(yīng)液在室溫放置，反應(yīng)30min后用于轉(zhuǎn)化Ε.coli DH5 α的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在加有100 μ g/L的氨芐青霉素、10 μ L IPTG (24mg/mL)和 20μ L X-Gal (20mg/mL)的 LA 培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng) 18 小時(shí)。挑取白色菌落提取質(zhì)粒，并用EcoR I酶切鑒定，挑選3個(gè)鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，將重組質(zhì)粒命名為pCR-YMMV-3。
[0050]1.2YMMV 的 5’ 端 cDNA 的克隆
[0051]根據(jù)高通量測(cè)序獲得的YMMV的序列，設(shè)計(jì)兩條反向引物(YMMV-996R:5，-GCGAACTATCATATGTGAACCTGT-3，，見序列表 SEQ.1D.N0.7) ;YMMV-928R:5’ -CGCTACAACCTCGTGTGATT-3’，見序列表 SEQ.1D.N0.8)，利用 5’ /3’ RACE 試劑盒(Roche)合成 YMMV 的 5’端的 cDNA。在 20 μ I 的體系中加入 7μ I ddH20 (RNase-Free), 4 μ I 的 cDNAsynthesis buffer, 2 μ IdNTP (IOmM), I μ I YMMV-996R(10 μ Μ)，5 μ I 受 YMMV 侵染的桂淮 6號(hào)總 RNA (約 I μ g)和 I μ I Transcriptor Reverse Transcriptase 混勻，55°C 反應(yīng) 60 分鐘，然后在85°C反應(yīng)5分鐘使轉(zhuǎn)錄酶失活。反應(yīng)結(jié)束后，用Roche的高純PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化第一鏈cDNA產(chǎn)物(根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作)。取19 μ I純化的第一鏈cDNA產(chǎn)物，加入2.5 μ IlOXReaction Buffer, 2mM dATP，輕柔混勻并短暫離心，于94°C反應(yīng)3分鐘，立即置于冰上。短暫離心，加入I μ I的末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal Transferase),輕柔混勻并置于37V反應(yīng)20分鐘。然后在70°C反應(yīng)10分鐘以使末端轉(zhuǎn)移酶失活。取5 μ I已經(jīng)加了 A 尾巴的 cDNA 作為模板，加入 I μ I Oligo dT-anchor primer (NIT), I μ 1YMMV-996R,I μ IdNTP (IOmM), 5 μ IlOXReaction Buffer, 0.5 μ I Taq DNA Polymerase (5υ/μ1)和36.5 μ I ddH20,進(jìn)行第一次PCR，再以第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍為模板，以YMMV-928R和NI為引物進(jìn)行第二次PCR，擴(kuò)增出一條特異性預(yù)期大小為928bp的帶(圖1，泳道I)。利用pCR2.1PCR產(chǎn)物克隆試劑盒直接克隆5’ RACE PCR產(chǎn)物。連接反應(yīng)體系為:I μ I新鮮PCR產(chǎn)物，2 4 15父連接酶81^€61'，14 1 pCR2.lvector, 5 μ I ddH20 和 I μ I T4DNA 連接酶。連接反應(yīng)液在室溫放置，反應(yīng)30分鐘后用于轉(zhuǎn)化E.coli DH5a的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在加有100 μ g/L 的氨芐青霉素、10 μ L IPTG (24mg/mL)和 20 μ L X-Gal (20mg/mL)的 LA 培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)18小時(shí)。挑取白色菌落提取質(zhì)粒，并用EcoR I酶切鑒定，挑選3個(gè)鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，將重組質(zhì)粒命名為pCR-YMMV-5。
[0052]1.3克隆測(cè)序驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果
[0053]根據(jù)高通量測(cè)序獲得的序列和3’ RACE以及5’ RACE的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)四對(duì)引物:
[0054]YMMV-839F:5’ -CGCAAGTTATAGCACCAATCCA-3’，見序列表 SEQ.1D.N0.9，
[0055]YMMV-3172R:5’ -CACCTCCAACCGTTCTCAATG-3，，見序列表 SEQ.1D.N0.10 ；
[0056]YMMV-3092F:5，-GGATGAGGACTGGTGTTAGGAT-3，，見序列表 SEQ.1D.N0.11 ；[0057]YMMV-5038R:5’ -TGACTACGGAATGTGGTATTGC-3’，見序列表 SEQ.1D.N0.12 ；
[0058]YMMV-4787F:5，-AGGCGGCGTTCTTGAGTT-3，，見序列表 SEQ.1D.N0.13 ；
[0059]YMMV-7000R:5，-CTTGTTCCAGATCCATGAGTAGTT-3，，見序列表 SEQ.1D.N0.14 ；
[0060]YMMV-6942F:5’ -AAGCAGCACACCATCAGAAC-3，，見序列表 SEQ.1D.N0.15 ；
[0061]YMMV-8458R:5’ -TCCGAAGAGCGTATTCAGAGAT-3’，見序列表 SEQ.1D.N0.16。
[0062]預(yù)期片段大小分別為2334bp、1947bp、2214bp 和 1517bp。以 3’ RACE 的 cDNA為模板，分別用這四對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得預(yù)期大小的目的片段(圖2)，分別克隆至pCR2.lvector并挑取3個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。
[0063]通過3’ RACE、5’ RACE和分段克隆測(cè)序最終拼接獲得包含9536nt的YMMV的全長(zhǎng)基因組序列(不包括PolyA的長(zhǎng)度)，5’非編碼區(qū)有137個(gè)堿基，3’非編碼區(qū)有144個(gè)堿基，經(jīng)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和同源序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其編碼一個(gè)包含3084個(gè)氨基酸大的多聚蛋白，該多聚蛋白可被病毒自身編碼的蛋白酶剪切成10個(gè)蛋白質(zhì)(圖3)，從5’端到3’端的順序編碼的蛋白分別為:Pl (320aa), HC-Pro (457aa)，P3 (348aa)，6Kl (51aa)，CI (643aa)，6K2(52aa), NIa VPg (191aa), NIa Pro (240aa), NIb (516aa), CP (266aa)。
[0064]分別選取多聚蛋白和外殼蛋白的氨基酸序列用MEGA4.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，均顯示該病毒與YMMV巴西分離物在進(jìn)化上的關(guān)系最近(圖4和圖5)。
[0065]二、原核表達(dá)純化外殼蛋白并制備多克隆抗體
[0066]2.1引物設(shè)計(jì)與合成
[0067]根據(jù)3’ RACE獲得的YMMV的3’端部分序列(GenBank JF357963)設(shè)計(jì)并由生工生物工程(上海)有限公司合成一對(duì)特異性引物YMMVNIbCP-F: 5’ -CCCGAATTCATGTCGCACAAAGCAGTTAAG-3’(見序列表 SEQ.1D.N0.17)和 YMMVNIbCP-R:5，-CCCGTCGACCTAGATATTGCGCACTCCAAG-3’(見序列表SEQ.1D.N0.18)。上游引物YMMVNIbCP-F位于NIb基因編碼區(qū)，并在其中引入一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。下游引物YMMVNIbCP-R與CP基因編碼區(qū)3’端序列互補(bǔ)，并在終止密碼子的下游加入一個(gè)Sal I酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為1191bp，包括部分NIb和完整CP基因以及酶切位點(diǎn)序列。
[0068]2.2NIb/CP基因的克隆與序列測(cè)定
[0069]以感染YMMV的桂淮6號(hào)病葉為材料，用RNAplant plus植物總RNA提取試劑按照說明書的方法提取病葉的總RNA。取I μ g總RNA為模板，采用RevertAid?第一鏈cDNA合成試劑盒，根據(jù)說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)程序以O(shè)ligleDT (18)為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后取I μ L稀釋20倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，加入10 μ M的YMMVNIbCP-F和YMMVNIbCP-R引物各 2μ L，10μ L5XPCR buffer,0.5 μ LlOmM dNTP,0.25 μ L PrimcSTARK HS 高保真 DNA聚合酶，36.25 μ L ddH20，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性3min，98°C變性IOsec,55°C退火15sec，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)，最后在進(jìn)行72°C反應(yīng)5min。PCR產(chǎn)物采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳(圖6)，切膠回收純化目的DNA片段后，與用Sma I切開pUC19平端載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，用EcoR I/Sal I I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，選擇鑒定正確的克隆送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，核苷酸和氨基酸序列采用Vector NTI Advance?10軟件進(jìn)行比對(duì)分析(見序列表SEQ.1D.N0.1 和 SEQ.1D.N0.2)。
[0070]2.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0071]將純化的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，回收目的基因片段與用相同酶切的pET30a連接。取5yL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI和Sal I雙酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆(圖7)，獲得鑒定正確的原核表達(dá)載體pET30a-YMMV-NIbCP。再將該表達(dá)載體和對(duì)照空載體pET30a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)PLysS感受態(tài)細(xì)胞，用卡那霉素抗性篩選獲得攜帶目標(biāo)表達(dá)載體pET30a-YMMV-NIbCP和空載體pET30a的表達(dá)菌株。
[0072]2.4誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化
[0073]挑取新鮮培養(yǎng)的含pET30a-YMMV_NIbCP表達(dá)載體的BL21 (DE3) pLysS單菌落，接種于I mL含50 μ g/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，同時(shí)以含空質(zhì)粒pET30a的BL21(DE3)pLysS菌作對(duì)照。按1:100的比例將過夜培養(yǎng)的菌液加入到5mL新鮮的含25 μ g/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，其中含空質(zhì)粒pET30a的BL21 (DE3)pLysS菌I小瓶，含pET30a-YMMV-NIbCP表達(dá)載體的BL21 (DE3) pLysS菌6小瓶。37°C繼續(xù)振搖培養(yǎng)3h左右至OD600=0.4~0.6，然后向含pET30a-YMMV-NIbCP表達(dá)載體的BL21 (DE3) pLysS菌液中加入化學(xué)誘導(dǎo)劑 IPTG 至終濃度分別為 0mM、0.lmM、0.4mM、0.8mM、l.2mM、2.0mM，繼續(xù) 28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)6h后從搖床取出置于冰上IOmin使菌體停止生長(zhǎng),然后1000Orpm離心Imin收集菌體，用PBS (pH7.4)清洗一次，再懸浮于200 μ IPBS (ρΗ7.4)，取30 μ I懸浮液加入10 μ 14 X蛋白上樣緩沖液，煮沸10min，12000rpm離心2min,取10 μ I上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果選擇梯度誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)量最好的IPTG濃度進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。
[0074]2.5表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析
[0075]取5mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，1000Orpm離心2min收集菌體,用PBS清洗一次,再懸浮于200 μ I PBS (ρΗ7.4)，用SONICS Uibra Cell?超聲波破碎細(xì)胞，Amp (與功率對(duì)應(yīng))參數(shù)設(shè)置為38%，每次lOSec，間隔lOSec，直至菌液變澄清。4°C，12000rpm離心30min，取上清液于新的離心管。沉淀用200μ I含8M脲的PBS充分溶解，12000rpm離心lOmin。分別取10 μ I上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(圖8)。
[0076]2.6YMMV-NIb-CP重組蛋白的純化
[0077]該表達(dá)載體含有6XHis標(biāo)簽,所以根據(jù)QIAexpressionist?手冊(cè)采用親合層析方法進(jìn)行蛋白純化，將IOOmL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液用400mL Beckman離心管收集,在Beckman高速離心機(jī)上1000Orpm離心5min收集菌體,置于_20°C放置30min。然后于冰上融化30min,此時(shí)菌體在自身表達(dá)的溶菌酶的作用下開始發(fā)生裂解。用Lysis Buffer (IOOmM NaH2P04,IOmM Tris.Cl,8M urea, pH8.0)重懸菌液,超聲波破碎細(xì)胞,直至菌液變澄清。12000rpm離心20min，取上清液與用Lysis Buffer平衡的N1-NTA樹脂充分混勻，裝柱，然后先用WashBufferC IOOmM NaH2P04, IOmM Tris ?Cl, 8M urea,ρΗ6.3)洗脫雜蛋白，再用 Elution Buffer(IOOmM NaH2PCM, IOmM Tris.C1，8M urea, pH4.5)連續(xù)洗脫目的蛋白，分管收集洗脫液，每管收集lmL，分別取10 μ I蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的純化效果(圖9)。
[0078]2.7多克隆抗體制備及效價(jià)測(cè)定
[0079]取純化后的重組蛋白2mL，采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔(免疫前采集正常血清作為陰性對(duì)照)，以后每2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入與蛋白等量的弗氏完全佐劑，后3次加入與蛋白等量的弗氏不完全佐劑；末次加強(qiáng)免疫7d后,心臟米血，分離血清；抗血清經(jīng)抗原親和純化獲得該病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗體。
[0080]以原核表達(dá)的YMMV NIb/CP為抗原，經(jīng)ELISA法測(cè)定，純化后的多克隆抗體效價(jià)為I:64000 (圖 10)。
[0081]三、基于YMMV外殼蛋白多克隆抗體的檢測(cè)方法
[0082]3.1間接抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測(cè)病毒
[0083]ACP-ELISA方法的操作步驟:
[0084](I)用ImL抗原包被緩沖液研磨0.1g淮山藥新鮮葉片，9000rpm離心5min,取上清液稀釋20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病葉為陽(yáng)性對(duì)照，未感染YMMV的健康葉為陰性對(duì)照，3 7°C孵育2h或4°C過夜；
[0085](2)用200 μ I PBST洗滌兩次后，用5%脫脂奶粉封閉30min ；
[0086](3)用200 μ I PBST洗滌兩次后，每個(gè)孔中加入用抗體稀釋緩沖液按照1:8000稀釋的YMMV多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室溫孵育3h ；
[0087](4)用200 μ I PBST洗滌兩次后，每個(gè)孔中加入用抗體稀釋緩沖液稀釋3000倍的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合物(Abmart)，100 μ I/孔，室溫孵育Ih ；
[0088](5)用200 μ I PBST洗滌三次后，用TMB底物顯色試劑盒(康為世紀(jì)公司)進(jìn)行顯色(圖11)，室溫避光孵育25-3011^11，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色，每孔再加入5(^10.51 H2SO4終止顯色，此時(shí)藍(lán)色產(chǎn)物變?yōu)榱咙S色，立即用酶標(biāo)儀讀取OD45tl的值，以與陰性O(shè)D值比值(Ρ/Ν)大于
2.1為陽(yáng)性。
[0089]其中，PBST含 3.2mM Na2HPO4, 0.5mM KH2PO4, 1.3mM KCl，135mM NaCl,
0.05%Tween20, pH7.4 ;抗原包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液(30mM碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，ρΗ9.6);抗體稀釋緩沖液為 1%BSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
[0090]3.2蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)方法檢測(cè)病毒
[0091]Western blot方法的操作步驟:
[0092](I)用TCA/丙酮沉淀法或采用蛋白質(zhì)提取試劑盒(康為世紀(jì))提取淮山藥總蛋白樣品，用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL ；
[0093](2)制備蛋白電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE ；
[0094](3)半干式轉(zhuǎn)移:電泳結(jié)束后將凝膠割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5minX3次；預(yù)先裁好與凝膠同樣大小的濾紙和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，小心將膜放入雙蒸水中浸泡2min，再浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中IOmin ;轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、3層3mm濾紙、PVDF膜、凝膠、3層3mm濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，蓋好陰極碳板之后接通電源，恒流ImA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出；[0095](4)免疫反應(yīng):用 0.01M PBS (3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mMNaCl，pH7.4)洗膜，lmin ;加入封閉液(5%脫脂奶粉或3%BSA)，室溫封閉I~2h ;棄封閉液，用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗體稀釋緩沖液按照1:5000稀釋的YMMV多克隆抗體(一抗)，室溫孵育2h或4°C放置12h以上；陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同；棄一抗和1%834，用0.0現(xiàn)PBST分別洗膜，5minX4次；加入用用抗體稀釋緩沖液稀釋3000倍的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合物(二抗)，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫孵育2h ;棄二抗，用 0.01M PBST 洗膜，5minX4 次；采用 ECL 法(PierceK ECL Western BlottingSubstrate, Thermo Scientific)進(jìn)行檢測(cè)(圖 12)；
[0096]其中，轉(zhuǎn)膜緩沖液為25mM Tris, 192mM glycine, 0.01%SDS, 20%methanol, pH8.3 ；
0.01M PBS 含有 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl，135mM NaCl，pH7.4 ;封閉液為 5%脫脂奶粉或3%BSA。
[0097]3.3用免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IC-RT-PCR)方法檢測(cè)病毒
[0098]IC-RT-PCR方法的操作步驟:
[0099](1)用抗體稀釋緩沖液按照1:8000稀釋YMMV多克隆抗體，每個(gè)1.5mL的離心管中加入100 μ I稀釋好的抗體，37°C孵育Ih或室溫孵育3h ；
[0100](2)將淮山葉片與研磨緩沖液(0.02M PBS，2%PVP)按0.2% (w/v)放入研缽中，研磨成葉汁勻衆(zhòng)，吸入1.5mL離心管中，9000rpm離心IOmin ；
[0101](3)將步驟(1)中包被好抗體的1.5mL離心管用PBST洗兩次，加入200 μ I步驟
(2)準(zhǔn)備好的葉汁上清液，37°C水浴3h，此時(shí)暴露的病毒顆粒特異性地附著于離心管內(nèi)壁上(免疫捕捉);
[0102](4)移去葉汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗畢作短暫離心去除管底余液；
[0103](5)用SuperRT —步法RT-PCR試劑盒(康為世紀(jì)公司)按照說明書進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)，YMMV 檢測(cè)引物為 YMMV-F:5’-GGCACACATGCAAATGAARGC-3’(見序列表 SEQ.1D.N0.19)和 YMMV-R:5’-CACCAGTAGAGTGAACATAG-3’(見序列表 SEQ.1D.N0.20), PCR 階段設(shè)置退火溫度為55°C，35個(gè)循環(huán)；
[0104](6)RT_PCR結(jié)束后，取5μ I的PCR產(chǎn)物用L 0% (w/v)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，預(yù)期片段大小為249bp (圖13)；
[0105]其中，抗體稀釋緩沖液為1%BSA，0.01M PBS pH7.2。
【權(quán)利要求】
1.一種淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備方法，其特征在于:原核表達(dá)純化淮山藥溫和花葉病毒的NIb/CP蛋白并用于免疫家兔制備多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備方法，其特征在于:所述NIb/CP蛋白具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的堿基序列的基因所編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備方法，其特征在于:取純化后的NIb/CP蛋白，采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔，以后每2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入與蛋白等量的弗氏完全佐劑，后3次加入與蛋白等量的弗氏不完全佐劑；末次加強(qiáng)免疫7天后，心臟采血，分離血清；抗血清經(jīng)抗原親和純化獲得該病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗體。
4.權(quán)利要求1至3所得淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體在檢測(cè)淮山藥溫和花葉病毒方面的應(yīng)用。
5.基于權(quán)利要求1所述多克隆抗體的淮山藥溫和花葉病毒的ELISA檢測(cè)方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: (1)用ImL抗原包被緩沖液研磨0.1g淮山藥新鮮葉片，9000rpm離心5min,取上清液稀釋20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病葉為陽(yáng)性對(duì)照，未感染YMMV的健康葉為陰性對(duì)照，37°C孵育2h或4°C過夜； (2)用200μ I PBST洗滌兩次后，用5%脫脂奶粉封閉30min ； (3)用200μ I PBST洗滌兩次后，每個(gè)孔中加入用抗體稀釋緩沖液按照1:8000稀釋的YMMV多克隆抗體，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室溫孵育3h ； (4)用200μ I PBST洗滌兩次后，每個(gè)孔中加入用抗體稀釋緩沖液稀釋3000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合物，100 μ I/孔，室溫孵育Ih ； (5)用200μ I PBST洗滌三次后，用TMB底物顯色試劑盒進(jìn)行顯色，室溫避光孵育.25-3011^11，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色，每孔再加入5(^10.5Μ H2SOjS止顯色，此時(shí)藍(lán)色產(chǎn)物變?yōu)榱咙S色，立即用酶標(biāo)儀讀取OD45tl的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性；
所述 PBST 含 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl，0.05%Tween20,pH7.4 ;所述抗原包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液，30mM碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6 ;所述抗體稀釋緩沖液為P/oBSA, 0.01M PBS ρΗ7.2。
7.基于權(quán)利要求1所述多克隆抗體的淮山藥溫和花葉病毒的Westernblot檢測(cè)方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的Westernblot檢測(cè)方法,其特征在于包括以下步驟: (1)用TCA/丙酮沉淀法或采用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取淮山藥總蛋白樣品,用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL ； (2)制備蛋白電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE； (3)半干式轉(zhuǎn)移:電泳結(jié)束后將凝膠割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5minX3次；預(yù)先裁好與凝膠同樣大小的濾紙和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，小心將膜放入雙蒸水中浸泡.2min，再浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中IOmin ;轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、3層3mm濾紙、PVDF膜、凝膠、3層3mm濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，蓋好陰極碳板之后接通電源，恒流ImA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出；(4)免疫反應(yīng)：用0.01M PBS洗膜，Imin ;加入封閉液，室溫封閉I~2h ;棄封閉液，用0.01M PBST洗膜，5minX3次；加入用抗體稀釋緩沖液按照1:5000稀釋的YMMV多克隆抗體，室溫孵育2h或4°C放置12h以上；陰性對(duì)照，以1%BSA取代ー抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同；棄ー抗和1%BSA，用0.01M PBST分別洗膜，5minX4次；加入用抗體稀釋緩沖液稀釋.3000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合物，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫孵育2h ;棄二抗，用0.OlM PBST洗膜，5minX4次；采用ECL法進(jìn)行檢測(cè)；
所述轉(zhuǎn)膜緩沖液為 25mM Tris, 192mM glycine, 0. 01%SDS, 20%methanol, pH8. 3 ;所述0.01M PBS 含有 3. 2mM Na2HPO4,0. 5mM KH2PO4,1. 3mM KCl，135mM NaCl，pH7. 4 ;所述封閉液為5%脫脂奶粉或3%BSA。
9.基于權(quán)利要求1所述多克隆抗體的淮山藥溫和花葉病毒的IC-RT-PCR檢測(cè)方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的IC-RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟： (1)用抗體稀釋緩沖液按照1:8000稀釋YMMV多克隆抗體，每個(gè)15mL的離心管中加入100 u I稀釋好的抗體，37°C孵育Ih或室溫孵育3h ； (2)將淮山葉片與含2%PVP的0.02M PBS研磨緩沖液按質(zhì)量體積比0. 2%放入研缽中，研磨成葉汁勻衆(zhòng)，吸入I. 5mL離心管中，9000rpm離心IOmin ； (3)將步驟（I)中包被好抗體的I.5mL離心管用PBST洗兩次，加入200 U I步驟（2)準(zhǔn)備好的葉汁上清液，37°C水浴3h ； (4)移去葉汁，PBST洗3次，DEPC水洗I次，洗畢作短暫離心去除管底余液； (5)用SuperRT—步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)引物為YMMV-F ：5’ -GGCACACATGCAAATGAARGC-3’ 和 YMMV-R :5’ -CACCAGTAGAGTGAACATAG-3’，PCR 階段設(shè)置退火溫度為55°C，35個(gè)循環(huán)； (6)RT-PCR結(jié)束后，取5 u I的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量體積濃度I. 0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。所述抗體稀釋緩沖液為1%BSA, 0.01M PBS pH7.2。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103539856SQ201310541297
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】陳保善, 鄒承武, 蒙姣榮, 張蕾, 盧曉靜 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)