專利名稱：大熊貓冷凍精液制備新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種圈養(yǎng)動(dòng)物精液的冷凍保存，特別是涉及ー種大熊貓冷凍精液制備新方法。
背景技術(shù)：
大熊貓冷凍精液技術(shù)首先在1980年由成都動(dòng)物園建立，當(dāng)時(shí)采用的是顆粒凍精制備技術(shù)，所用的方法借鑒了牛冷凍精液制備技術(shù)，結(jié)果由于存在冷凍精液質(zhì)量較差，重復(fù)性差以及無法直接標(biāo)記等問題，該方法現(xiàn)在已經(jīng)被淘汰，從上世紀(jì)90年代末期開始大熊貓細(xì)管凍精逐漸應(yīng)用到大熊貓繁殖中，大熊貓細(xì)管凍精通常采用手工冷凍、程序降溫與液氮運(yùn)輸罐冷凍法制備，具體情況如下: (I)手工冷凍法《大熊貓電刺激采精及精液冷凍保存研究》(黃炎等，四川師范學(xué)院學(xué)報(bào).自然科學(xué)版.2000年9月第21卷第3期)，采用蔗糖-卵黃-甘油液或者Test液等冷凍稀釋液，將精液稀釋及平衡好后，用0.25ml細(xì)管將精液分裝并封ロ，采用兩步法冷凍精液。第一歩:將細(xì)管放置在預(yù)冷好的冷凍架上層(距液氮面7.5cm),時(shí)間I分鐘。第二步:將上層的細(xì)管移到冷凍架下層(距液氮面2.5cm),放置I分鐘，然后將細(xì)管直接投入液氮完成冷凍過程。(2)程序降溫法程序降溫法與手工細(xì)管法的主要區(qū)別在于使用的冷凍工具不同。程序降溫法采用程序冷凍儀進(jìn)行冷凍，手工細(xì)管法利用簡易冷凍架進(jìn)行冷凍。采用程序降溫法，由于同一批次凍精冷凍條件完全一致，穩(wěn)定性要高于后者，同時(shí)可設(shè)計(jì)不同的冷凍程序冷凍精液，但程序冷凍儀價(jià)格昂貴、毎次冷凍需耗用大量液氮，冷凍成本較高是其缺點(diǎn)。( 3 )液氮運(yùn)輸罐冷凍法該法利用專門的液氮運(yùn)輸罐中的液氮蒸氣進(jìn)行精液冷凍。操作簡單，不需額外添加液氮，只需將平衡井分裝好的精液細(xì)管直接投入罐內(nèi)樣品筒內(nèi)即可，特別適合于野外使用。主要缺點(diǎn)在于可制備的凍精數(shù)量有限。以上三種大熊貓細(xì)管凍精制備方法中，第一種方法即手工冷凍法以其操作簡單，方便，快捷，液氮耗費(fèi)少，效果良好在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用與報(bào)道，但是該方法尚存在ー些問題:主要問題在于用該方法制備的凍精質(zhì)量在不同制作批次間重復(fù)性較差，原因在于該凍精制備方法主要根據(jù)液氮面距離冷凍架的高度來進(jìn)行冷凍，而液氮面到冷凍架的高度是ー個(gè)非常粗略的指標(biāo)，難以確切把握，導(dǎo)致每次冷凍凍精時(shí)冷凍面溫度實(shí)際上是不確定的，而冷凍面溫度不確定可直接導(dǎo)致不同批次間凍精冷凍速度差異較大，而冷凍速度差異可直接影響凍精質(zhì)量，這是導(dǎo)致現(xiàn)報(bào)道的大熊貓細(xì)管凍精制備方法制作的凍精質(zhì)量不穩(wěn)定的重要原因
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是ー種在簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的條件下如何保障各批次間高質(zhì)量冷凍精液的穩(wěn)定制備的大熊貓冷凍精液制備新方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明ー種大熊貓冷凍精液制備新方法，包括以下步驟:A.采集雄性大熊貓精液，對精液進(jìn)行稀釋，將稀釋的精液保存在冷藏裝置中；B.經(jīng)冷藏平衡數(shù)小時(shí)后，對稀釋的精液進(jìn)行檢查；所述平衡的作用是讓甘油充分地滲透到精液中，在冷凍時(shí)對精液起到保護(hù)作用；C.將經(jīng)檢查合格的精液吸入細(xì)管內(nèi)，并將細(xì)管封ロ ；D.將至少有上下兩層的冷凍支架放入冷凍箱體內(nèi)，往冷凍箱體內(nèi)倒入低于下層冷凍支架頂端面的液氮，即在冷凍箱體內(nèi)，液氮面低于下層冷凍支架頂端面；E.檢測、調(diào)整上層冷凍支架頂端面的冷凍面溫度，當(dāng)所述的冷凍面溫度為-100°C至 _70°C時(shí)，將細(xì)管放置在上層冷凍支架頂端面上，用冷凍箱蓋封蓋冷凍箱體達(dá)30 90秒后，揭開冷凍箱蓋，將細(xì)管挪置下層冷凍支架頂端面上，再次用冷凍箱蓋封蓋冷凍箱體達(dá)30 90秒后，揭開冷凍箱蓋，將細(xì)管挪入冷凍箱體內(nèi)的液氮中，待平衡后，將細(xì)管從冷凍箱體內(nèi)的液氮中取出，然后放置在液氮罐內(nèi)長期保存；所述的平衡是指細(xì)管溫度與液氮溫度相等。所述的冷凍面是指上層冷凍支架頂端的整個(gè)平面；冷凍面的溫度用低溫溫度計(jì)檢測，檢測吋，低溫溫度計(jì)探頭直接放在上層冷凍支架頂端面上；當(dāng)冷凍面溫度過高吋，往冷凍箱體內(nèi)倒入適當(dāng)量的液氮，當(dāng)冷凍面溫度過低時(shí)，適當(dāng)敞開冷凍箱體一段時(shí)間讓液氮自然揮發(fā)提高冷凍面溫度。所述的ー種 大熊貓冷凍精液制備新方法，其冷凍支架的上下兩層的高度差為^cm 8cm0所述的ー種大熊貓冷凍精液制備新方法，其冷凍支架的上下兩層分別由兩部分單獨(dú)構(gòu)成，上層冷凍支架的高度為12cm，下層冷凍支架的高度為6cm。下面就常規(guī)冷凍法和本發(fā)明的冷凍面溫度冷凍法的詳細(xì)情況進(jìn)行說明。常規(guī)冷凍法:第一歩:將細(xì)管放置在預(yù)冷好的冷凍架上層(距液氮面7.5cm),時(shí)間I分鐘；第二歩:將上層的細(xì)管移到冷凍架下層(距液氮面2.5cm)，放置I分鐘，然后將細(xì)管直接投入液氮完成冷凍過程。冷凍面溫度冷凍法:第一步調(diào)整上層冷凍面溫度為-70 _100°C (冷凍面溫度用液氮調(diào)整);第二步將細(xì)管放置在已調(diào)整好冷凍面溫度的冷凍架上層，時(shí)間I分鐘；第ニ步是將上層的細(xì)管移到冷凍架下層(距液氮面I 4cm)，放置I分鐘，然后將細(xì)管直接投入液氮完成冷凍過程。將采用冷凍面溫度作為冷凍指標(biāo)(方法2)與距離液氮面的高度(方法I)作為冷凍指標(biāo)的效果進(jìn)行比較，結(jié)果表1:表1.不同冷凍方法冷凍效果比較
權(quán)利要求
1.一種大熊貓冷凍精液制備新方法，包括以下步驟: A.采集雄性成年大熊貓精液，對精液進(jìn)行稀釋，將稀釋的精液保存在冷藏裝置中； B.經(jīng)冷藏平衡數(shù)小時(shí)后，對稀釋的精液進(jìn)行檢查； C.將經(jīng)檢查合格的精液吸入細(xì)管(2)內(nèi)，并將細(xì)管(2)封ロ； D.將至少有上、下兩層的冷凍支架放入冷凍箱體(5)內(nèi)，往冷凍箱體(5)內(nèi)倒入低于下層冷凍支架(4)頂端面的液氮(3); E.檢測、調(diào)整上層冷凍支架(I)頂端面的冷凍面溫度，當(dāng)所述的冷凍面溫度為-100°C至 -70°C時(shí)，將細(xì)管(2)放置在上層冷凍支架(I)頂端面上，用冷凍箱蓋(6)封蓋冷凍箱體(5)達(dá)30 90秒后，揭開冷凍箱蓋(6)，將細(xì)管(2)挪置下層冷凍支架(4)頂端面上，再次用冷凍箱蓋(6 )封蓋冷凍箱體(5 )達(dá)30 90秒后，揭開冷凍箱蓋(6 )，將細(xì)管(2 )挪入冷凍箱體(5)內(nèi)的液氮(3)中，待平衡后，將細(xì)管(2)從冷凍箱體(5)內(nèi)的液氮(3)中取出，然后放直在液氣te內(nèi)保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種大熊貓冷凍精液制備新方法，其特征在于:冷凍支架的上下兩層的高度差為3cm 8cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種大熊貓冷凍精液制備新方法，其特征在于:冷凍支架的上下兩層分別由兩部分單獨(dú)構(gòu)成，上層冷凍支架(I)的高度為12cm，下層冷凍支架(4)的高度 為6cm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大熊貓冷凍精液制備新方法，其在冷凍箱體(5)內(nèi)放置上、下兩層冷凍支架后，往冷凍箱體(5)內(nèi)倒入液氮(3)，當(dāng)上層冷凍支架(1)頂端面達(dá)到-100℃至～-70℃時(shí)，將裝有成年大熊貓精液的細(xì)管(2)依次放置在上、下兩層冷凍支架上，各放置30～90秒后，將細(xì)管(2)挪入冷凍箱體(5)內(nèi)的液氮(3)中，待平衡后，將細(xì)管(2)再放置在液氮罐內(nèi)長期保存；由于本發(fā)明將大熊貓精液的初次冷凍溫度由離液氮面的距離確定改為由低溫溫度計(jì)測定的冷凍面溫度范圍確定，既簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，還使得不同批次間的冷凍精液因冷凍條件一致，從而實(shí)現(xiàn)了高質(zhì)量的冷凍精液的穩(wěn)定制備，極大地推動(dòng)了國寶大熊貓保護(hù)工作的進(jìn)步。
文檔編號(hào)A01N1/02GK103120156SQ20131007130
公開日2013年5月29日 申請日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者侯蓉, 張志和, 劉玉良, 王海瑞, 蔡志剛, 蘭景超 申請人:成都大熊貓繁育研究基地