一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）SZ-60，其特征在于，其保藏號(hào)為CGMCC?No.8277。所述菌株在牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落不規(guī)則、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤(rùn)、半透明；鏡檢呈桿狀，大小為0.3～0.4×3.2～3.3μm，具鞭毛，G﹣，有芽孢在含有2%～5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)；所述的牛肉膏蛋白胨（NB）培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂17g，水1000ml，pH?6.8～7.2。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）SZ-60對(duì)引起人參根腐病、疫病、菌核病、銹腐病、黑斑病和立枯病的主要病原菌具有顯著拮抗作用。本發(fā)明還提供解淀粉芽孢桿菌SZ-60在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應(yīng)用。
【專利說明】一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人參(Panax ginseng C.A.Mey)為五加科人參屬多年生宿根陰性雙子葉藥用植物，是我國(guó)的名貴藥材，有“百草之王”的美譽(yù)。人參在中國(guó)、韓國(guó)、朝鮮、俄羅斯等國(guó)家有大面積種植，其中，中國(guó)東北是人參的主產(chǎn)區(qū)，已成為當(dāng)?shù)氐闹匾еa(chǎn)業(yè)之一。人參的長(zhǎng)期人工種植和品種選育難度大導(dǎo)致人參種質(zhì)退化、病害嚴(yán)重、質(zhì)量差、產(chǎn)量低?；瘜W(xué)農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，降低了人參藥材的安全性和商品價(jià)值。病害防控問題已成為制約人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問題之一。
[0003]人參病害約有20~40種，其中，以下6類病原菌是導(dǎo)致人參常見病害并限制人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病原菌:由腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)導(dǎo)致的人參根腐病一般發(fā)病率在30%左右，六年生人參根腐病造成的死亡率可達(dá)50%~80%，主要危害幼苗根部和根莖部(地表以下莖部)，腐爛的參根呈黑褐色濕腐狀，后期糟朽狀，僅存中空的根皮；惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)導(dǎo)致的人參疫病發(fā)病率可達(dá)70%,其癥狀為發(fā)病輕時(shí)葉片上產(chǎn)生不規(guī)則的暗綠色斑，重者莖葉枯萎，根部腐爛，植株成片枯死，減產(chǎn)嚴(yán)重；人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)導(dǎo)致的人參菌核病主要危害3年生以上參根，發(fā)病部位為芽苞、根和根莖，參根被害后，初期在表面生少許白色絨狀菌絲體，以后，內(nèi)部迅速腐敗、軟化，細(xì)胞全部被消解殆盡，只留下壞死的外表皮，表皮內(nèi)外形成許多鼠糞狀的菌核；人參鏈格孢菌(Alternaria panax)導(dǎo)致的人參黑斑病一般發(fā)病率20%_30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)到100%，造成早期落葉，植株枯萎，不結(jié)實(shí)，參根和參籽減產(chǎn)；立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)導(dǎo)致的人參立枯病是人參苗期主要病害之一，在低溫濕度大的條件下，發(fā)展蔓延極為迅速，一般發(fā)病率為8~30%，嚴(yán)重者可達(dá)40%左右，病菌使幼苗在地面3~5厘米干濕土交界面的莖部縊縮、腐爛，切斷輸導(dǎo)組織，致使幼苗倒伏；毀滅柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)導(dǎo)致的人參銹腐病嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率達(dá)70%以上，該病發(fā)生于根的各部位，病斑呈鐵銹色，由點(diǎn)至面擴(kuò)散至全根，土壤濕度大、透氣不好、腐殖質(zhì)層厚，發(fā)病重。
[0004]長(zhǎng)期以來(lái)通過使用化學(xué)農(nóng)藥等化學(xué)防治措施來(lái)防治人參病害遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到人們預(yù)想的效果，而且過量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)破壞土壤的微生態(tài)環(huán)境，加重環(huán)境污染，也使有毒物質(zhì)在參根內(nèi)大量積累，降低人參的使用安全性和商品價(jià)值，因此，人們把防治重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向生物防治措施和農(nóng)業(yè)防治措施上。在農(nóng)作物植物保護(hù)領(lǐng)域，利用作物根際土壤篩選對(duì)病原菌具有顯著拮抗效果的土壤微生物，并制成微生物制劑是生物防控研究的重要手段，也是有益微生物資源開發(fā)的重要途徑。
[0005]生物防治是以生態(tài)學(xué)原理為基礎(chǔ)，利用生物物種間的相互作用，以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物。生物防治最大的優(yōu)點(diǎn)是不污染環(huán)境，沒有農(nóng)藥殘留，這是農(nóng)藥等非生物方法防治病蟲害所無(wú)法比的。利用拮抗微生物防治病原微生物是生物防治技術(shù)的重要組成部分，它避免了化學(xué)農(nóng)藥使用帶來(lái)的一系列植保、環(huán)境和能源方面的問題，避免了農(nóng)藥殘留對(duì)人畜的危害，更重要的是促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。美國(guó)已有GB03、MBI600、QsT713和解淀粉枯草芽孢桿菌變種等4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。在德國(guó)解淀粉枯草芽孢桿菌變種FZB24被商業(yè)化生產(chǎn)，用于控制糧食作物的不同真菌病害。
[0006]芽孢桿菌(Bacillus)是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其種類多分布廣，是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)種群。該類微生物通過分泌抗生物質(zhì)和生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)，在防治植物病害方面發(fā)揮多種有益作用。目前利用解淀粉芽孢桿菌防治人參真菌性病害未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于:針對(duì)人參生產(chǎn)中的主要真菌性病害，尤其是人參土傳病害發(fā)生面積日益擴(kuò)大，化學(xué)藥劑防治除易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留外，防效也不理想的實(shí)際情況，提出一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株SZ-60及其在分別引起人參根腐病、銹腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、毀滅柱孢菌(C.destructans)、人參鏈格抱菌(A.panax)、立枯絲核菌(Rh.solani)、惡疫霉菌(Ph.cactorum)和人參核盤菌(S.schinseng) 6種病原菌防控上的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供了一種對(duì)上述引起人參根腐病、銹腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的6種病原菌均具有良好防控作用的解淀粉芽孢桿菌SZ-60，該菌株的保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌SZ-60,分類命名為Bacillus amyloliquefaciensSZ-60,保藏單位為:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期:2013年9月25日，保藏編號(hào):CGMCC N0.8277，其 16SrDNA 序列長(zhǎng)度為 1436bp，具體如 SEQ ID No:l 所示。應(yīng)用 BLAST軟件和DNAMAN軟件等進(jìn)行分析，將SZ-60菌株的16SrDNA序列通過BLAST比對(duì)，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與SZ-60菌株相似性最高的是Bacillusamyloliquefaciens,同源性達(dá)到99%。根據(jù)MEGA5.10Beta2軟件以UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，SZ-60與Bacillus amyloliquefaciens同屬一個(gè)遺傳分枝,親緣關(guān)系十分接近,親源性達(dá)到了 100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化性狀的鑒定結(jié)果，可以確認(rèn)本發(fā)明的菌株SZ-60為解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)o
[0009]本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60在牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落不規(guī)則、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤(rùn)、半透明；鏡檢呈桿狀，大小為0.3~0.4X3.2~3.3 iim，具鞭毛，G -，有芽孢；其能在25°C~40°C的溫度下生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為32°C ;其生長(zhǎng)pH范圍為6.5~8.0，最適生長(zhǎng)pH為7.2 ;需氧生長(zhǎng)；硝酸鹽還原反應(yīng)生成紅色化合物；接觸酶測(cè)定為陽(yáng)性；脂肪酶反應(yīng)為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應(yīng)呈陰性；不能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解試驗(yàn)鏡檢有糊精生成；明膠液化試驗(yàn)呈陽(yáng)性；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基呈酸性(綠色)；V-P(pH 7.0)測(cè)定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇檢測(cè)呈陽(yáng)性；在含有2%~5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。所述的牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaC15.0g，瓊脂17g，水1000mL, pH 6.8 ~7.2。
[0010]本發(fā)明還涉及解淀粉芽孢桿菌SZ-60在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的的應(yīng)用，所述植物優(yōu)選為人參，所述真菌優(yōu)選為引起人參根腐病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、引起人參銹腐病的毀滅柱孢菌(C.destructans) ><71起人參黑斑病的人參鏈格孢菌(A.panax)、引起人參立枯病的立枯絲核菌(Rh.solani)、弓丨起人參疫病的惡疫霉菌(Ph.cactorum)和引起人參菌核病的人參核盤菌(S.schinseng)這6種病原菌中的一種或多種。本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60對(duì)人參還具有促生長(zhǎng)的作用。
[0011]本發(fā)明還涉及含有解淀粉芽孢桿菌SZ-60的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物和解淀粉芽孢桿菌SZ-60的孢子的微生物制劑，其可通過以下制備方法制備得到:
[0012](1)將解淀粉芽孢桿菌SZ-60試管種接種于用1000mL三角瓶裝的300mL營(yíng)養(yǎng)肉湯酵母膏(NBY)培養(yǎng)液中，在180轉(zhuǎn)/min，30°C下培養(yǎng)36小時(shí)，獲得發(fā)酵菌液；
[0013](2)將發(fā)酵菌液在以種子罐體積20%接種于種子罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，種子罐的溫度30~34°C，接種發(fā)酵菌液4小時(shí)后，每隔2小時(shí)對(duì)種子罐中的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測(cè)，直到發(fā)酵液菌體生長(zhǎng)比較飽滿即將出現(xiàn)芽孢時(shí)，獲得發(fā)酵菌種，種子罐中的發(fā)酵時(shí)間為12~16小時(shí)；
[0014](3)將種子罐中發(fā)酵菌種的10%接種于發(fā)酵罐中的NBY培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵罐的溫度30~34°C，接種發(fā)酵菌種4小時(shí)后，每隔2小時(shí)對(duì)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測(cè)，觀察菌含量，直到發(fā)酵罐發(fā)酵液中的最終培養(yǎng)物(包括菌和芽孢)生物量為109cfu/ml以上、芽孢含量大于或等于90%時(shí)，立即將發(fā)酵液出罐，進(jìn)行分裝，獲得SZ-60微生物制劑；發(fā)酵罐中的發(fā)酵時(shí)間為24~36小時(shí)。
[0015]NBY培養(yǎng)液的配方為:牛肉膏3.5g，蛋白胨l0.0g，酵母浸膏5.0g，麥芽浸膏10g，葡萄糖5.0g，水1000mL，pH6.8~7.2 ;制備方法為:稱取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麥芽浸膏、葡萄糖放入1000mL水中，充分混勻后將pH調(diào)整至6.8~7.2，1000mL三角瓶中裝量為300mL培養(yǎng)液，用雙層封口膜封好三角瓶口，121°C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后備用。發(fā)酵培養(yǎng)液的配方以重量百分比計(jì)為:大豆粉2.0%，豆餅粉1.5%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，玉米漿
0.2%，NaCl0.1%，Ca(HCO3)20.2%，余量為水，ρΗ7.0~7.2 ;制備方法為在種子罐中加入所需的水，按比例加入大豆粉、豆餅粉、淀粉、酵母浸膏、玉米漿、NaCUCa(HCO3)2，充分?jǐn)嚢瑁瑢l(fā)酵培養(yǎng)液PH調(diào)整到7.0~7.2，密封加料孔，用高溫蒸汽滅菌2小時(shí)，冷卻后立即接種。
[0016]在種子罐或發(fā)酵罐的發(fā)酵過程中，當(dāng)出現(xiàn)較多泡沫時(shí)，可以加入消泡劑，所述的消泡劑為有機(jī)娃，加入量以種子te或發(fā)酵te中的泡沫不&出為準(zhǔn)；發(fā)酵中發(fā)酵完成后，在發(fā)酵罐中加入占罐中液體總體積萬(wàn)分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，再出罐進(jìn)行分裝。
[0017]通過上述發(fā)酵工藝得到的發(fā)酵液即為一種微生物殺菌劑。本發(fā)明的微生物制劑可以以稀釋液的形式均勻地施加到土壤中，微生物制劑與水的稀釋體積比為1:100。另外，稀釋液中還可以添加助劑有機(jī)硅，有機(jī)硅與稀釋液的體積比為1:5000。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，保藏號(hào)為CGMCC N0.8277的解淀粉芽孢桿菌SZ-60對(duì)分別引起人參根腐病、銹腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、毀滅柱孢菌(C.destructans)、人參鏈格抱菌(A.panax)、立枯絲核菌(Rh.solani)、惡疫霉菌(Ph.cactorum)和人參核盤菌(S.schinseng) 6種病原菌均具有良好的防治效果,對(duì)人參具有促生長(zhǎng)作用，無(wú)毒無(wú)致病性，對(duì)人畜安全，不污染環(huán)境；同時(shí)，生防菌劑稀釋后直接施加到土壤中對(duì)植物進(jìn)行灌根處理即可發(fā)揮其殺菌作用，能顯著改善人參根際環(huán)境中微生物群落的合理結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)生物多樣化的人參根際土壤微生態(tài)環(huán)境，從而有效地、持久地控制人參真菌性病害的流行?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0019]圖1:本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60菌株對(duì)毀滅柱孢菌(CyI indrocarpondestructans)菌絲的生長(zhǎng)平板抑制作用。
[0020]圖2:本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60菌株對(duì)腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)菌絲的生長(zhǎng)平板抑制作用。
[0021]圖3:本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60菌株對(duì)人參鏈格孢菌(Alternaria panax)菌絲的生長(zhǎng)平板抑制作用。
[0022]圖4:本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60菌株對(duì)人參核盤菌(Sclerotiniaschinseng)菌絲的生長(zhǎng)平板抑制作用。
[0023]圖5:本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60菌株對(duì)立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)菌絲的生長(zhǎng)平板抑制作用。
[0024]圖6:本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SZ-60菌株對(duì)惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)菌絲的生長(zhǎng)平板抑 制作用。
[0025]圖7:SZ-60對(duì)人參的促生長(zhǎng)作用(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0026]圖8:SZ-60對(duì)毀滅柱孢菌引起的人參銹腐病的防治效果(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0027]圖9:SZ_60對(duì)惡疫霉菌引起的人參疫病的防治效果(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0028]圖10:SZ-60對(duì)人參核盤菌引起的人參菌核病的防治效果(A:空白，B:燒注SZ-60菌懸液)。
[0029]圖11:SZ-60對(duì)腐皮鐮孢菌引起的人參根腐病的防治效果(A:空白，B:燒注SZ-60菌懸液)。
[0030]圖12:SZ_60對(duì)人參鏈格孢菌引起的人參黑斑病的防治效果(A:空白，B:澆注SZ-60菌懸液)。
[0031]圖13:SZ-60對(duì)立枯絲核菌引起的人參立枯病的防治效果(A:空白，B:燒注SZ-60菌懸液)。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1
[0033]解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) SZ-60菌株的分離和保藏
[0034]該菌株自吉林省撫松縣萬(wàn)良鎮(zhèn)人參栽培地多年生人參根際周圍30cm以內(nèi)的土壤分離得到。采集上述土壤樣品，風(fēng)干后過篩。稱取樣品10g，放入裝有玻璃珠和90mL無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩10-30min，使樣品與無(wú)菌水混合均勻，制得樣品懸液，靜置5min。在無(wú)菌條件下取ImL上清液，加入9mL0.05%SDS水溶液(十二烷基硫酸鈉水溶液)，40°C保溫20min，取lmL，加入9mL無(wú)菌水，按梯度依次制成10' 10_4、10_5的稀釋液。分別吸取100 u L各稀釋液加入到牛肉膏蛋白胨(NB)平板上，采用平板稀釋法均勻涂布，每處理3次重復(fù)，34°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)I~2天。挑選單菌落轉(zhuǎn)接到NB平板培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后，用接種環(huán)進(jìn)行劃線分離純化，純化菌株于4°C保存。牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基的配方為:牛肉膏3.0g、蛋白胨 10.0g、NaC15.0g，瓊脂 17g，水 1000mL, pH6.8 ~7.2。
[0035]該菌株在NB培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落不規(guī)則、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤(rùn)、半透明；鏡檢呈桿狀，大小為0.3~0.4X3.2~3.3iim，具鞭毛，G -，有芽孢；其能在25°C~40°C的溫度下生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為32°C;其生長(zhǎng)pH范圍為6.5~8.0，最適生長(zhǎng)pH為7.2 ;需氧生長(zhǎng)；硝酸鹽還原反應(yīng)生成紅色化合物；接觸酶測(cè)定為陽(yáng)性；脂肪酶反應(yīng)為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應(yīng)呈陰性；不能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解試驗(yàn)鏡檢有糊精生成；明膠液化試驗(yàn)呈陽(yáng)性；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基呈酸性(綠色)；V-P(pH 7.0)測(cè)定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇檢測(cè)呈陽(yáng)性；在含有2%~5%的NaCl的NB培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。
[0036]該菌株于2013年9月25日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.8277。
[0037]該菌株我們命名為SZ-60，分類命名為:解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
[0038]實(shí)施例2
[0039]解淀粉芽孢桿菌SZ-60菌株對(duì)人參真菌病害病原菌生長(zhǎng)的抑制作用
[0040]采用濾紙片法測(cè)定菌株SZ-60對(duì)人參真菌病害病原菌的拮抗作用:用直徑8mm的打孔器將活化好的人參病原菌菌落制成相應(yīng)尺寸的菌餅，無(wú)菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板(直徑90mm)的正中央，同時(shí)將4片直徑為Icm的滅菌濾紙圓片粘于距平板中心25mm處的4個(gè)角點(diǎn)上。將菌株SZ-60制成菌懸液(濃度約為108cfu/mL)，其中3片濾紙圓片每片點(diǎn)接20 y L菌懸液，I片濾紙圓片點(diǎn)接20 y L無(wú)菌水，作為處理組，每個(gè)處理重復(fù)3次；另在一塊平板的4個(gè)角點(diǎn)的4片濾紙圓片上均分別點(diǎn)接20 y L無(wú)菌水，作為對(duì)照組，均置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)6~7天，待對(duì)照組病原菌菌落長(zhǎng)滿平板，測(cè)量處理組病原菌菌落直徑(單位:mm)，并按照如下公式計(jì)算抑菌率。每種病原菌重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。
[0041 ]抑菌率(%) = [ (A — B) / (A — 8) ] X 100%
[0042]注:A為對(duì)照組病原菌菌落直徑，即90mm ；B為處理組病原菌菌落直徑。
[0043]馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的制備方法:稱取去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g，加入水1000mL,調(diào)節(jié)pH為7.0。在沸水浴上加熱20min，紗布過濾后定容到1000mL,加瓊脂22g熔化后分裝濕熱滅菌(12rC，30min)。
[0044]上述菌懸液的制備方法:保藏的菌株SZ-60通過平板劃線方式活化2天后，用接種環(huán)取3~4塊直徑Icm的細(xì)菌菌落，接入到200mL含50mL牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)液的三角錐形瓶中，搖床32°C，180r/min培養(yǎng)48h后制成濃度約為108cfu/mL的細(xì)菌菌懸液。NB培養(yǎng)液的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g，水1000mL, pH6.8~7.2。
[0045]結(jié)果如表1所示，菌株SZ-60對(duì)分別引起人參根腐病、銹腐病、黑斑病、立枯病、疫病和菌核病的腐皮鐮孢菌(F.solani)、毀滅柱孢菌(C.destructans)、人參鏈格孢菌(A.panax)、立枯絲核菌(Rh.solani)、惡疫霉菌(Ph.cactorum)和人參核盤菌(S.schinseng) 6種病原菌均具有明顯的抑制作用。特別是對(duì)引起人參疫病的惡疫霉菌和引起人參銹腐病的毀滅柱孢菌的抑菌率達(dá)到了 90%以上，對(duì)引起黑斑病的人參鏈格孢菌、弓丨起人參根腐病的腐皮鐮孢菌和引起人參菌核病的人參核盤菌的抑菌率為71~82%，對(duì)引起人參立枯病的立枯絲核菌的抑菌率也達(dá)到了 46.4%，反映出菌株SZ-60對(duì)人參6種主要病原菌的防治作用具有廣譜性。
[0046]表1菌株SZ-60對(duì)人參病原真菌的抑制作用
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SZ_60,其特征在于,其保藏號(hào)為 CGMCC N0.8277。
2.如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌SZ-60，其特征在于，該菌株在牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基上單細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)形成的菌落不規(guī)則、乳白色、中心稍隆起、表面濕潤(rùn)、半透明。鏡檢呈桿狀，大小為0.3~0.4X3.2~3.3 μ m，具鞭毛，G -，有芽孢。其能在25°C~40°C的溫度下生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為32°C。其生長(zhǎng)pH范圍為6.5~8.0，最適生長(zhǎng)pH為7.2。需氧生長(zhǎng)；硝酸鹽還原反應(yīng)生成紅色化合物。接觸酶測(cè)定為陽(yáng)性；脂肪酶反應(yīng)為陰性；酪蛋白、酪氨酸反應(yīng)呈陰性。不能利用D-葡萄糖、D-木糖。淀粉水解試驗(yàn)鏡檢有糊精生成。明膠液化試驗(yàn)呈陽(yáng)性；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基呈酸性(綠色)。V-P(pH7.0)測(cè)定生成紅色化合物；L_阿拉伯糖、甘露醇檢測(cè)呈陽(yáng)性；在含有2%~5%的NaCl的牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。 所述的牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基的配方為:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0gJlC月旨 17g，水 1000mL, ρΗ6.8 ~7.2。
3.如權(quán)利要求1或2所述的解淀粉芽孢桿菌SZ-60在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，或在制備防治植物真菌病害的微生物制劑中的應(yīng)用。 優(yōu)選地，所述植物為人參。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述真菌為腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、毀滅柱抱菌(Cylindrocarpon destructans)、人參鏈格抱菌(Alternariapanax)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)和人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)中的一種或多種。
5.—種微生物制劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1的解淀粉芽孢桿菌SZ-60的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物和解淀粉芽孢桿菌SZ-60的孢子。
6.如權(quán)利要求5所述的微生物制劑，其特征在于，其是通過以下制備方法制備得到的: (1)將如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌SZ-60試管種接種于用1000mL三角瓶裝的300mL營(yíng)養(yǎng)肉湯酵母膏(NBY)培養(yǎng)液中，在180r/min，30°C下培養(yǎng)36小時(shí)，獲得發(fā)酵菌液； (2)將發(fā)酵菌液在以種子罐體積20%接種于種子罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，種子罐的溫度30~34°C，接種發(fā)酵菌液4小時(shí)后，每隔2小時(shí)對(duì)種子罐中的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測(cè)，直到發(fā)酵液菌體生長(zhǎng)比較飽滿即將出現(xiàn)芽孢時(shí)，獲得發(fā)酵菌種，種子罐中的發(fā)酵時(shí)間為12~16小時(shí)； (3)將種子罐中發(fā)酵菌種的10%接種于發(fā)酵罐中的NBY培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，溶氧量為18~20%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵罐的溫度30~34°C，接種發(fā)酵菌種4小時(shí)后，每隔2小時(shí)對(duì)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵質(zhì)量檢測(cè)，觀察菌含量，直到發(fā)酵罐中發(fā)酵液中的最終培養(yǎng)物(包含菌和芽孢)生物量為109cfu/ml以上、芽孢含量大于或等于90%時(shí)，立即將發(fā)酵液出罐，進(jìn)行分裝，獲得SZ-60微生物制劑；發(fā)酵罐中的發(fā)酵時(shí)間為24~36小時(shí)。 優(yōu)選地，所述的NBY培養(yǎng)液的配方為:牛肉膏3.5g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，麥芽浸膏10g，葡萄糖5.0gjK lOOOmL，pH6.8~7.2 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方以重量百分比計(jì)為:大豆粉2.0%，豆餅粉1.5%，淀粉0.5%，酵母浸膏0.2%，玉米漿0.2%，NaCl0.1%，Ca(HCO3)20.2%，余量為水，ρΗ7.0 ~7.2。 更優(yōu)選地，所述的NBY培養(yǎng)液是這樣配制的:稱取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麥芽浸膏、葡萄糖放入1000mL水中，充分混勻后將pH調(diào)整至6.8~7.2，1000mL三角瓶中裝量為300mL培養(yǎng)液，用雙層封口膜封好三角瓶口，121°C濕熱滅菌30分鐘，冷卻后備用； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)液是這樣配制的:在種子罐中加入所需的水，按比例加入大豆粉、豆餅粉、淀粉、酵母浸膏、玉米漿、NaCl、Ca (HCO3)2，充分?jǐn)嚢?，將發(fā)酵培養(yǎng)液pH調(diào)整到7.0~7.2，密封加料孔，用高溫蒸汽滅菌2小時(shí)，冷卻后立即接種。
7.如權(quán)利要求6所述的微生物制劑，其特征在于:在種子罐或發(fā)酵罐的發(fā)酵過程中，當(dāng)出現(xiàn)較多泡沫時(shí)，加入消泡劑，所述的消泡劑為有機(jī)硅，加入量以種子罐或發(fā)酵罐中的泡沫不溢出為準(zhǔn)；發(fā)酵罐中發(fā)酵完成后，在發(fā)酵罐中加入占罐中液體總體積萬(wàn)分之二的苯甲酸防腐劑，攪拌均勻，再出罐進(jìn)行分裝。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的微生物制劑在防治人參真菌病害中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述真菌為腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、毀滅柱抱菌(Cylindrocarpon destructans)、人參鏈格抱菌(Alternariapanax)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、惡疫霉菌(Phytophthora cactorum)和人參核盤菌(Sclerotinia schinseng)中的一種或多種。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，在人參真菌病害發(fā)病初期，將所述微生物制劑的稀釋液均勻地施加到土壤中，所述稀釋液中微生物制劑與水的稀釋體積比為1:100。 優(yōu)選地，所述的稀釋液中還添加了助劑有機(jī)硅，所述助劑有機(jī)硅與稀釋液的體積比為1:5000。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK103789234SQ201410017081
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】楊利民, 孫卓, 韓梅, 林紅梅 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)