一株高粘附力乳酸桿菌菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及飼用益生菌領(lǐng)域，特別涉及一株高粘附力乳酸桿菌菌株及其應用。該乳酸桿菌其具有良好的抑制病原菌黏附功能。一株高粘附力乳酸桿菌菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101），保藏日期2013年12月9日，保藏編號CGMCCNo.8542，菌株編號為ZJ617，分類命名為 Lactobacillusreuteri 。具有高粘附能力的乳酸桿菌菌株ZJ617，是為研究益生菌或乳酸桿菌的粘附機制提供有效的高粘附力模式菌株，同時在開發(fā)新型微生態(tài)制劑、應用微生物飼料添加劑、增強酸奶品質(zhì)、改善人和動物微生物穩(wěn)態(tài)都具有重要的實踐意義。
CGMCC No.8542
2013.12.09
【專利說明】一株高粘附力乳酸桿菌菌株及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及飼用益生菌領(lǐng)域，特別涉及一株高粘附力乳酸桿菌菌株及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在自然界存在的人類、動物和植物，不論體表還是體內(nèi)都有大量的微生物參與活 動。微生物和宿主有各自的生理生化體系，但是兩者存在著相互促進和相互制約的關(guān)系。宿 主的正常生理生化參數(shù)和病理參數(shù)都是兩者相互作用的結(jié)果。人和動物的腸道是一個具有 生物多樣性的微環(huán)境，其中具有幾百種微生物菌群，不同微生物菌群之間的相互作用構(gòu)成 腸道微生物穩(wěn)態(tài)。正常人和動物機體腸道菌群組成相對恒定，而當機體處于外環(huán)境變化或 者接受應激反應會引起動物體內(nèi)腸道微生物菌群失調(diào)。
[0003] 益生菌（Probiotics)為腸道微生物重要組成，在腸道中發(fā)揮著重要的益生作用。 益生菌是定植于人和動物腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效的活性有益微生物(細 菌或者酵母）的總稱。常見的益生菌包括乳酸桿菌（Lactobacillus species)、雙歧桿菌 (Bifidobacterium species)、鏈球菌（Streptococcus species)等。益生菌發(fā)揮功能的機 制包括改善機體免疫功能、干預病原微生物從而防止機體感染、修復機體微生物菌群穩(wěn)態(tài) 等。
[0004] 乳酸桿菌與人和動物的生命活動息息相關(guān)，是人和動物體內(nèi)必不可少的重要益 生菌群，具有重要的生理功能、理想的保健和醫(yī)療效果。在不同環(huán)境中，通過引入乳酸桿 菌改變腸道菌群是有益的，來自這種方法的營養(yǎng)和治療益處在許多研究中已有報道，這種 益處包括增加營養(yǎng)素的利用、乳糖不耐癥的減少、腸道感染防治以及腸道中病原微生物 抑制。國際上對益生菌的選擇重要標準之一就是，益生菌必須能夠耐受消化道的強酸和 高膽鹽環(huán)境，并具有良好的粘附能力才能發(fā)揮益生作用。據(jù)研究報道，鼠李糖乳酸桿菌 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)能夠粘附定植在嬰兒小腸上，可有效縮短嬰兒輪狀病 毒的腹瀉時間，同時具有對消化道的強酸和高膽鹽環(huán)境有良好的耐受能力，是目前被國際 公認的安全的益生菌菌株。
[0005] 為了發(fā)揮乳酸桿菌對機體健康的促進作用，其在胃腸道中必須保持一定的數(shù)量， 同時必須具有對胃腸道中的溫度、pH、膽鹽和金屬一定的耐受能力，從而防止被快速排除。 乳酸桿菌對粘膜表面的粘附能力可為其提供競爭優(yōu)勢，通過與病原菌競爭性粘附腸道上皮 細胞粘附位點從而抑制病原菌的生長擴繁，這一點對于維持消化道菌群平衡非常重要。嗜 酸乳酸桿菌菌株通過菌體本身的粘附占位阻斷病原菌與細胞膜靶受體的結(jié)合，可以抑制腸 出血性大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌對腸道上皮細胞的粘附和侵襲，從而起到保護腸道的作 用。顯然，對上皮細胞表面粘附位點的粘附能力是乳酸桿菌在消化道長期定植并發(fā)揮益生 作用的必要條件。
[0006] 目前國內(nèi)外的研究顯示益生菌以及乳酸桿菌的粘附性具有菌株特異性，高粘附性 能的模式菌株較少，尚缺乏粘附相關(guān)的保護和機制研究性資料。在體內(nèi)研究菌的粘附是困 難的，體外模擬體系中進行的評估已是公認的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一株從仔豬腸道分離獲得的具有高粘附力的乳酸桿菌，其具有良好的 抑制病原菌黏附功能。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0009] -株高粘附力乳酸桿菌菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)， 保藏日期2013年12月9日，保藏編號CGMCC No. 8542,菌株編號為ZJ617,分類命名為 Lactobacillus reuteri〇
[0010] 本發(fā)明人從28日齡的斷奶仔豬腸道分離篩選、純化得到一株高粘附力乳酸桿菌 菌株。該菌株的生物學性質(zhì)如下：
[0011] 形態(tài)學特征：在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0. 1?2.0mm之間，圓形，乳 白色，邊緣整齊，不透明，表面濕潤光滑，無色素。在顯微鏡下觀察，菌株細胞呈細桿狀，不生 孢。屬于革蘭氏陽性菌，不運動。
[0012] 培養(yǎng)特征：最適生長溫度30?37°C，兼性厭氧，有氧時生長慢，最適生長初始pH 為5. 7。生長于MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分：蛋白胨10. Og/L、牛肉粉8. Og/L、酵母粉4. Og/ L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氫二鉀2. Og/L、檸檬酸氫二銨2. Og/L、乙酸鈉5. Og/L、硫酸鎂0. 2g、 硫酸錳 〇? 04g/L、吐溫 801. 0g/L。
[0013] 本發(fā)明提供的乳酸桿菌Lactobacillus reuteri ZJ617,具有高粘附力，同時具有 對熱、酸、膽鹽和金屬（銅和鋅）良好的耐受能力，證明該菌株具有良好的益生特性，能被用 來開發(fā)益生菌產(chǎn)品。乳酸桿菌ZJ617對病原菌(如大腸桿菌和沙門氏菌）粘附腸道細胞的 競爭、排斥、驅(qū)除性抑制方面具有顯著的功效，能被用來開發(fā)抑制病原菌的菌劑。可以在研 究益生菌和乳酸桿菌的粘附機制，以及微生態(tài)制劑的研發(fā)等方面作為模式菌株。該乳酸桿 菌ZJ617因其具備的益生特性，將有廣闊的應用前景，具有很高的社會效益、經(jīng)濟效益和生 態(tài)效益。
[0014] 一種乳制品包括如所述的高粘附力乳酸桿菌。
[0015] 一種所述的高粘附力乳酸桿菌菌株在發(fā)酵生產(chǎn)酸奶中的應用。
[0016] 一種益生菌飼料添加劑包括所述的高粘附力乳酸桿菌。具有高粘附力的乳酸桿菌 ZJ617能抑制動物腸道內(nèi)致病菌作用，提高動物免疫力。
[0017] 作為優(yōu)選，所述的益生菌飼料添加劑還包括載體，所述的高粘附力乳酸桿菌與載 體的質(zhì)量比為2-3:15-30。本發(fā)明提供的益生菌微生物飼料添加劑，用于水產(chǎn)飼料中，其添 加量為飼料總重量的〇. 5-2% ;用于全價豬飼料中，其添加量為飼料總重量的2-5%。本發(fā)明 可提高動物生長性能，增加飼料利用率，降低飼料成本，增加動物攝食量，提高免疫機能，減 少動物腸道疾病死亡率，達到改善肉質(zhì)品質(zhì)的目的。
[0018] 作為優(yōu)選，所述的載體為微晶高嶺石、貝殼粉、甘薯淀粉及玉米淀粉中的任意一種 或兩種以上的混合物。微晶高嶺石、貝殼粉、甘薯淀粉、玉米淀粉是益生菌增殖所需要的營 養(yǎng)源，提高有益菌存活率，刺激宿主本身有益菌生長繁殖，并對菌體本身起到保護和附著作 用。
[0019] 具體的,本發(fā)明提供一種配方,乳酸桿菌ZJ617與載體按3:16的質(zhì)量比混合，載體 為微晶高嶺石、貝殼粉、甘薯淀粉及玉米淀粉的混合物，質(zhì)量比為1:1:1-2:1-2。所述乳酸桿 菌ZJ617和載體在300?350轉(zhuǎn)/min，攪拌10?20min，混合均勻，制得益生菌微生物飼料 添加劑。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：具有高粘附能力的乳酸桿菌菌株ZJ617,是為研究益生菌 或乳酸桿菌的粘附機制提供有效的高粘附力模式菌株，同時在開發(fā)新型微生態(tài)制劑、應用 微生物飼料添加劑、增強酸奶品質(zhì)、改善人和動物微生物穩(wěn)態(tài)都具有重要的實踐意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是乳酸桿菌的鏡檢圖片；
[0022] 圖2是分離獲得乳酸桿菌腸道來源分布示意圖；
[0023] 圖3是乳酸桿菌的生化鑒定部分結(jié)果；
[0024] 圖4是乳酸桿菌16S rDNA的全長片段擴增電泳圖譜；
[0025] 圖5是分離獲得85株乳酸桿菌16SrDNA的進化樹圖譜；
[0026] 圖6是高粘附菌株ZJ617和低粘附菌株ZJ610的鏡檢圖；
[0027] 圖7是乳酸桿菌對大腸桿菌的競爭抑制結(jié)果圖（CFU/well X IO4);
[0028] 圖8是乳酸桿菌對大腸桿菌的排斥結(jié)果圖（CFU/well X IO4);
[0029] 圖9是乳酸桿菌對大腸桿菌的去除性抑制結(jié)果圖（CFU/well X IO4);
[0030] 圖10是乳酸桿菌對沙門氏菌的競爭抑制作用（CFU/well X IO4);
[0031] 圖11是乳酸桿菌對沙門氏菌的排斥抑制作用（CFU/well X IO4);
[0032] 圖12是乳酸桿菌和去表面蛋白乳酸桿菌對沙門氏菌的驅(qū)除抑制作用（CFU/ well X104)。

【具體實施方式】
[0033] 為更進一步闡述本發(fā)明為達成預定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合 附圖及較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具有高粘附力的乳酸桿菌ZJ617對病原菌粘附腸 道細胞的競爭、排斥、驅(qū)除性抑制的功效進行說明，詳細說明如后。
[0034] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等 均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常 規(guī)方法。
[0035] 實施例1 :
[0036] 本發(fā)明從28日齡的斷奶仔豬腸道獲得粘液和食糜，后涂板厭氧培養(yǎng)，單個克隆進 行純化培養(yǎng)獲得純菌落，獲得乳酸桿菌85株乳酸桿菌(部分菌株如圖1 )，其中空腸食糜36 株、回腸食糜3株、空腸粘液18株和回腸粘液28株(如圖2)。
[0037] 獲得的純菌進行美蘭染色，利用顯微鏡根據(jù)形態(tài)初步篩選出乳酸菌，后使用23種 糖發(fā)酵生化管確認乳酸桿菌的種類，生化管分別是乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、 木糖、海藻糖、棉子糖、果糖、鼠李糖、半乳糖、纖維二糖、密二糖、松三糖、甘露糖、山梨醇、阿 拉伯醇、水楊素、七葉苷、葡萄糖酸鹽、精氨酸水解、D-核糖、苦杏仁苷生化管(部分結(jié)果如圖 3)。通過生化鑒定，根據(jù)顯色反應證實所獲細菌為乳酸桿菌。
[0038] 提取85株乳酸桿菌的基因組DNA，通過正向引物和反向引物對乳酸桿菌的 16srDNA的全長進行擴增（圖4)，并測序。
[0039] 正向引物的核苷酸序列選自SEQ ID No. I-SEQ ID No. 4中的一種，即 5'-CACGGATCCAGTTTGAT(C/T) (A/C)TGGCTCAG-3';反向引物的核苷酸序列選自 SEQ ID No.5 *SEQIDNo.6JP5'-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3'。
[0040] 乳酸桿菌16S rDNA全長片段擴增結(jié)果，長度為1500bp左右，與預期結(jié)果相同。 測得序列用BLAST軟件與GenBank(EF088327)和RDP數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行相似性分 析，并與GenBank中相近的16S rRNA基因序列在Clustal X (1. 8)程序包中進行多重序列 匹配排列（Multiple alignments)分析，經(jīng)過與Genbank比對發(fā)現(xiàn)我們所獲得的乳酸桿 菌主要為三種，約氏乳酸桿菌（Lactobacillus johnsonill strain)l株，唾液乳酸桿菌 (Lactobacillus salivarius strains) 54 株，羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillus reuteri strains) 30 株。
[0041] 采用編號ZJ對菌株進行命名。采用MAGA3. 1程序包中的Neighbor-Joining法構(gòu) 建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖5)。
[0042] 本發(fā)明選擇用于后續(xù)進行人結(jié)腸癌細胞系Caco-2細胞粘附試驗的乳酸桿菌40 株。
[0043] 建立Caco-2細胞培養(yǎng)體系，細胞生長于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中， 5%C0 237°C培養(yǎng)。將細胞接種于6孔板培養(yǎng)板（I X IO6個/孔)，培養(yǎng)細胞豐度達到80%，用 磷酸緩沖液PBS沖洗3次，加入不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于5%C0 23 7°C條件下培 養(yǎng)，構(gòu)建出模擬體內(nèi)乳酸桿菌粘附Caco-2細胞的最佳粘附模型。分別對上述選擇的40株 乳酸桿菌進行Caco-2細胞能力分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中乳酸桿菌ZJ617具有高粘附能力，為 12. 35CFU/Cac〇-2,顯著高于其他菌株，如低粘附菌株ZJ610。高粘附菌株ZJ617和低粘附 菌株ZJ610見圖6,統(tǒng)計結(jié)果見表1。
[0044] 表1.乳酸桿菌粘附數(shù)量
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一株高粘附力乳酸桿菌菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏日期2013年12月9日，保藏編號CGMCC No. 8542。
2. -種益生菌飼料添加劑包括如權(quán)利要求1所述的高粘附力乳酸桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的益生菌飼料添加劑，其特征在于：還包括載體，所述的高粘附 力乳酸桿菌與載體的質(zhì)量比為2-3:15-30。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的益生菌飼料添加劑，其特征在于：所述的載體為微晶高嶺石、 貝殼粉、甘薯淀粉及玉米淀粉中的任意一種或兩種以上的混合物。
5. -種乳制品包括如權(quán)利要求1所述的高粘附力乳酸桿菌。
6. -種權(quán)利要求1所述的高粘附力乳酸桿菌菌株在發(fā)酵生產(chǎn)酸奶中的應用。
【文檔編號】A23K1/16GK104293689SQ201410043216
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】汪海峰, 劉建新, 高侃, 章文明, 張宏福, 王翀 申請人:浙江農(nóng)林大學