防治小麥禾谷孢囊線蟲病的生防菌株s07、制備生防菌劑的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07，所述防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07為環(huán)狀鏈霉菌（Streptomycesanulatus），保藏號為CGMCCNO：8630。本發(fā)明是專門針對小麥孢囊線蟲病開發(fā)的生防菌劑，由于是生物制劑，完全沒有因化學農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于小麥作物的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或者少用其他化學農(nóng)藥的用量，這樣不僅可以為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于提升糧食品質。室內和田間防治試驗驗證了S07菌劑對小麥孢囊線蟲病具有較好的防治效果。同時，該菌劑還有增產(chǎn)功能，可以為農(nóng)民增加收入。
【專利說明】防治小麥禾谷抱囊線蟲病的生防囷株S07、制備生防囷劑的方法及其應用【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物保護領域，公開了一種防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07及
其應用。
【背景技術】
[0002]禾谷孢囊線蟲(Cereal cyst nematode, CCN)屬線蟲綱,墊刃線蟲目，異皮線蟲科，異皮線蟲屬，為害小麥、大麥、燕麥、黑麥等禾谷類作物和牧草，目前在我國小麥上已發(fā)現(xiàn)燕麥孢囊線蟲(Heterodera avenae)和菲利普孢囊線蟲(Heteradera filipjevi)兩種病原物，嚴重威脅著我國糧食安全生產(chǎn)。由于目前生產(chǎn)上缺乏抗(耐)病品種和高效低毒的化學農(nóng)藥，植物寄生線蟲的生物防治受到人們的極大關注。
[0003]人們在對植物寄生線蟲的生防因子進行分離時發(fā)現(xiàn)放線菌的分離頻率較高而且對蔬菜、煙草根結線蟲和孢囊線蟲都具有很強的寄生作用和致死作用。放線菌是產(chǎn)生抗生素和其他生物活性物質的重要微生物，從除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的代謝物中分離到的一種大環(huán)內酯化合物-阿維菌素(Avermectin)，已被證明具有高效廣譜的殺線蟲活性并在各國開發(fā)成商品制劑。除此之外，放線菌產(chǎn)生的南昌霉素(Nanchangmycin)、莫比霉素(Milbemycin)、戒臺霉素(Jietaicin)等也都具有很高的殺線蟲活性。因此,放線菌作為植物寄生線蟲的生防因子具有巨大的潛力。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中沒有對小麥禾谷孢囊線蟲病有較高防效的生防制劑的現(xiàn)狀，提供開發(fā)一種防治小麥禾谷孢囊線蟲病的單一生防菌株及其菌劑，該菌劑對小麥禾谷孢囊線蟲的室內防治效果達到60%以上，田間防治效果達到45%以上。一種防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07,分類命名:環(huán)狀鏈霉菌,拉丁文學名:Streptomycesanulatus。保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱:CGMCC，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2013年12月23日，保藏號為 CGMCC N0.8630。
[0005]本發(fā)明的技術方案是:所述的防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07制備生防菌劑的方法，S07在PDA培養(yǎng)液中28°C，160rpm震蕩培養(yǎng)48-50小時，作為種子液培養(yǎng)基，然后取2ml種子液培養(yǎng)基加入250g麥粒砂培養(yǎng)基中，隔天搖瓶，25°C培養(yǎng)8_10天，得到生防菌劑。
[0006]所述的生防菌劑在防治小麥孢囊線蟲病中的應用。
[0007]所述的生防菌劑在小麥增產(chǎn)中的應用。
[0008]所述PDA培養(yǎng)液為馬鈴薯200g / L，葡萄糖20g / L，瓊脂粉18g / L。
[0009]所述生防菌劑在防治小麥禾谷孢囊線蟲病方面的應用方法為:將S07生防菌劑按照20-25g / m-2進行溝施。[0010]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明是專門針對小麥孢囊線蟲病開發(fā)的生防菌劑，由于是生物制劑，完全沒有因化學農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于小麥作物的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或者少用其他化學農(nóng)藥的用量，這樣不僅可以為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于提升糧食品質。室內和田間防治試驗驗證了 S07菌劑對小麥孢囊線蟲病具有較好的防治效果。同時，該菌劑還有增產(chǎn)功能，可以為農(nóng)民增加收入。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為S07生防菌劑在田間試驗中對小麥鮮重的影響；
[0012]圖2為S07生防菌劑在田間試驗中對小麥產(chǎn)量的影響；
[0013]圖3為S07菌株的正面菌落特；
[0014]圖4為S07菌株的背面菌落特；
[0015]圖5為S07孢子及孢子鏈；
[0016]圖6為生防菌株S07基于16s_rRNA序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實施方式】
[0017]一種防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07，分類命名:環(huán)狀鏈霉菌，拉丁文學名:Streptomyces anulatus。保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱:CGMCC，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2013年12月23日，保藏號為CGMCC N0.8630。
[0018]所述的防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07制備生防菌劑的方法，S07在PDA培養(yǎng)液中28°C，160rpm震蕩培養(yǎng)48-50小時，作為種子液培養(yǎng)基，然后取2ml種子液培養(yǎng)基加入250g麥粒砂培養(yǎng)基中，所述麥粒砂培養(yǎng)基為煮熟麥粒與細砂的質量之比為3: 1，121°C高壓滅菌lh，隔天搖瓶，25°C培養(yǎng)8-10天，得到生防菌劑。
[0019]所述的生防菌劑在防治小麥孢囊線蟲病中的應用。
[0020]所述的生防菌劑在小麥增產(chǎn)中的應用。
[0021]所述PDA培養(yǎng)液為馬鈴薯200g / L，葡萄糖20g / L，瓊脂粉18g / L。
[0022]所述生防菌劑在防治小麥禾谷孢囊線蟲病方面的應用方法為:將S07生防菌劑按照20-25g / m-2進行溝施。
[0023]菌株來源:生防菌S07，2009年7月再許昌小麥孢囊線蟲病田中的孢囊上分離得到。
[0024]菌株分離方法:將取來的孢囊用70%的酒精消毒3min，再用1 %的次氯酸鈉消毒lmin，用無菌水沖洗3次，把孢囊在滅過菌的玻片上壓破，轉移到改良的高氏一號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20g / L，硝酸鉀Ig / L，磷酸氫二鉀0.5g / L，七水硫酸鎂0.5g / L，氯化鈉
0.5g / L，瓊脂18g / L，七水硫酸鐵0.01g / L)進行分離，25°C培養(yǎng)5d后，挑取孢囊邊緣單菌落進行劃線分離并純化，4°C冰箱中保存。
[0025]菌株篩選依據(jù):對小麥孢囊線蟲二齡線蟲(J2)的致死作用，具有方法如下，將分離到的放線菌菌株的培養(yǎng)液200ul加入50ul線蟲液(2000條/ ml)，同時設空白液體培養(yǎng)基做對照，放入15°C培養(yǎng)箱中，48h后觀察線蟲的死亡情況，用NaOH確定線蟲的死活，48h后校正死亡率為83%的處理的菌株命名為S07。[0026]菌株鑒定方法:鑒定方法為結合形態(tài)學鑒定，分子生物學鑒定及生理生化特征分析形態(tài)學鑒定:在ISP2培養(yǎng)基(酵母提取物4.0g / L，麥芽提取物10.0g / L，葡萄糖4.0g / L，瓊脂15.0g / L，pH7.3)上，氣生菌絲發(fā)達，暗灰色，能形成同心環(huán)，基內菌絲黃色，不斷裂，不產(chǎn)生色素，孢子成鏈，孢子鏈直或稍彎曲，孢子球形或橢圓形，表面光滑，經(jīng)形態(tài)學鑒定為一種鏈霉菌(Streptomyces sp.)。
[0027]分子生物學鑒定:取50~IOOmg S07菌株的菌絲體，加液氮充分研磨后，迅速轉移至1.5mL離心管中，用CTAB法提取菌株基因組DNA。利用引物fx1-f5’AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG3’和fxir5’ AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC3’進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，將DNA片段連接到PMD19，然后將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞中，進行陽性克隆的篩選，將白色克隆挑入添加氨芐的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，菌液送上海生物工程技術服務有限公司測序，將測定結果提交NCBI (National Center for Biotechnology Information)登陸(登錄號:KC814714)并進行BLAST比對分析，與登錄號為J486289的Sti^ptomycesanulatus的16s_rRNA序列相似度為100%。
[0028]生理生化鑒定:能夠利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖，不能利用蔗糖、甘露糖，能夠還原硝酸鹽，水解淀粉，利用纖維素，使牛奶凝固不胨化，不能產(chǎn)生H2S和黑色素，與環(huán)狀鏈霉菌的生理生化特征一致。綜上，將菌株S07鑒定為環(huán)狀鏈霉菌(Streptomycesanulams)。
[0029]S07生防菌劑的制備
[0030]S07菌株在PDA(馬鈴薯200g / L，葡萄糖20g / L，瓊脂粉18g / L)培養(yǎng)液中28°C，160rpm震蕩培養(yǎng)48-50小時，作為種子液培養(yǎng)基，然后取2ml培養(yǎng)液加入230_250g麥粒砂培養(yǎng)基(煮熟麥粒與細砂之比為3: 1，121°C高壓滅菌Ih)中，隔天搖瓶，25°C培養(yǎng)8-10 天。
[0031]生防菌劑S07對小麥`孢囊線蟲的溫室防治效果
[0032]從許昌地區(qū)發(fā)生小麥禾谷孢囊線蟲病的田塊中采集土壤，過篩后與滅菌土按I: 0.5混合(25-30個孢囊/ 100g)，然后將土裝于紙杯中，每杯裝病土 200-230g。將制備好的S07生防菌劑按2%、4%和6% (w / w)的比例與病土混合均勻，裝入紙杯中并輕輕壓實。挑選飽滿的溫麥19種子播種到紙杯中，每紙杯均勻播種6粒，然后覆蓋2cm厚病土。同時設4%的無菌麥粒砂處理和不接生防真菌的病土處理為陰性對照，60%阿維菌素懸浮劑6mL kg—1拌種處理作為藥劑對照。澆透水后放在15~20°C人工氣候室內培養(yǎng)。
[0033]90d后調查發(fā)病情況，將植株從紙杯中取出，并盡可能保持根系完整。將植株根系用自來水沖洗干凈，放在盛有清水的塑料盤中進行病情調查，記載單株孢囊量，計算孢囊減退率。
[0034]孢囊減退率(％) = (對照單株孢囊數(shù)-處理單株孢囊數(shù))/對照單株孢囊數(shù) X100%o
[0035]表1 S07生防菌劑對小麥禾谷孢囊線蟲病室內防治效果測定
[0036]
【權利要求】
1.一種防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07，其特征在于:所述防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07為環(huán)狀鏈霉菌(Sirepio焊Ce1S保藏號為CGMCC NO:8630。
2.如權利要求1所述的防治小麥禾谷孢囊線蟲的生防菌株S07制備生防菌劑的方法，其特征在于:S07在PDA培養(yǎng)液中28°C，160 rpm震蕩培養(yǎng)48-50小時，作為種子液培養(yǎng)基，然后取2 ml種子液培養(yǎng)基加入250g麥粒砂培養(yǎng)基中，隔天搖瓶，25°C培養(yǎng)8_10天，得到生防菌劑。
3.如權利要求2所述的生防菌劑在防治小麥孢囊線蟲病中的應用。
4.如權利要求2所述的生防菌劑在小麥增產(chǎn)中的應用。
【文檔編號】A01P21/00GK103805540SQ201410016970
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權日:2014年1月15日
【發(fā)明者】李洪連, 張潔, 付博, 李永輝, 袁虹霞, 石穎斐 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學