凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明為凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑的制備，屬于益生菌制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，所述益生菌制劑由固態(tài)發(fā)酵制備，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為：首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，2.0-8.0%(v/w)，溫度32-42℃，濕度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接種乳雙歧桿菌V9，3.0-5.0%(v/w)，溫度32-37℃，濕度70-80%，混合培養(yǎng)24-48h后經(jīng)流化床干燥獲得。凝結(jié)芽孢桿菌HM-09保藏號(hào)：CGMCCNo.6729；乳雙歧桿菌V9保藏號(hào)：CGMCCNo.5470。本發(fā)明利用分段接種技術(shù)，混菌發(fā)酵對(duì)菌種的生長(zhǎng)、增殖具有互相促進(jìn)作用，發(fā)酵后產(chǎn)品的色澤和口感等感官特征得到改善和多樣化，同時(shí)提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于益生菌制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以豆柏、麩皮、玉米粉為基質(zhì)，以益生菌凝結(jié)芽孢桿菌HM-09 (BaciIluscoagulansHM-09)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用技術(shù),此技術(shù)可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物益生菌微生態(tài)等方面。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，益生菌制品多采用益生菌直接與液態(tài)牛乳和豆乳發(fā)酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余則采用液態(tài)發(fā)酵，直接收集益生菌菌體，制作成益生菌粉劑、片劑或者膠囊。采用液態(tài)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的廢水，對(duì)環(huán)境污染較大，后處理比較困難，機(jī)器設(shè)備操作繁瑣。因此本申請(qǐng)采用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09 (BacilluscoagulansHM-09)固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉，采用固態(tài)發(fā)酵，其生產(chǎn)成本低，投資的資金較少，在下游處理方便，污染小，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易操作。采用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵豆柏，可生產(chǎn)出一種具有酸香氣味的發(fā)酵制品，改善動(dòng)物飼料的適口性。其蛋白質(zhì)被分解成小肽和游離氨基酸，有利于動(dòng)物腸胃消化吸收。
[0003]中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《一株用于乳仔豬養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用》公開(kāi)了一株用于乳仔豬養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌，所述凝結(jié)芽孢桿菌HM_09(BaciIIuscoagulans)已于2012年10月29日，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào):CGMCC N0.6729。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《一株用于母豬養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用》，公開(kāi)了一株增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、提高抗病能力以及改善妊娠母豬的繁殖性能的用于母豬養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌。所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09 (Bacilluscoagulans)已于2012年10月29日，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào):CGMCCN0.6729。本發(fā)明還公開(kāi)了其應(yīng)用方法。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《一株用于改善次等豬苗養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用》公開(kāi)了一株可改善豬苗的健康狀況、提高次等豬苗養(yǎng)殖的生產(chǎn)性能用于次等豬苗養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌。所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09 (Baci I luscoagulansHM-09 )已于2012年10月29日，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào):CGMCCN0.6729。該發(fā)明還公開(kāi)了其應(yīng)用方法。
[0004] 中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌》，公開(kāi)用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌HM-66、干酪乳桿菌F-08、植物乳桿菌HM-20和動(dòng)物雙歧桿菌V9均為益生菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)分別為CGMCCN0.6733、CGMCCN0.6735、CGMCCN0.6744和CGMCCN0.5470，枯草芽孢桿菌HM-66、干酪乳桿菌F-08和植物乳桿菌HM-20的保藏日期為2012年10月29日，動(dòng)物雙歧桿菌V9的保藏日期為2011年11月18日。該發(fā)明還公開(kāi)了其應(yīng)用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明目的在于采用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。利用分段接種技術(shù)，先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09 —定時(shí)間后，再接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9。凝結(jié)芽孢桿菌HM-09為兼性厭氧菌，而動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9為嚴(yán)格厭氧菌，發(fā)酵前期凝結(jié)芽孢桿菌HM-09的生長(zhǎng)、增殖及新陳代謝能夠?yàn)閯?dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9的增殖提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及必要的厭氧環(huán)境，更利于動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9生長(zhǎng)的啟動(dòng)，且實(shí)驗(yàn)證明，加入動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9混菌分段發(fā)酵后，凝結(jié)芽孢桿菌HM-09的活菌數(shù)有所增加。
[0006]本發(fā)明提供一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑，并提供該益生菌制劑的固體發(fā)酵制備方法，該方法可以生產(chǎn)出具有特殊酸香味，可顯著提高發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)，提高飼料原料蛋白質(zhì)的降解率及氨基態(tài)氮的含量。此制備方法生產(chǎn)成本低，可以提高經(jīng)濟(jì)效益并且操作簡(jiǎn)單。
[0007]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌制劑，所述益生菌制劑的制備方法為固態(tài)發(fā)酵，步驟包括凝結(jié)芽孢桿菌HM-09和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9的種子培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。[0009]所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖 5.0-10.0g, MgSO4.7H200.5-1.0g, K2HPO4L 0-2.0g, MnS0450_100mg，加入IL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20-50g，葡萄糖20-50g，加水至lL，pH7.0-7.2。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為:豆柏:麩皮:玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%, ρΗ7.0-7.2。
[0010]所述凝結(jié)芽孢桿菌ΗΜ-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為160-180r/min，溫度為 35-45°C，培養(yǎng) 20-24h ；
[0011]所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為30-38 °C，靜置培養(yǎng)20_24h ；
[0012]所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為:首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為2.0-8.0%(v/w)，控制發(fā)酵溫度32-42 °C，濕度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0-5.0%(v/w)，控制發(fā)酵溫度32-37°C，濕度70-80%，混合培養(yǎng)24_48h。
[0013]混合發(fā)酵初期，pH呈緩慢下降趨勢(shì)，最低可降至5.0-5.5，在發(fā)酵的后期，pH呈上升趨勢(shì)。最佳條件下，兩者混合發(fā)酵48h后，其游離氨基態(tài)氮含量為:318.2umol/g，較發(fā)酵前游離氨基態(tài)氮含量提高約3倍；發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)為2.90X IO9CFU/g，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9活菌數(shù)為5.22 X 108CFU/g,凝結(jié)芽孢桿菌腿_09芽孢率較單獨(dú)發(fā)酵提高了 2.3倍。
[0014]所述益生菌制劑的制備方法為:發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)流化床干燥獲得干燥的培養(yǎng)物。
[0015]本發(fā)明產(chǎn)品添加于飼料中，用于動(dòng)物飼喂時(shí)，能有效提高飼料的利用效率12-30%。用于禽類(lèi)飼喂時(shí)，可顯著提高日增重、提高產(chǎn)蛋率，經(jīng)計(jì)算能提高禽類(lèi)的年產(chǎn)蛋量8-20%以上。本發(fā)明產(chǎn)品在飼料中的添加量為50-150克/噸。
[0016]凝結(jié)芽抱桿菌HM-09 (Bacilluscoagulans) HM-09 已于 2012 年 10 月 29 日保藏，保藏號(hào)=CGMCC N0.6729。保藏地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。凝結(jié)芽孢桿菌HM-09分離自健康豬腸道中，可有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，改良腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)腸道發(fā)育，增強(qiáng)腸道功能，提高飼料品質(zhì)，促進(jìn)飼料的消化吸收，降低料重比。[0017]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 (Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)V9 于 2011 年11月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,保藏號(hào):CGMCCN0.5470。動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9具有優(yōu)異的抗胃腸道消化液耐受能力；能夠有效拮抗腸道致病菌，提高腸道抗致病菌感染能力；
[0018]有效預(yù)防緩解腹瀉、便秘、腹痛、腹脹等腸應(yīng)激綜合癥。
[0019]有益效果:
[0020]1.本發(fā)明中采用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9混合固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉。凝結(jié)芽孢桿菌腿-09為兼性厭氧菌，而動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9為嚴(yán)格厭氧菌。利用分段接種技術(shù)，混菌發(fā)酵中先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09 —定時(shí)間后，再接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9。發(fā)酵前期凝結(jié)芽孢桿菌HM-09的生長(zhǎng)、增殖及新陳代謝能夠?yàn)閯?dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9的增殖提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及必要的厭氧環(huán)境，更利于動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9生長(zhǎng)的啟動(dòng)，且實(shí)驗(yàn)證明，加入動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9混菌分段發(fā)酵后，凝結(jié)芽孢桿菌HM-09的活菌數(shù)有所增加。
[0021 ] 2.采用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9混合固態(tài)發(fā)酵制備的產(chǎn)品，具有乳酸菌的基本特性，富含乳酸及乙酸等酸味小分子物質(zhì)，賦予產(chǎn)品特有的酸香味，使產(chǎn)品的色澤和口感等感官特征得到改善和多樣化，同時(shí)提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率，增強(qiáng)了產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化吸收率，提高了產(chǎn)品的適口性；同時(shí)具備芽孢菌的耐酸、耐鹽及耐熱等基本特性，使發(fā)酵產(chǎn)品具有良好的實(shí)用性與儲(chǔ)存性。
[0022]3.采用凝結(jié)芽孢桿菌HM-09和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉，可以使豆柏和玉米粉中的蛋白質(zhì)被分解成小肽和游離氨基酸，利于動(dòng)物腸胃的消化吸收；能夠降解豆柏中的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，使得豆柏源性高蛋白飼料的生產(chǎn)及應(yīng)用成為可能。應(yīng)用于動(dòng)物飼養(yǎng)，凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的乳酸可抑制多種有害致病菌，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，有效治療便秘，并能抑制酚、吲哚等有害物質(zhì)，防治細(xì)胞老化。動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9也同時(shí)具有防治便秘、腫瘤防治、保護(hù)肝臟等多種功效。
[0023]4.本發(fā)明采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)成本低，投資的資金較少，在下游處理方便，污染小，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易操作，可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明以豆柏、麩皮、玉米粉為基質(zhì)，以益生菌凝結(jié)芽孢桿菌HM-09 (Bacilluscoagulans)和動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用技術(shù)。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09分類(lèi)名稱(chēng)為Bacilluscoagulans，于2012年10月29日保藏，保藏號(hào):CGMCCN0.6729，保藏地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0026] 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9分類(lèi)名稱(chēng)為Bifidobacteriumanimalissubsp.1actis,于2011年11月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào):CGMCCN0.5470。
[0027]1.菌體的種子液制備
[0028]將凝結(jié)芽孢桿菌HM-09、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9從凍藏的甘油管中分別接入液體
種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0029]所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖 5.0-10.0g, MgSO4.7H200.5-1.0g, K2HPO4L 0-2.0g, MnS0450_100mg，加入IL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2 ;動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20-50g，葡萄糖 20-50g，加水至 1L，ρΗ7.0-7.2。
[0030]所述凝結(jié)芽孢桿菌ΗΜ-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為160-180r/min，溫度為 35-45°C，培養(yǎng) 20-24h ；
[0031]所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為30-38 °C，靜置培養(yǎng)20_24h ；
[0032]2.固態(tài)發(fā)酵
[0033]首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為2-8%(v/w)，控制發(fā)酵溫度32_42°C，濕度70-85%，至pH降至6.5-6.8，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0-5.0%(v/w)，控制發(fā)酵溫度32-37°C， 濕度70-80%，混合培養(yǎng)24_48h。
[0034]所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為豆柏:麩皮:玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在40-75%，pH7.0-7.2，115°C高壓滅菌25min后使用。
[0035]3.活菌數(shù)的測(cè)定
[0036]一般采用平板計(jì)數(shù)法，操作步驟為:稱(chēng)取制備好的發(fā)酵后樣品10g，置于90ml的無(wú)菌生理鹽水中，放置到搖床上震蕩30min，搖勻后用移液槍取Iml的菌液加進(jìn)另一個(gè)9ml的無(wú)菌生理鹽水中，進(jìn)行稀釋?zhuān)凑諊?guó)標(biāo)方法，依次做十倍梯度稀釋。稀釋完后，用移液槍分別取合適的稀釋度Iml打進(jìn)平板，倒入培養(yǎng)基混勻，依次做三個(gè)平行，置于培養(yǎng)箱中在37°C靜置培養(yǎng)48h。
[0037]4.pH值的測(cè)定
[0038]稱(chēng)取IOg發(fā)酵后樣品，放入三角瓶中，加入90ml的蒸餾水。用磁力攪拌器攪拌30min,靜置IOmin后用精密pH計(jì)測(cè)定其pH值。
[0039]5.氨基態(tài)氮含量的測(cè)定
[0040]取IOg發(fā)酵后樣品，用勻漿器破碎，之后與90ml的蒸餾水混合，在4°C冰箱放置I天。樣品離心7000r/min,離心15min。上清液0.8ml置于試管中，然后加3.2ml蒸懼水、2.0ml顯色劑，混勻，放入沸水浴中加熱15min，同時(shí)作空白對(duì)照。然后冷水冷卻，加入
5.0ml40%乙醇溶液混勻,放置15min后用Icm比色杯，以空白管調(diào)零于570nm處測(cè)定A值。
[0041]實(shí)施例1:凝結(jié)芽孢桿菌HM-09益生菌制劑，其制備方法包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0042]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為170r/min，溫度為37。。，培養(yǎng) 24h ；
[0043]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖
6.0g, MgSO4.7Η201.0g, Κ2ΗΡ042.0g, MnS0450mg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ；
[0044]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為豆柏:麩皮:玉米粉=10:8:1，水份含量控制在60%, 115 °C 高壓滅菌 25min。
[0045]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09的接種量分別為2.0% (v/w)、5.0% (v/w)和8.0% (v/w)，培養(yǎng)溫度37°C，濕度70%，單菌固態(tài)發(fā)酵48h后測(cè)其活菌數(shù)及游離氨基態(tài)氮的含量。
[0046]當(dāng)凝結(jié)芽孢桿菌HM-09的接種量分別為2.0% (v/w),5.0% (v/w)和8.0% (v/w)，發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)分別為1.67X 109CFU/g、1.94X 109CFU/g和
1.85X 109CFU/g，游離氨基態(tài)氮的含量分別為 187.9umol/g、224.8umol/g 和 216.2umol/g。
[0047]實(shí)施例2:凝結(jié)芽孢桿菌HM-09益生菌制劑，其制備方法包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0048]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為170r/min，溫度為37。。，培養(yǎng) 24h ；
[0049]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g, MgSO4.7Η201.0g, Κ2ΗΡ042.0g, MnS0450mg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ；
[0050]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為37 °C，靜置培養(yǎng)24h ；
[0051]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，ρΗ7.0-7.2。
[0052]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為豆柏:麩皮:玉米粉=10:8:1，水份含量控制在60%, 115 °C 高壓滅菌 25min。
[0053]首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為2.0% (v/w),培養(yǎng)溫度32°C，濕度70%，至pH降至6.5，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0% (v/w)，控制發(fā)酵溫度35°C，濕度75%，共計(jì)混合培養(yǎng)36h。
[0054]發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)為1.88 X 109CFU/g,動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9活菌數(shù)為3.71X 108CFU/g，游離氨基態(tài)氮的含量為:264.6umol/g。
[0055]實(shí)施例3:凝結(jié)芽孢桿菌HM-09益生菌制劑，其制備方法包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為160r/min，溫度為37°C，培養(yǎng)20h ；
[0056]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨15.0g，酵母膏15.0g，葡萄糖10.0g, MgSO4.7Η201.0g, Κ2ΗΡ042.0g, MnS0450mg，加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ；
[0057]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為37 °C，靜置培養(yǎng)20h ；
[0058]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨50g，葡萄糖20g，加水至1L，ρΗ7.0-7.2。
[0059]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為豆柏:麩皮:玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115 °C高壓滅菌25min。
[0060]首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為5.0% (v/w),培養(yǎng)溫度32°C，濕度70%，至pH降至6.5，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0% (v/w)，控制發(fā)酵溫度35°C，濕度75%，共計(jì)混合培養(yǎng)36h。
[0061]發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)為2.19X 109CFU/g，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9活菌數(shù)為3.71X 108CFU/g，游離氨基態(tài)氮的含量為281.lumol/g。
[0062]實(shí)施例4:凝結(jié)芽孢桿菌HM-09益生菌制劑，其制備方法包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)
酵培養(yǎng)。[0063]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為45。。，培養(yǎng) 24h ；
[0064]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨12.0g，酵母膏12.0g，葡萄糖6.0g, MgSO4.7Η200.5g，Κ2ΗΡ042.0g, MnSO4IOOmg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ；
[0065]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為35 °C，靜置培養(yǎng)24h ；
[0066]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨30g，葡萄糖30g，加水至1L，ρΗ7.0-7.2。
[0067]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為豆柏:麩皮:玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115 °C高壓滅菌25min。
[0068]首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為8.0% (v/w),培養(yǎng)溫度35°C，濕度70%，至pH降至6.5，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0% (v/w)，控制發(fā)酵溫度37°C，濕度75%，共計(jì)混合培養(yǎng)48h。
[0069]發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)為2.34X 109CFU/g，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9活菌數(shù)為4.13X 108CFU/g，游離氨基態(tài)氮的含量為300.7umol/g。
[0070]實(shí)施例5:凝結(jié)芽孢桿菌HM-09益生菌制劑，其制備方法包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)
酵培養(yǎng)。
[0071]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為170r/min，溫度為37。C，培養(yǎng) 24h ；
[0072]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g, MgSO4.7Η201.0g, Κ2ΗΡ042.0g, MnS0450mg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ；
[0073]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為37 °C，靜置培養(yǎng)24h ；
[0074]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，ρΗ7.0-7.2。
[0075]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為:豆柏:麩皮:玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115 °C高壓滅菌25min。
[0076]首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為5.0% (v/w),培養(yǎng)溫度37°C，濕度80%，至pH降至6.5，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0% (v/w)，控制發(fā)酵溫度37°C，濕度80%，共計(jì)混合培養(yǎng)48h。
[0077]發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)為2.90 X 109CFU/g,動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9活菌數(shù)為5.22X 108CFU/g，游離氨基態(tài)氮的含量為；318.2umol/g。
[0078]實(shí)施例6:凝結(jié)芽孢桿菌HM-09益生菌制劑，其制備方法包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)
酵培養(yǎng)。
[0079]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為170r/min，溫度為37。。，培養(yǎng) 24h ；
[0080]凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖
6.0g, MgSO4.7Η201.0g, Κ2ΗΡ042.0g, MnS0450mg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ；
[0081]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為37 °C，靜置培養(yǎng)24h ；
[0082]動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，ρΗ7.0-7.2。[0083]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為豆柏:麩皮:玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115 °C高壓滅菌25min。
[0084]固態(tài)培養(yǎng)基同時(shí)接種接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09與動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量分別為5.0% (v/w)與3.0% (v/w)，控制發(fā)酵溫度370C，濕度70%，共計(jì)混合培養(yǎng)48h。
[0085]發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)為2.08 X 109CFU/g,動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9活菌數(shù)為3.19X 108CFU/g，游離氨基態(tài)氮的含量為；275.6umol/g。[0086]綜合考慮到生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌HM-09制備益生菌制劑的最佳固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)工藝為:首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為5.0 (v/w)，控制發(fā)酵溫度370C，濕度80%，至pH降至6.5，再接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0 (v/w)，控制發(fā)酵溫度37°C，濕度80%，共計(jì)混合培養(yǎng)48h，發(fā)酵結(jié)束后游離氨基態(tài)氮的含量為318.2umol/g°
【權(quán)利要求】
1.一種凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑，所述益生菌制劑由固態(tài)發(fā)酵制備，包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為:首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為2.0-8.0%，控制發(fā)酵溫度32-42 °C，濕度70_85%，至pH降至6.5-6.8，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0-5.0%，控制發(fā)酵溫度32-37°C，濕度70_80%，混合培養(yǎng)24_48h ； 所述接種量單位為體積重量百分比； 所述凝結(jié)芽抱桿菌 HM_09 (Bacilluscoagulans),保藏號(hào):CGMCCN0.6729 ； 所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 (Bifidobacteriumanimalissubsp.1actis),保藏號(hào):CGMCCN0.5470。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑，其特征在于，所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖5.0-10.0g,MgSO4.7Η200.5-1.0g，K2HPO4L 0-2.0g,MnS0450-100mg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ；動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20-50g，葡萄糖20-50g，加水至1L，PH7.0-7.2 ;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為:豆柏:麩皮:玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在 40-75%，pH7.0-7.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑，其特征在于，所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為160-180r/min，溫度為35_45°C，培養(yǎng)20_24h ；所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為30-38°C，靜置培養(yǎng)20-24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑，其制備方法包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)；其特征在于， 首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為5.0%，培養(yǎng)溫度37 °C，濕度80%，至pH降至6.5，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0%，控制發(fā)酵溫度37°C，濕度80%，共計(jì)混合培養(yǎng)48h ； 所述接種量單位為體積重量百分比； 所述凝結(jié)芽孢桿菌腿-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為170r/min，溫度為37。。，培養(yǎng) 24h ； 所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為37°C，靜置培養(yǎng)24h ； 所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO4.7Η201.0g，K2HP042.0g，MnS0450mg，加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ;動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2 ； 所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為:豆柏:麩皮:玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115 °C高壓滅菌25min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑，其特征在于，發(fā)酵制品中凝結(jié)芽孢桿菌HM-09活菌數(shù)為2.90X 109CFU/g，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9活菌數(shù)為5.22X 108CFU/g，游離氨基態(tài)氮的含量為318.2umol/g。
6.權(quán)利要求1-5任一所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，步驟包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為:首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為2.0-8.0%，控制發(fā)酵溫度32-42 °C，濕度70_85%，至pH降至6.5-6.8，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0-5.0%，控制發(fā)酵溫度32-37°C，濕度70_80%，混合培養(yǎng)24_48h ； 所述接種量單位為體積重量百分比；所述凝結(jié)芽抱桿菌 HM_09 (Bacilluscoagulans),保藏號(hào):CGMCCN0.6729 ； 所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9 (Bifidobacteriumanimalissubsp.1actis),保藏號(hào):CGMCCN0.5470。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其特征在于，所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0-15.0g，酵母膏10.0-15.0g，葡萄糖 5.0-10.0g, MgSO4.7Η200.5-1.0g, K2HPO4L 0-2.0g, MnS0450_100mg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2 ;動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20-50g，葡萄糖20-50g，加水至1L，pH7.0-7.2 ;固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為:豆柏:麩皮:玉米粉=10:8-10:0.5-1，水份含量控制在 40-75%, ρΗ7.0-7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其特征在于，所述凝結(jié)芽孢桿菌ΗΜ-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為160-180r/min，溫度為35_45°C，培養(yǎng)20-24h ;所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為30-38°C，靜置培養(yǎng)20_24h。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，包括菌種培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)流化床干燥獲得干燥的培養(yǎng)物，其特征在于，首先接種凝結(jié)芽孢桿菌HM-09，接種量為5.0%，培養(yǎng)溫度37°C，濕度80%，至pH降至6.5，接種動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9，接種量為3.0%，控制發(fā)酵溫度37°C，濕度80%，共計(jì)混合培養(yǎng)48h ； 所述接種量單位為體積重量百分比； 所述凝結(jié)芽孢桿菌腿-09種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為170r/min，溫度為37。。，培養(yǎng) 24h ； 所述動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)條件為37°C，靜置培養(yǎng)24h ； 所述凝結(jié)芽孢桿菌HM-09種子培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖6.0g, MgSO4.7Η201.0g, Κ2ΗΡ042.0g, MnS0450mg,加入 IL 蒸餾水，調(diào)節(jié) pH 至 7.0-7.2 ;動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種V9種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1L，pH7.0-7.2 ； 所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比例組成為:豆柏:麩皮:玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%，115 °C高壓滅菌25min。
10.權(quán)利要求1-5任一所述凝結(jié)芽孢桿菌益生菌制劑在飼料中的應(yīng)用，添加量為50-150 克 / 噸。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK103911326SQ201410122316
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】張善亭, 高鵬飛, 趙樹(shù)平 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古和美科盛生物技術(shù)有限公司