茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于茶樹(shù)基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹(shù)葉片過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因及其編碼蛋白，同時(shí)還涉及利用調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因表達(dá)強(qiáng)度在茶樹(shù)低溫防御中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明給出了一種茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因，為SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)給出了上述基因編碼的蛋白質(zhì)，為SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)給出了上述基因的用途，用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抵御低溫脅迫能力得以增強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEX11基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于茶樹(shù)基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹(shù)葉片過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因及其編碼蛋白，同時(shí)還涉及利用調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因表達(dá)強(qiáng)度在茶樹(shù)低溫防御中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物正常生長(zhǎng)狀態(tài)下體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中，而在逆境脅迫下，體內(nèi)自由基(超氧自由基O2._、羥自由基.0Η等)和過(guò)氧化氫(H2O2)等大量積累，破壞了動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，并危及正常生命活動(dòng)。植物為了保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行，常通過(guò)各種抗逆代謝途徑的調(diào)節(jié)來(lái)抵御脅迫。
[0003]過(guò)氧化物酶體(Peroxisome)是一類參與光呼吸調(diào)節(jié)、脂肪酸β氧化、乙醒酸循環(huán)、氮素代謝及植物激素合成等多種重要生化反應(yīng)的細(xì)胞器，普遍存在于真核生物體細(xì)胞內(nèi)。植物體內(nèi)存在大量過(guò)氧化物酶體，其內(nèi)含有氧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶等多種酶類，是植物解除逆境因子和毒害的重要場(chǎng)所。過(guò)氧化物酶體在植物體內(nèi)呈動(dòng)態(tài)分布且對(duì)外界生物及非生物脅迫信號(hào)敏感，其數(shù)量和大小受到不同的環(huán)境、代謝和發(fā)育過(guò)程的影響。過(guò)氧化物酶體生物合成因子(Peroxin, PEX)是一類過(guò)氧化物酶體膜蛋白，對(duì)過(guò)氧化物酶體膜結(jié)構(gòu)組裝、膜蛋白定位、基質(zhì)蛋白輸入和過(guò)氧化物酶體分裂/增殖等均有重要調(diào)節(jié)作用，其中PEXll蛋白家族是調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖及維持穩(wěn)態(tài)的膜延伸因子。
[0004]茶樹(shù)喜溫暖氣候，低溫不僅限制其生長(zhǎng)，如果低溫出現(xiàn)的早春茶芽萌動(dòng)季節(jié)，還會(huì)導(dǎo)致冷害和凍害的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)甚至造成春茶的絕收。因此，茶樹(shù)低溫防御研究具有重要意義。茶樹(shù)低溫防御一方面可以采用建防風(fēng)林、小拱棚和大棚或者煙熏等栽培措施加以控制，另一方面，可通過(guò)耐低溫茶樹(shù)品種篩選等育種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。常規(guī)的耐低溫品種的選育主要通過(guò)雜交、輻射誘變等途徑獲得，但由于耐低溫雜交親本本身較難獲得，而輻射誘變方向存在不確定性，往往使耐低溫品種選育效率偏低。如何通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)手段進(jìn)行耐低溫等高抗性茶樹(shù)種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育是目前乃至今后一段時(shí)間內(nèi)茶學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因及其編碼蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)該基因表達(dá)可提高茶樹(shù)抵御低溫脅迫能力。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種茶樹(shù)葉片過(guò)氧化物酶體生物合成因子基因CsPEXll，為SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0007]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因編碼的蛋白質(zhì)，為SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。
[0008]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因的用途，用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因茶樹(shù)，所述轉(zhuǎn)基因茶樹(shù)的抵御低溫脅迫能力得以增強(qiáng)。所述植物為茶樹(shù)、煙草。
[0009]本發(fā)明所述基因是應(yīng)用消減雜交技術(shù)從茶樹(shù)冷誘導(dǎo)葉片與正常葉片中分離的差異基因片段，然后采用RACE技術(shù)獲得CsPEXl I全長(zhǎng)基因。該基因序列全長(zhǎng)982bp，其開(kāi)放閱讀框ORF長(zhǎng)708bp，位于SEQ ID No:1中5’第61位至768位堿基，編碼一個(gè)由235個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(766位至768位堿基為開(kāi)放閱讀框的最后三個(gè)堿基為終止密碼子，不編碼氨基酸)JnSEQ ID No:2所示。經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比對(duì)證實(shí)，SEQ ID No:1所示的核苷酸序列與與蓖麻(登錄號(hào)為XP_002511795.1)、葡萄(登錄號(hào)為XP_002273596.1)等的過(guò)氧化物酶體生物合成因子PEXll基因序列具有82-85%的同源性。研究表明，PEXll蛋白家族是膜延伸因子，主要控制過(guò)氧化物酶體增殖及穩(wěn)態(tài)維持；而且水稻(Oryza sativa L.)中PEXll蛋白家族成員在過(guò)氧化氫刺激、鹽脅迫和低氮脅迫過(guò)程中有不同的表達(dá)形式。檢索顯示，目前也尚未有葡萄和蓖麻過(guò)氧化物酶體生物合成因子基因功能及其表達(dá)分析等相關(guān)文獻(xiàn)，茶樹(shù)中也沒(méi)有過(guò)氧化物酶體生物合成因子相關(guān)基因等的公開(kāi)資料。
[0010]本發(fā)明還提供了上述CsPEXll基因編碼的蛋白質(zhì)，由235個(gè)氨基酸殘基組成，其具有SEQ ID No:2所示的序列。分析顯示，該蛋白為脂溶性蛋白，脂溶指數(shù)達(dá)104.55，屬于PEXll過(guò)氧化物酶體膜蛋白家族成員之一。該蛋白分子量約為25.93kD，等電點(diǎn)為9.79，其中強(qiáng)堿性氨基酸(Lys，Arg)占14.9%、強(qiáng)酸性氨基酸(Asp，Glu)占8.1%、疏水性氨基酸(Ala, He, Leu, Phe, Trp, Val) 37.9%、極性氛基酸(Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr) 26.5%、其他氨基酸(Met, Gly，Hi s，Pro )12.9%，蛋白結(jié)構(gòu)中含有78.72% α螺旋，0.85% β折疊及20.43%的其他結(jié)構(gòu)。經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比對(duì)證實(shí)，SEQID No:2所示的氨基酸序列與蓖麻和葡萄等具有86-89%的一致性。此外，檢索還顯示，目前尚未見(jiàn)茶樹(shù)中CsPEXll蛋白序列等文獻(xiàn)報(bào)道。
[0011]本發(fā)明提供茶樹(shù)CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度與冷脅迫關(guān)聯(lián)分析。依據(jù)上述獲得的茶樹(shù)CsPEXll基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，序列如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為 296bp ;同時(shí)以茶樹(shù)肌動(dòng)蛋白(Actin,ACT)基因(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923)為參比基因設(shè)計(jì)引物，序列如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為419bp。在茶樹(shù)品種園中采集不同品種茶樹(shù)新梢，實(shí)驗(yàn)組以4°C低溫處理4h，對(duì)照組溫度控制為25°C，其它實(shí)驗(yàn)條件相同。經(jīng)總RNA提取、cDNA第一鏈合成、RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，不同品種茶樹(shù)新梢低溫處理后CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于同品種的對(duì)照新梢(圖1)。說(shuō)明CsPEXll基因表達(dá)上調(diào)是茶樹(shù)對(duì)于低溫脅迫的一種應(yīng)激機(jī)制之一，兩者之間存在密切因果關(guān)聯(lián)關(guān)系。
[0012]本發(fā)明進(jìn)而采用dsRNAi技術(shù)驗(yàn)證了 CsPEXll基因表達(dá)與茶樹(shù)耐低溫脅迫的關(guān)聯(lián)關(guān)系。根據(jù)dsRNAi原理設(shè)計(jì)了用于構(gòu)建雙鏈干涉表達(dá)載體的引物，其中在上游引物的5’端添加了限制性內(nèi)切酶XbaI與AscI的酶切位點(diǎn)(TCTAGA和GGCGCGCC)和兩個(gè)保護(hù)堿基(AA)，在下游引物 的5’端添加了限制性內(nèi)切酶BamHI與SwaI的酶切位點(diǎn)(GGATCC和ATTTAAAT)和兩個(gè)保護(hù)堿基(AA)，具體序列如SEQ ID No: 15和SEQ ID No: 16所示，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為491bp。以茶樹(shù)新梢為材料，經(jīng)RNA提取、cDNA第一鏈合成、RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳，將目標(biāo)產(chǎn)物從凝膠中割出，采用DNA凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶，并插入T載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌擴(kuò)增后，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、割膠純化以及連接反應(yīng)將目的片段正向和反向插入雙鏈干涉載體PFGC5941，構(gòu)建包含茶樹(shù)CsPEXll基因的雙鏈干涉載體pFGC5941-dsCsPEXll。將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增后，采用凍融法將pFGC5941_dsCsPEXll導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌15834。經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化茶樹(shù)無(wú)菌苗莖段，獲得含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶樹(shù)小植株。同時(shí)采用野生發(fā)根農(nóng)桿菌侵染茶樹(shù)無(wú)菌苗莖段獲得了不含雙鏈干涉CsPEXll基因的野生對(duì)照茶樹(shù)小植株。對(duì)上述轉(zhuǎn)基因茶樹(shù)小植株和野生茶樹(shù)小植株進(jìn)行耐低溫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在低溫條件下，含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因小植株內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度以及對(duì)低溫的忍耐力均顯著低于野生小植株。說(shuō)明CsPEXll基因表達(dá)與茶樹(shù)的耐低溫能力關(guān)系十分密切。
[0013]本發(fā)明還提供一種利用該基因提高植物耐低溫脅迫能力的驗(yàn)證及應(yīng)用方法。該方法涉及含有所述基因的重組載體以及由所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植物。增強(qiáng)植物耐低溫脅迫驗(yàn)證采用轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行鑒定，具體做法包括:設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物SEQ IDNo:17 (包含Xba I酶切位點(diǎn)TCTAGA和保護(hù)堿基AA)和SEQ ID No:18 (包含Sac I酶切位點(diǎn)GAGCTC和保護(hù)堿基AA)、RT-PCR擴(kuò)增茶樹(shù)CsPEXll基因并插入T載體、經(jīng)酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建含茶樹(shù)CsPEXll的pBI121-CsPEXll表達(dá)載體、經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因煙草再生苗。對(duì)冷脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草及野生型對(duì)照的生理指標(biāo)測(cè)定及CsPEXll基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)茶樹(shù)CsPEXll基因煙草，葉片中CsPEXll基因強(qiáng)表達(dá)，過(guò)氧化物酶體穩(wěn)定性提高，MDA含量顯著低于野生對(duì)照，對(duì)低溫脅迫的忍耐性也顯著提高。
[0014]由此可見(jiàn)，茶樹(shù)CsPEXll基因表達(dá)與茶樹(shù)耐低溫能力關(guān)系密切，提高CsPEXll基因表達(dá)水平可提高茶樹(shù)對(duì)低溫脅迫的抵御能力。
[0015]本發(fā)明的要點(diǎn)在于提供了 SEQ ID No:1所示的核苷酸序列和SEQ ID No:2所示的開(kāi)放閱讀框氨基酸序列及其在提高植物抗冷脅迫上的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0017]圖1是不同品種茶樹(shù)冷脅迫葉片與常溫對(duì)照葉片中CsPEXll基因表達(dá)圖；
[0018]圖中Actin代表茶樹(shù)肌動(dòng)蛋白參比基因，該基因表達(dá)亮度一致說(shuō)明該cDNA模板濃度一致；CsPEXll代表茶樹(shù)葉片過(guò)氧化物酶體生物合成因子基因；J1表示“鳩坑”茶樹(shù)品種低溫脅迫處理葉片、J2表示“鳩坑”茶樹(shù)品種常溫對(duì)照葉片、LI表示“龍井43”茶樹(shù)品種低溫脅迫處理葉片、L2表示“龍井43”茶樹(shù)品種常溫對(duì)照葉片、SI表示“水古”茶樹(shù)品種低溫脅迫處理葉片、S2表示“水古”茶樹(shù)品種常溫對(duì)照葉片。
[0019]圖2低溫脅迫對(duì)含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)及MDA含量的影響圖；
[0020]圖A為低溫脅迫對(duì)含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)的影響。M表示IOObp Marker，并標(biāo)記出300bp條帶；S1、S2表示含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗(2個(gè)重復(fù))的C sPEXll-PCR凝膠泳道；S3、S4表示野生型對(duì)照茶苗(2個(gè)重復(fù))的CsPEXl 1-PCR凝膠泳道；電泳條帶顯示在約300bp處，與預(yù)計(jì)茶樹(shù)CsPEXl I基因的RT-PCR產(chǎn)物大小(296bp)相符，該圖表示茶苗導(dǎo)入雙鏈干涉CsPEXll基因后內(nèi)源CsPEXll基因表達(dá)減弱。
[0021]圖B為低溫脅迫對(duì)含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗MDA含量的影響。S1、S2表示含雙鏈干涉CsPEXll基因的轉(zhuǎn)基因茶苗(2個(gè)重復(fù))；S3、S4表示野生型對(duì)照茶苗(2個(gè)重復(fù))。該圖表明茶苗導(dǎo)入雙鏈干涉CsPEXll基因后葉片MDA含量較對(duì)照高75%以上。
[0022]圖3是pBI 121-CsPEXl I表達(dá)載體構(gòu)建圖；
[0023]圖中A表示pBI121載體；
[0024]圖中B 表示 Xba I 及 Sac I 酶切 pMD18_T_CsPEXll 后 DNA 片段；
[0025]圖中 C 表示酶切 pBI121 載體及 pMD18_T_CsPEXll 經(jīng) DNA Ligation Kit Ver.2.1連接后獲得的重組pBI 121-CsPEXl I表達(dá)載體。[0026]圖4是轉(zhuǎn)茶樹(shù)CsPEXll基因煙草PCR鑒定圖；
[0027]圖中M表示IOObp Marker,并標(biāo)記出800bp及700bp條帶；B1、B2表示野生對(duì)照煙草植株(2個(gè)重復(fù))的CsPEXll-PCR凝膠泳道，該泳道無(wú)條帶表明野生對(duì)照植株基因組中未轉(zhuǎn)入重組茶樹(shù)CsPEXll基因；A1、A2表示轉(zhuǎn)茶樹(shù)CsPEXll基因煙草(2個(gè)重復(fù))的CsPEXll-PCR凝膠泳道，電泳條帶顯示在700-800bp間，與預(yù)計(jì)茶樹(shù)CsPEXll基因的產(chǎn)物大小(744bp)相符，表示該植株成功轉(zhuǎn)化茶樹(shù)CsPEXll重組基因，即為轉(zhuǎn)茶樹(shù)CsPEXll基因煙草。
[0028]圖5是轉(zhuǎn)茶樹(shù)CsPEXll基因煙草與野生型煙草冷脅迫生理指標(biāo)及CsPEXll基因表達(dá)對(duì)比圖；
[0029]圖中A表示冷脅迫轉(zhuǎn)基因煙草及野生煙草葉片中CsPEXll基因表達(dá):凝膠檢測(cè)顯示各樣品ISsRNA亮度一致，說(shuō)明各樣品RNA模板濃度一致；在該條件下低溫脅迫處理后轉(zhuǎn)茶樹(shù)CsPEXll基因煙草中CsPEXll基因高表達(dá)，而野生煙草因未轉(zhuǎn)入茶樹(shù)CsPEXll，所以沒(méi)有該基因表達(dá)；
[0030]圖中B表示冷脅迫轉(zhuǎn)基因煙草及野生煙草葉片中丙二醛(MDA)含量測(cè)定；
[0031]圖中C顯示轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理后葉片損傷程度；
[0032]從圖中可知，在低溫脅迫下轉(zhuǎn)茶樹(shù)CsPEXll基因的煙草相應(yīng)基因表達(dá)強(qiáng)度明顯上調(diào)，促進(jìn)了過(guò)氧化物酶體生物合成因子合成，提高了過(guò)氧化物酶體的穩(wěn)定性及其對(duì)自由基的代謝能力，從而使MDA含量顯著低于野生對(duì)照，最終使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較野生對(duì)照更高的耐低溫能力。
[0033]圖6是轉(zhuǎn)茶樹(shù)、蓖麻和葡萄過(guò)氧化物酶體生物合成因子基因煙草葉片丙二醛(MDA)含量對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，以便于更好地理解，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0035]實(shí)施例1:茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子基因CsPEXll的分離與克隆
[0036]I)利用抑制性消減雜交(SSH)分離茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因
[0037]選取生長(zhǎng)勢(shì)一致的福鼎大白茶樹(shù)品種2年生盆栽茶苗，實(shí)驗(yàn)前先將盆栽茶苗轉(zhuǎn)移至25°C左右的培養(yǎng)室中，光照強(qiáng)度50ymol/(m2.s)&12h/d，相對(duì)濕度80%，預(yù)培養(yǎng)7天。試驗(yàn)用茶苗(3盆)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進(jìn)行4°C處理，光照強(qiáng)度50ymOl/(m2.s)&12h/d，相對(duì)濕度80%，對(duì)照組仍保持在25°C左右環(huán)境中，其他條件與處理組相同，培養(yǎng)5天后采摘處理組和對(duì)照嫩葉進(jìn)行凍存(即，于_80°C凍存3天)。凍存樣品經(jīng)液氮充分研磨后，以TRIzoI法(Invitrogen Life Technologies)分別提取處理組與對(duì)照組茶樹(shù)葉片總RNA,并以01igotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(寶生物[大連]有限公司)分別純化兩組mRNAo利用 PCR-Slelect? cDNA Subtraction KitCClontech Laboratories,Lnc., MountainView, USA)進(jìn)行抑制性消減雜交:分別取處理組和對(duì)照組各2 μ g純化mRNA，以SMARTScribe逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一鏈合成,進(jìn)而以20 X Second-Strand酶混合物合成cDNA第二鏈，獲得雙鏈cDNA (ds cDNA)。各組ds cDNA經(jīng)Rsal消化后分成兩管，分別與接頭Adaptorl(SEQ ID No:3所示)和Adaptor2R (SEQ ID No:4所示)連接成為tester cDNA，未連接接頭的為driver cDNA。兩次雜交中第一次為過(guò)量driver cDNA分別加入兩份tester cDNA中變性后退火雜交，使原來(lái)有豐度差別的tester單鏈cDNA均等化，合并兩份雜交產(chǎn)物，另加上新的變性driver cDNA再次進(jìn)行雜交退火，進(jìn)一步富集差異表達(dá)的雜交體分子，并用DNA酶補(bǔ)平末端。進(jìn)而進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，第一次PCR使兩端連接有不同接頭的雙鏈cDNA片段得以指數(shù)擴(kuò)增，第二次PCR利用巢式引物富集差異表達(dá)的基因片段，具體操作參見(jiàn)試劑盒(即PCR-Slelect? cDNA Subtraction Kit試劑盒)使用說(shuō)明。將差異基因片段PCR產(chǎn)物插入PMD18-T載體(寶生物[大連]有限公司)，并以M13引物組合(分別如SEQ ID No:9和SEQ ID No: 10所示)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆委托Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。
[0038]序列分析:測(cè)得序列利用Vecscreen (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)除去載體與接頭序列得到 EST 片段,經(jīng) Blast(http://blast,ncb1.nlm.nih.gov/)序列同源性比對(duì)，獲得一個(gè)與蓖麻(登錄號(hào)為XP_002511795.1)、葡萄(登錄號(hào)為XP_002273596.1)等的過(guò)氧化物酶體生物合成因子PEXll基因同源性較高的茶樹(shù)新EST序列。
[0039] 2)茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXll基因克隆
[0040]依據(jù)上述獲得的EST序列，比對(duì)發(fā)現(xiàn)3’端序列已完整,采用Primer Premier5軟件(Premier Inc.)設(shè)計(jì)特異引物(SEQ ID No:5和SEQ ID No:7所示)進(jìn)行基因5’末端克隆進(jìn)而獲得基因序列全長(zhǎng)。
[0041]取福鼎大白茶茶樹(shù)品種自然常規(guī)新梢(I芽2葉)，液氮研磨后以 TRIzol 法(Invitrogen Life Technologies)提取茶樹(shù)葉片總 RNA,并以01igotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit (寶生物[大連]有限公司)純化 mRNA,取I μ g純化mRNA，以TaKaRa5’ -Full RACE Kit試劑盒(寶生物[大連]有限公司)進(jìn)行5’端基因序列克隆,mRNA的5’端經(jīng)Alkaline Phosphatase (CIAP,堿性磷酸酶)的去磷酸化作用和Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)的“去帽子”反應(yīng)后，與試劑盒中提供的5’RACE接頭連接成為L(zhǎng)igated RNA。Ligated RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV合成第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板，以特異性引物(SEQ ID No: 5所示)和5’Outer Primer (SEQ ID No:6所示，試劑盒提供)進(jìn)行Outer-PCR反應(yīng)，取I μ I Outer-PCR產(chǎn)物，以特異性引物(SEQ IDΝο:7所示)和5’ Inner Primer (SEQ ID No:8所示,試劑盒提供)進(jìn)行Inner-PCR反應(yīng),預(yù)計(jì)5’END產(chǎn)物長(zhǎng)度為650bp-750bp之間，具體操作參見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明。將上述RACE產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，并割取目標(biāo)條帶，以TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0 (寶生物[大連]有限公司)進(jìn)行條帶回收,插入pMD18_T載體(寶生物[大連]有限公司)，并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌(全式金[北京]有限公司)，具體操作參見(jiàn)純化試劑盒、載體及工程菌使用說(shuō)明。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及通用引物M13 (如SEQ ID No:9和SEQID No: 10所示)PCR檢測(cè)后，陽(yáng)性克隆委托Invitrogen公司進(jìn)行序列分析。
[0042]將成功測(cè)序獲得的片段序列由SeqMan軟件(DNAStar公司)根據(jù)重疊區(qū)域進(jìn)行片段拼接，獲得CsPEXlI全長(zhǎng)序列，該基因長(zhǎng)度為982bp，具體如SEQ ID No:1所示。經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比對(duì)證實(shí),該序列與蓖麻、番爺和葡萄等具有85%以上的同源性。該序列開(kāi)放閱讀框ORF長(zhǎng)708bp，位于SEQ ID No:1中5’端第61位至768位堿基(如SEQ ID No:1劃線部分所示)，經(jīng)SeqBuilder軟件推演得到了包含235個(gè)氨基酸的蛋白序列，具體如SEQ ID No:2所示，氨基酸序列與蓖麻、番茄和葡萄等具有85%以上的同源性。證明所獲得的是編碼茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子基因CsPEXII的全長(zhǎng)基因序列。已有研究表明，PEXll蛋白是調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體伸長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵因子，對(duì)過(guò)氧化物酶體穩(wěn)定性有重要貢獻(xiàn)；在水稻(Oryza sativa L.)中PEXll蛋白成員在過(guò)氧化氫刺激、鹽脅迫和低氮脅迫中有不同的表達(dá)形式。但目前沒(méi)有針對(duì)蓖麻、葡萄和番茄等過(guò)氧化物酶體生物合成因子基因的功能分析。數(shù)據(jù)庫(kù)查找顯示，茶樹(shù)中未有發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體生物合成因子相關(guān)基因，證明本發(fā)明序列是一種新的茶樹(shù)基因序列。同時(shí)，在其它植物中，尚未有關(guān)于該基因表達(dá)與抗低溫脅迫相關(guān)的報(bào)道。
[0043]實(shí)施例2:茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因相對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度與低溫脅迫關(guān)聯(lián)分析
[0044]1)不同茶樹(shù)品種冷脅迫葉片與對(duì)照葉片中CsPEXII基因表達(dá)
[0045]依據(jù)上述獲得的茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因序列，采用PrimerPremier5 軟件(Premier Inc.)設(shè)計(jì)表達(dá)引物(序列如 SEQ ID No:ll 和 SEQ ID No: 12 PJf示)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為296bp。同時(shí)以茶樹(shù)肌動(dòng)蛋白(Actin)基因(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923)為參比基因設(shè)計(jì)引物(序列如 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No:14)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為419bp。
[0046]選取3個(gè)不同茶樹(shù)品種(鳩坑、龍井43和水古)2年生盆栽茶苗，每個(gè)品種選取生長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)?盆用于試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前先將盆栽茶苗轉(zhuǎn)移至25°C左右的培養(yǎng)室中，光照強(qiáng)度50 u mol/(m2 ? s) &12h/d，相對(duì)濕度80%，預(yù)培養(yǎng)7天。實(shí)驗(yàn)組茶苗轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進(jìn)行4°C處理，光照強(qiáng)度50 u mol/(m2 ? s) &12h/d，相對(duì)濕度80%，對(duì)照組仍保持在25°C左右環(huán)境中，其他條件與處理組相同，培養(yǎng)I天后采摘嫩度一致的葉片進(jìn)行凍存(即，于_80°C凍存3天)。取各樣品葉片IOOmg,經(jīng)液氮研磨后，以TRIzol法(Invitrogen Life Technologies)提取各組茶樹(shù)葉片總 RNA,以 Takara PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (寶生物[大連]有限公司)合成cDNA第一鏈，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書。以第一鏈cDNA為模板，以CsPEXII特異性引物SEQ ID No: 11和SEQ ID No: 12進(jìn)行RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證。RT-PCR采用全式金2XEasy Taq? PCR SuperMix(全式金[北京]有限公司)進(jìn)行，以肌動(dòng)蛋白Actin作為參比基因。
[0047]15 ill 反應(yīng)體系為:ddH204.1 ;2XEasy Taq? PCR SuperMix7.5 U I ；Primer (SEQ ID No:11 和 SEQ ID No:12 或者 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No: 14; IOmMeach) 0.6 u I ；cDNA (濃度為 lOOng/u I) 2u 10 PCR 擴(kuò)增條件為:94°C 預(yù)變性 3min ;94°C 變性45s,50°C (CsPEXlI特異性表達(dá)引物)或60°C (Actin參比基因引物)退火30s、72°C延伸30s、30個(gè)循環(huán)；72°C后延伸lOmin。產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。[0048]基因表達(dá)結(jié)果顯示，不同品種低溫脅迫處理后，CsPEXll基因表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于同品種的正常溫度對(duì)照葉片。說(shuō)明CsPEXll基因表達(dá)上調(diào)是茶樹(shù)對(duì)于冷脅迫的一種普遍應(yīng)激響應(yīng)之一，兩者之間存在密切因果關(guān)聯(lián)關(guān)系。
[0049]2)茶樹(shù)CsPEXll基因表達(dá)與耐低溫能力的關(guān)聯(lián)關(guān)系驗(yàn)證
[0050]根據(jù)dsRNAi原理設(shè)計(jì)了用于構(gòu)建雙鏈干涉表達(dá)載體的引物，其中在上游引物的5’端添加了限制性內(nèi)切酶XbaI與AscI的酶切位點(diǎn)(TCTAGA和GGCGCGCC)和兩個(gè)保護(hù)堿基(AA)，在下游引物的5’端添加了限制性內(nèi)切酶BamHI與SwaI的酶切位點(diǎn)(GGATCC和ATTTAAAT)和兩個(gè)保護(hù)堿基(AA)，具體上下游引物序列如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示，設(shè)計(jì)產(chǎn)物大小為491bp。以福鼎大白茶茶樹(shù)新梢為材料，以TRIzoI法提取茶樹(shù)葉片總RNA，以SEQ ID No:15和SEQ ID No:16為引物，采用本實(shí)施例步驟I)中的相同方法進(jìn)行cDNA第一鏈合成、RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳。將目標(biāo)產(chǎn)物從凝膠中割出，采用實(shí)施例1步驟(2)中相同的方法進(jìn)行目標(biāo)條帶回收，并插入pMDlS-T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌擴(kuò)增，獲得含茶樹(shù)CsPEXll基因片段的T載體pMD18-T-pCsPEXll。
[0051]以UNIQ-1O柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(生工生物工程[上海]股份有限公司)，提取雙鏈干涉載體質(zhì)粒 pFGC5941 (Arabidopsis Biological Resource Center)和含茶樹(shù) CsPEXll 基因片段的 T 載體 pMD18-T-pCsPEXll,分別以 AscI 和 SwaI (New EnglandBioLabs)進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以凝膠DNA純化試劑盒純化回收PFGC5941大片段和pCsPEXll目的片段，T4-DNA連接酶16 °C連接過(guò)夜，構(gòu)建含正向CsPEXl I插入序列的重組質(zhì)粒pFGC5941-CsPEXl I，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性重組克隆于液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，以UNIQ-1O柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒pFGC5941-CsPEXll，同時(shí)提取含茶樹(shù)CsPEXll基因片段的T載體 pMD18-T-pCsPEXll ;分別以 BamHI 和 XbaI(New England BioLabs)進(jìn)行雙酶切，回收陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFGC5941-CsPEXll的大片段和pCsPEXll目的片段，T4-DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，將茶樹(shù)CsPEXll反 向插入pFGC5941-CsPEXll，構(gòu)建具有雙鏈干涉效果的重組質(zhì)粒pFGC5941-dsCsPEXll，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性重組克隆于液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)繁。以UNIQ-1O柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒pFGC5941-dsCsPEXl I，采用凍融法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)發(fā)根農(nóng)桿菌15834。將含重組質(zhì)粒pFGC5941-dsCsPEXll的農(nóng)桿菌15834接種于20ml含100mmol/L乙酰丁香酮的液體YMB培養(yǎng)基中，28、0C 250r/min震蕩培養(yǎng)至0D600為0.5~0.8 ;將苗齡70天的浙農(nóng)129茶樹(shù)無(wú)菌苗莖段置于培養(yǎng)后的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，侵染IOmin后，無(wú)菌濾紙吸干多余的菌液，轉(zhuǎn)移于含100mmol/L乙酰丁香酮的固體YMB培養(yǎng)基，黑暗共培養(yǎng)2d后，以1000mg/L頭孢噻肟鈉(齊魯制藥有限公司)浸泡20min滅活農(nóng)桿菌，并轉(zhuǎn)移至含500mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基上，25，1:黑暗培養(yǎng)20d，獲得轉(zhuǎn)雙鏈干涉CsPEXll基因的茶樹(shù)小植株，并轉(zhuǎn)移至12h光照(50 u mol/(m2 ? s) ) /12h黑暗條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為25°C)。同時(shí)采用相似方法，以野生農(nóng)桿菌15834侵染浙農(nóng)129茶樹(shù)無(wú)菌苗莖段，獲得不含雙鏈干涉CsPEXll基因?qū)φ招≈仓?。將上述兩類生長(zhǎng)勢(shì)一致的小植株轉(zhuǎn)移至2°C條件下培養(yǎng)Id后，進(jìn)行葉片CsPEXll表達(dá)情況和丙二醛(MDA)含量分析，同時(shí)進(jìn)行葉片損傷評(píng)價(jià)。
[0052]丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定:稱取各處理(2°C條件下培養(yǎng)Id后的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株)葉片0.1gJp 10%三氯乙酸0.2ml，于微量勻漿器中勻漿，并加入0.8mll0%三氯乙酸充分勻衆(zhòng),勻衆(zhòng)液以4000r/min離心IOmin,取0.2ml上清液,加A 0.2ml0.6%硫代巴比妥酸液,搖勻后沸水浴15min,冷卻后4000r/min離心IOmin,取上清作為處理分析液。同時(shí)采用相同方法以0.2ml蒸餾水代替勻漿液制備對(duì)照分析液。以對(duì)照分析液進(jìn)行調(diào)零，分別在532、600和450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并按照下式進(jìn)行MDA含量計(jì)算。
[0053]
【權(quán)利要求】
1.茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因，其特征是:為SEQID No:1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征是:為SEQ ID No: 2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因的用途，其特征是:用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抵御低溫脅迫能力得以增強(qiáng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的茶樹(shù)過(guò)氧化物酶體生物合成因子CsPEXII基因的用途，其特征是:所述植物為茶樹(shù)、煙草。`
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103525826SQ201310428023
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】陸建良, 劉陽(yáng), 范方媛, 劉暢, 甘泉, 鄭新強(qiáng), 梁月榮 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)