以花柄為外植體的虎眼萬年青離體快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于花卉繁殖方法，具體涉及花卉的無性快速繁殖方法。以虎眼萬年青幼嫩的花柄為外植體，脫分化率及分化率均可達70％～75％以上。由一塊外植體誘導的愈傷組織經反復繼代可分化出300多株叢生芽。叢生芽生根率可達90％以上，在適宜環(huán)境下移栽成活率達95％以上。使虎眼萬年青在相對短的時間內大規(guī)模繁殖出外觀整齊的植株，再生植株變異低；再生體系非常高效；平均單株再生苗的成本極低，適合虎眼萬年青的大批量高效快速繁殖，非常適用于工廠化生產。
【專利說明】以花柄為外植體的虎眼萬年青離體快繁方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于花卉繁殖方法，具體涉及花卉的無性快速繁殖方法。
【背景技術】
[0002]虎眼萬年青，別名海蔥、鳥乳花。是百合科萬年青屬的一種多年生草本植物，原產于非洲南部。鱗莖卵球形，綠色，直徑可達10厘米。葉5-6枚，帶狀或長條狀披針形，長30-60厘米，寬2.5-5厘米，作為一種觀賞花卉也具有很高的觀賞價值。虎眼萬年青中含有虎眼萬年青皂甙(簡稱0SW-1)，經前人在生理活性篩選實驗中發(fā)現(xiàn)其體外抗癌活性比臨床使用的紫杉醇、阿霉素、喜樹堿等抗癌藥物強十倍甚至百倍。而且對正常細胞沒有毒性。從虎眼萬年青中分離出的皂甙0SW-1對肺癌、乳腺癌有明顯的抗癌活性，是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10~100倍。這一驚人發(fā)現(xiàn)將意味著虎眼萬年青有可能取代紫杉醇、阿霉素、喜樹堿等藥物，經濟價值十分巨大。目前虎眼萬年青的繁殖方法主要以分球和播種繁殖為主，雖然較易成活，但是一個成熟種球，每年分球不到10個，繁殖效率很低，播種繁殖出苗率不高，繁殖周期長，大約3年左右，極大地影響了生產效率。植物組織培養(yǎng)即植物離體培養(yǎng)技術，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等)、組織(如形成層、表皮、皮層、胚乳等)或細胞(如大孢子、小孢子、體細胞等)以及原生質體，在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根、形成完整的植株或產生具有經濟價值的其它產品的技術。由植物組織培養(yǎng)所產生的再生植株除了極低的變異外基本都能保持親本(外植體來源植株)的優(yōu)良性狀。植物組織培養(yǎng)技術發(fā)明以來已經取得了很大的進展。利用植物組織培養(yǎng)技術離體快速繁殖虎眼萬年青可以大規(guī)模產生株型統(tǒng)一的植株，快速繁殖虎眼萬年青，進一步滿足國內國際市場的需求。前人所做的虎眼萬年青組織培養(yǎng)實驗雖然已經初步獲得成功，通常采用鱗莖為外植體進行誘導愈傷，由于使用鱗莖為外植體生`葉生根較快，不利于繼代培養(yǎng)，繁殖系數較低。這就限制了虎眼萬年青組織培養(yǎng)技術在實際生產中的應用。而本發(fā)明可使虎眼萬年青在一年以內實現(xiàn)快速繁殖，非常適合工廠化生產。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的是為克服虎眼萬年青的傳統(tǒng)繁殖方法，依靠自然分球繁殖，繁殖速度慢的缺點；克服前人虎眼萬年青組織培養(yǎng)實驗中分化率低、再生系數小、不適合工廠化生產的缺點。提供一種以虎眼萬年青花柄為外植體的離體快速繁殖技術。
[0004]本發(fā)明所采用的技術方案是:
[0005]1.外植體接種及愈傷組織誘導:將虎眼萬年青花絮下端幼嫩的花柄剪斷取下，將幼嫩的花柄放入無菌超凈臺中，用75 % (體積/體積)酒精浸泡I~2分鐘，用0.1~0.2 %(質量/體積)的升汞溶液浸泡5~10分鐘，無菌水沖洗3~5遍。將幼嫩的花柄切為長度3~5mm的小塊，接種在含6-BA2~2.5mg / L、IBA0.1~0.2mg / L、鹿糖3.0~4.5%(質量/體積)，pH值為5.5~6.5的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000Lux。25~30天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化。
[0006]2.不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉接到含NAA(0.1~0.5mg / L) +KT(1.5~
2.5mg / L) +瓊脂(5~7g / L) +3.5~4.5%蔗糖(質量/體積)的MS誘導分化培養(yǎng)基，pH值為5.5~6.5，40~45天繼代一次，20°C~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000LUX。該愈傷分化能力可持續(xù)一年以上，從一塊愈傷經反復繼代可分化出300多株的再生苗。
[0007]3.根的誘導:再生植物轉到I / 2MS+NAA(1~2mg / L) +瓊脂(5~7g / L) +蔗糖2% (質量/體積)，pH值為5.5~6.5的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12小時左右，光照強度1500~2000Lux。
[0008]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3:1:1的種植基質中，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質121°C滅菌30~45分鐘，8~12天燒一次透水便可成活。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:以虎眼萬年青幼嫩的花柄為外植體，脫分化率及分化率均可達70%~75%以上。由一塊外植體誘導的愈傷組織經反復繼代可分化出300多株叢生芽。叢生芽生根率可達90%以上，在適宜環(huán)境下移栽成活率達95%以上。使虎眼萬年青在相對短的時間內大規(guī)模繁殖出外觀整齊的植株，再生植株變異低；再生體系非常高效；平均單株再生苗的成本極低，適合虎眼萬年青的大批量高效快速繁殖，非常適用于工廠化生產。
【具體實施方式】
[0010] 下面將結合實例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明的內容不僅限于以下2個實施例:
[0011]實施例一:
[0012]1.外植體接種及愈傷組織誘導:將虎眼萬年青花絮下端幼嫩的花柄剪斷取下，將幼嫩的花柄放入無菌超凈臺中，用75% (體積/體積)酒精浸泡I分鐘，用0.2% (質量/體積)的升汞溶液浸泡5分鐘，無菌水沖洗5遍。將幼嫩的花柄切為長度3~5mm的小塊，接種在含6-BA2mg / L、IBA0.15mg / L、蔗糖3.5% (質量/體積)，pH值為6.2的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000Lux。25天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化。
[0013]2.不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉接到含NAA(0.15mg / L)+KT(2.0mg / L) +瓊脂(7g / L) +4.0 %蔗糖(質量/體積)的MS誘導分化培養(yǎng)基，pH值為6.1，40天繼代一次，20°C~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000Lux。該愈傷分化能力可持續(xù)一年以上，從一塊愈傷經反復繼代可分化出315株的再生苗。
[0014]3.根的誘導:再生植物轉到I / 2MS+NAA(2mg / L) +瓊脂(6g / L) +蔗糖2% (質量/體積)，PH值為6.0的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12小時左右，光照強度 1500 ~2000Lux。
[0015]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3:1:1的種植基質中，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質121°C滅菌40分鐘，12天澆一次透水便可成活。[0016]實施例二:
[0017]1.外植體接種及愈傷組織誘導:將虎眼萬年青花絮下端幼嫩的花柄剪斷取下，將幼嫩的花柄放入無菌超凈臺中，用75% (體積/體積)酒精浸泡2分鐘，用0.1% (質量/體積)的升汞溶液浸泡10分鐘，無菌水沖洗5遍。將幼嫩的花柄切為長度3~5mm的小塊，接種在含6-BA2.2mg / L、IBA0.1mg / L、蔗糖3.8% (質量/體積)，pH值為5.8的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000Lux。28天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化。
[0018]2.不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉接到含NAA (0.4mg / L)+KT(2.0mg / L) +瓊脂(5g / L)+3.5%蔗糖(質量/體積)的MS誘導分化培養(yǎng)基，pH值為5.5，45天繼代一次，20°C~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000Lux。該愈傷分化能力可持續(xù)一年以上，從一塊愈傷經反復繼代可分化出358株的再生苗。
[0019]3.根的誘導:再生植物轉到I / 2MS+NAA(1.5mg / L) +瓊脂(5g / L) +蔗糖2%(質量/體積)，pH值為5.6的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12小時左右，光照強度1500~2000Lux。
[0020]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3:1:1的種植基質中，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質121°C滅菌35分鐘，10天澆一次透水便可成 活。
【權利要求】
1.以花柄為外植體的虎眼萬年青離體快繁方法，其特征在于包括下列步驟: 1)外植體接種及愈傷組織誘導:將虎眼萬年青花絮下端幼嫩的花柄剪斷取下，將幼嫩的花柄放入無菌超凈臺中，用75% (體積/體積)酒精浸泡I~2分鐘，用0.1~0.2%(質量/體積)的升汞溶液浸泡5~10分鐘，無菌水沖洗3~5遍。將幼嫩的花柄切為長度3~5mm的小塊，接種在含6-BA2~2.5mg / L、IBA0.1~0.2mg / L、鹿糖3.0~4.5%(質量/體積)，pH值為5.5~6.5的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000Lux。25~30天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化。 2)不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉接到含ΝΑΑ(0.1~0.5mg / L)+KT(1.5~，2.5mg / L) +瓊脂(5~7g / L) +3.5~4.5%蔗糖(質量/體積)的MS誘導分化培養(yǎng)基，pH值為5.5~6.5,40~45天繼代一次，20°C~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000LUX。該愈傷分化能力可持續(xù)一年以上，從一塊愈傷經反復繼代可分化出300多株的再生苗。 3)根的誘導:再生植物轉到I/ 2MS+NAA(1~2mg / L) +瓊脂(5~7g / L) +蔗糖2%(質量/體積)，pH值為5.5~6.5的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12小時左右，光照強度1500~2000Lux。 4)再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3: I: I的種植基質中 ，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質121 °C滅菌30~45分鐘，8~12天澆一次透水便可 成活。
【文檔編號】A01H4/00GK103858773SQ201410143767
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權日:2014年4月11日
【發(fā)明者】趙和文, 崔金騰, 張克中, 李月華, 王杰, 陳建梅 申請人:北京農學院