一種楊梅快速繁殖的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種楊梅快速繁殖的方法，包括以下步驟：1)外植體的選??；2）外植體消毒；3)初始誘導(dǎo)培養(yǎng)；4)愈傷組織誘導(dǎo)；5）分化和增殖培養(yǎng)；6)生根培養(yǎng)。按上述方法繁殖楊梅既有效解決楊梅組織培養(yǎng)中外植體污染率高的問(wèn)題，又可實(shí)現(xiàn)楊梅組培苗的大量快速繁殖。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種楊梅快速繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物快速繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是楊梅快速繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，楊梅多采用嫁接繁育來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)栽培，這繁育技術(shù)提高品種的純度，保持了品種特性，但成活率較低及繁殖速度較慢，制約了楊梅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而組織培養(yǎng)育苗技術(shù)既可以保持種的純度和特性， 也可以降低生產(chǎn)成本，提高繁殖速度和成活率。楊梅的組織培養(yǎng)目前很少有人報(bào)道，究其原因主要還是由于楊梅外植體培養(yǎng)時(shí)，滅菌不易，愈傷組織誘導(dǎo)容易褐化，特別是葉片、莖等部位均含有多種次生代謝產(chǎn)物，抑制其分化及愈傷組織誘導(dǎo)，因此，組織培養(yǎng)很難取得成功。
[0003]中國(guó)專(zhuān)利ZL201010603448.4涉及到一種以芽苗途徑獲得楊梅再生植株的方法:以楊梅莖為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽，在此基礎(chǔ)上伸長(zhǎng)后誘導(dǎo)生根，但這一方法誘導(dǎo)周期長(zhǎng)，繁
殖量小。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)經(jīng)愈傷組織途徑獲得楊梅再生植株的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種楊梅快速繁殖的方法，經(jīng)愈傷組織途徑獲得楊梅叢生芽，誘導(dǎo)生根，既有效解決楊梅組織培養(yǎng)中外植體污染率高的問(wèn)題，又可實(shí)現(xiàn)楊梅組培苗的大量快速繁殖。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出下列技術(shù)方案:
[0007]一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟:
[0008]1)外植體的選取:取當(dāng)年生直徑2_5mm的楊梅枝條為外植體，剪去葉片后剪成2-3cm的莖段；
[0009]2)外植體消毒:將上述莖段放入盛有自來(lái)水的20-25KHZ超聲波清洗中保持溫度30-35°C處理30-45min，然后以自來(lái)水沖洗10_20min ;隨后在超凈工作臺(tái)上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.1%升汞溶液中處理5-7分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗4_5遍，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿備用；
[0010]3)初始誘導(dǎo)培養(yǎng):將滅菌后外植體莖段各剪去2-3mm，莖段按末端向下插入初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2500-3500LX、光周期10-14h/d，溫度25°C ±2°C ;培養(yǎng)4-6d后將其中未污染的外植體莖段轉(zhuǎn)接到新的初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并繼續(xù)培養(yǎng)12-18d至新芽長(zhǎng)出；所述的初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0011]4)愈傷組織誘導(dǎo):取初始誘導(dǎo)培養(yǎng)中的芽，放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20d,條件為暗培養(yǎng)，溫度20°C ±2°C ;所述愈傷組織培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0012]5)分化和增殖培養(yǎng):將透明無(wú)色的愈傷組織塊放入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-25d，增殖產(chǎn)生大量叢生苗，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述分化和增殖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0013]6)生根培養(yǎng):將5)步驟中的叢生苗切割成單個(gè)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20d后生根，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述生根用培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；
[0014]7)煉苗和移栽:將有生根的楊梅幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開(kāi)，室溫下煉苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽裝有河沙基質(zhì)的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當(dāng)遮蔭即可；
[0015]所述的WPM培養(yǎng)基配方為:大量元素:硝酸銨NH4N03400mg/L，硫酸鉀K2S04900mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H2096mg/L ；四水合硝酸鈣Ca(N03)2.4H20556mg/L ;微量元素:硼酸H3B036.2mg/L,硫酸錳MnS04.4Η2022.5mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅CuS04.5H200.25mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.3mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.8mg/L ;有機(jī)酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,鹽酸硫胺素lmg/L,鹽酸吡口多醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ；
[0016]所述的MS培養(yǎng)基配方為:大量元素:硝酸鉀KN031900mg/L，硝酸銨NH4N031650mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04 *7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2 *2H20440mg/L ;微量元素:碘化鉀 KI0.83mg/L,硼酸 H3B036.2mg/L,硫酸錳 MnS04.4H2022.3mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅 CuS04.5Η200.025mg/L,氯化鈷CoCl2.6H200.025mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.25mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.85mg/L ;有機(jī)酸:肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，鹽酸吡哆醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ;蔗糖 30g/L,瓊脂粉 7g/L，pH 為 5.7 ;
[0017]所述的1/2MS培養(yǎng)基配方為:大量元素:硝酸鉀KN039 50mg/L，硝酸銨NH4N038 2 5mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P0385mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20185mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H20220mg/L ；
[0018]所述的6-BA為6-芐氨基嘌呤；
[0019]所述的NAA為α -萘乙酸；
[0020]所述的ΙΒΑ為吲哚-3- 丁酸；
[0021]所述的PVP為聚乙烯吡咯烷酮。
[0022]步驟3)中初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP8mg/L。
[0023]步驟4)中愈傷組織培養(yǎng)基為:MS+6-BAl.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
[0024]步驟5)中分化和增殖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L0
[0025]步驟6)中生根用培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L。
[0026]采用本發(fā)明繁殖楊梅，既有效解決楊梅組織培養(yǎng)中外植體污染率高的問(wèn)題，又可實(shí)現(xiàn)楊梅組培苗的大量快速繁殖，為楊梅生產(chǎn)栽培和品種改良奠定基礎(chǔ)。
[0027]試驗(yàn)表明，采用愈傷組織途徑所得楊梅試管苗的移栽成活率明顯高于采用芽苗途徑者，其效果可以通過(guò)下列試驗(yàn)證明。
[0028]試驗(yàn)1不同途徑所得試管苗的移栽成活率比較[0029]一、材料和方法
[0030]1、材料:
[0031 ] 愈傷組織苗(簡(jiǎn)稱(chēng)SM)，按實(shí)施例3制備；
[0032]芽苗(簡(jiǎn)稱(chēng)YM)，按下列方法制備:
[0033]1)外植體的選取:取當(dāng)年生直徑2_5mm的楊梅枝條為外植體，剪去葉片后剪成2-3cm的莖段；
[0034]2)外植體消毒:將上述莖段放入盛有自來(lái)水的20KHZ超聲波清洗中保持溫度30-35°C處理30-45min，然后以自來(lái)水沖洗10_20min ;隨后在超凈工作臺(tái)上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.1%升汞溶液中處理5-7分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗4-5遍，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿備用；
[0035]3)初始誘導(dǎo)培養(yǎng):將滅菌后外植體莖段各剪去2_3mm，莖段按末端向下插入初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2500-3500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;培養(yǎng)4-6d后將其中未污染的外植體莖段轉(zhuǎn)接到新的初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并繼續(xù)培養(yǎng)12-18d至新芽長(zhǎng)出；所述的初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:WPM+6-BA0.lmg/L+NAA0.01mg/L+PVP5mg/L ；
[0036]4)新芽伸長(zhǎng)培養(yǎng):將長(zhǎng)出新芽的外植體莖段剪去發(fā)黑端部后轉(zhuǎn)插入新芽伸長(zhǎng)和增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2500-3000LX、光周期12h/d，溫度25°C ±2°C ;培養(yǎng)21d后，新芽伸長(zhǎng)到≥0.5cm。新芽伸長(zhǎng)和增殖培養(yǎng)基組成為:WPM+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+GA30.4mg/L+PVP800mg/Lo
[0037]5)增殖培養(yǎng):將步驟4)新芽剪下并轉(zhuǎn)接到新芽伸長(zhǎng)和增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2500-3000LX、光周期12h/d，溫度25°C ±2°C ;培養(yǎng)30d后，至新芽長(zhǎng)出并伸長(zhǎng)到1cm以上。培養(yǎng)基組成同步驟4)。
[0038]6)生根培養(yǎng):將步驟5)的新芽剪下，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2500-3000LX、光周期12h/d，溫度25°C ±2°C ;培養(yǎng)20d后，生出新根。生根培養(yǎng)基的配方為 1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5_10mg/L。
[0039]2、方法
[0040]將有生根的楊梅幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開(kāi)，室溫下煉苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽裝有河沙基質(zhì)的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當(dāng)遮蔭即可，2周后考察試管苗在苗床上的成活率。
[0041]愈傷組織苗(SM)、芽苗(YM)平行試驗(yàn)；
[0042]共試驗(yàn)三次。
[0043]3、結(jié)果
[0044]試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明，SM的存活率明顯高于YM。表明采用愈傷組織培養(yǎng)而得的試管苗比采用新芽培·養(yǎng)而得的試管苗更易被馴化。現(xiàn)有技術(shù)中，并沒(méi)有類(lèi)似的啟示，本發(fā)明取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。
[0045]表1不同途徑所得試管苗的移栽成活率比較
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟:1)外植體的選取:取當(dāng)年生直徑2-5mm的楊梅枝條為外植體，剪去葉片后剪成2_3cm的莖段；2)外植體消毒:將上述莖段放入盛有自來(lái)水的20-25KHZ超聲波清洗中保持溫度30-35°C處理30-45min，然后以自來(lái)水沖洗10_20min ;隨后在超凈工作臺(tái)上以70-75%的酒精消毒25-35秒，0.1 %升汞溶液中處理5-7分鐘，然后以無(wú)菌水沖洗4_5遍，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿備用；3)初始誘導(dǎo)培養(yǎng):將滅菌后外植體莖段各剪去2-3mm，莖段按末端向下插入初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2500-3500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;培養(yǎng)4-6d后將其中未污染的外植體莖段轉(zhuǎn)接到新的初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并繼續(xù)培養(yǎng)12-18d至新芽長(zhǎng)出；所述的初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:WPM+6-BA0.1-0.2mg/L+NAA0.01-0.02mg/L+PVP5-10mg/L ；4)愈傷組織誘導(dǎo):取初始誘導(dǎo)培養(yǎng)中的芽，放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20d，條件為暗培養(yǎng)，溫度20°C ±2°C ;所述愈傷組織培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；5)分化和增殖培養(yǎng):將透明無(wú)色的愈傷組織塊放入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-25d，增殖產(chǎn)生大量叢生苗，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述分化和增殖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為:WPM+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；6)生根培養(yǎng):將5)步驟中的叢生苗切割成單個(gè)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20d后生根，培養(yǎng)條件為光強(qiáng) 1800-2500LX、光周期10_14h/d，溫度25°C ±2°C ;所述生根用培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA0.1-0.5mg/L+PVP5-10mg/L ；7)煉苗和移栽:將有生根的楊梅幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開(kāi)，室溫下煉苗3-5d后，取出幼苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽裝有河沙基質(zhì)的苗床上，保持溫度20-25°C，濕度85%-95%，適當(dāng)遮蔭即可；所述的WPM培養(yǎng)基配方為:大量元素:硝酸銨NH4N03400mg/L，硫酸鉀K2S04900mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H2096mg/L ；四水合硝酸鈣Ca(N03)2.4H20556mg/L ;微量元素:硼酸H3B036.2mg/L,硫酸錳MnS04.4Η2022.5mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅CuS04.5H200.25mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.3mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.8mg/L ;有機(jī)酸:肌醇100mg/L,甘氨酸2mg/L,鹽酸硫胺素lmg/L,鹽酸吡口多醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ；所述的MS培養(yǎng)基配方為:大量元素:硝酸鉀KN031900mg/L，硝酸銨NH4N031650mg/L，磷酸二氫鉀 KH2P03170mg/L，硫酸鎂 MgS04.7H20370mg/L ;鈣鹽:氯化鈣 CaCl2.2H20440mg/L ;微量元素:碘化鉀 KI0.83mg/L,硼酸 H3B036.2mg/L,硫酸錳 MnS04.4H2022.3mg/L,硫酸鋅 ZnS04.7Η208.6mg/L,鑰酸鈉 Na2Mo04.2Η200.25mg/L,硫酸銅 CuS04.5Η200.025mg/L,氯化鈷CoCl2.6H200.025mg/L ;鐵鹽:乙二胺四乙酸二鈉Na2_EDTA37.25mg/L,硫酸亞鐵FeS04.7H2027.85mg/L ;有機(jī)酸:肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，鹽酸吡哆醇 0.5mg/L,煙酸 0.5mg/L ;蔗糖 30g/L,瓊脂粉 7g/L，pH 為 5.7 ;所述的1/2MS培養(yǎng)基配方為:大量元素:硝酸鉀KN039 50mg/L，硝酸銨NH4N038 2 5mg/L，磷酸二氫鉀KH2P0385mg/L，硫酸鎂MgS04.7H20185mg/L ;余同上述MS培養(yǎng)基；所述的6-BA為6-芐氨基嘌呤；所述的NAA為α -萘乙酸；所述的ΙΒΑ為吲哚-3-丁酸；所述的PVP為聚乙烯吡咯烷酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟3)中初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為:WPM+6-BA0.15mg/L+NAA0.015mg/L+PVP8mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟4)中愈傷組織培養(yǎng)基為:M S+6-BAl.5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟5)中分化和增殖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為:WPM+6-BA0.3mg/L+NAA0.2mg/L+PVP8mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種楊梅快速繁殖的方法，其特征在于所述步驟6)中生根用培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA0.2mg/L+PVP8mg/L0
【文檔編號(hào)】A01G17/00GK103651144SQ201310711176
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】姜波, 沈宗根, 呂洪飛, 郁達(dá) 申請(qǐng)人:常熟理工學(xué)院