專利名稱：虎眼萬年青活性提取物的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物虎眼萬年青(Ornithogalum Caudatum Ait)的皂苷的提取物的制備方法，以及在治療肝癌、胃癌、肺癌、膽管癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌、直腸癌的抗癌藥用途及抗病毒，抗感染方面的用途。
本發(fā)明使用的虎眼萬年青(Ornithogalum Caudatum Ait)是多年生百合科植物。該植物原產(chǎn)南部非洲，上世紀(jì)中葉自朝鮮傳入中國(guó)東北地區(qū)。民間多有使用虎眼萬年青用于抗炎消毒，治療肝病、肝癌、膽囊炎癥的經(jīng)驗(yàn)。從該屬植物中曾分離得到有抑制淋巴細(xì)胞增生作用的膽甾烷苷類和22-高23降膽甾烷苷類成分，黃芩苷和大黃素價(jià)醚，有豐富的甾體皂苷。今年來研究表明，廣泛存在與動(dòng)物細(xì)胞摸、植物和微生物細(xì)胞壁中的多糖類物質(zhì)能提高機(jī)體免疫功能，它不僅能促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、MΦ細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，還能促進(jìn)細(xì)胞因子的生成。從虎眼萬年青中分離出的皂甙OSW-1對(duì)肺癌、乳腺癌有明顯的抗癌活性。體外抗P338淋巴細(xì)胞白血病活性結(jié)果表明，OSW-1是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍，并已由中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)所鄧邵江合成成功?；⒀廴f年青不同成分進(jìn)行的體外抑瘤實(shí)驗(yàn)證明，虎眼萬年青總皂甙、總多糖和總生物堿均顯示出不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用?；⒀廴f年青多糖抑制腫瘤的實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠體液免、細(xì)胞免疫的實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)客觀的對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的變進(jìn)行的檢驗(yàn)，利用RT-PCR方法檢測(cè)虎眼萬年青多糖系列對(duì)細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-2 mRNA表達(dá)水平的影響，在細(xì)胞和分子水平上虎眼萬年青多糖表現(xiàn)出增強(qiáng)免疫的調(diào)節(jié)作用表明，多糖化合物主要是通過對(duì)免疫功能的較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，從而表現(xiàn)出具有一定的抗衰老、抗病毒和抗腫瘤的作用。研究表明虎眼萬年青多糖系列在促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能的非特異性免疫活性的基礎(chǔ)上，使巨噬細(xì)胞處理和傳遞抗原的能力增強(qiáng)，提高了抗體的水平。同時(shí)虎眼萬年青多糖系列還能增強(qiáng)小鼠T、B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、提高NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性、促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素2(IL-2)。IL-2是促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞的增殖與分化的重要調(diào)節(jié)因子?；⒀廴f年青多糖系列還能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖反應(yīng)的分泌，有利于增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK的殺瘤效應(yīng)。T淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要因素。T淋巴細(xì)胞中輔助性T細(xì)胞CD4和抑制性T細(xì)胞CD8兩個(gè)主要亞群，這兩類細(xì)胞互相變化、調(diào)整可以維持機(jī)體內(nèi)的免疫平衡。CD4具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的活性，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，分泌細(xì)胞因子的作用，而CD8則有免疫抑制和細(xì)胞毒性的作用?；⒀廴f年青多糖系列能不同程度地使CD3、CD4、CD4/CD8生高而使CD8下降，進(jìn)一步證實(shí)了虎眼萬年青多糖系列對(duì)輔助性T細(xì)胞(Th)的增強(qiáng)作用及對(duì)抑制性T細(xì)胞(Ts)的降低作用，推測(cè)輔助性T細(xì)胞(Th)可能是其主要的原發(fā)刺激細(xì)胞。不同虎眼萬年青多糖濃度能在一定程度上促進(jìn)IL-2 mRNA表達(dá)量，從基因水平上有進(jìn)一步證實(shí)了虎眼萬年青多糖系列對(duì)IL-2生成的影響，推斷虎眼萬年青多糖系列有促進(jìn)小鼠免疫功能的作用。參考文獻(xiàn)見“虎眼萬年青多糖對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用”，“中國(guó)免疫學(xué)雜志”2002年第18期，p799-803；“虎眼萬年青多糖增強(qiáng)非特異性免疫和體液免疫的作用”，“吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，第28卷，第三期，2002年，p232-234；OSW-1作用于腫瘤細(xì)胞與其細(xì)胞毒性關(guān)系的構(gòu)效關(guān)系部分機(jī)理解釋OSW-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見下圖 首先，OSW-1分子中的載體核部位是產(chǎn)生其生物活性的主要源泉，其中A/B非極性雙環(huán)平面和A環(huán)上的3βOH羥基的生化活性角色非常重要。其極性與非極性部位的拓?fù)鋵W(xué)特征與腫瘤細(xì)胞膜壁的電子分布“高”“低”密度相匹配。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上細(xì)胞膜的主體組成物質(zhì)膽固醇的結(jié)構(gòu)與OSW-1相似，使OSW-1能夠輕易進(jìn)入到細(xì)胞膜，其中的二糖苷的生物活性角色尚待得到進(jìn)一步的解釋。進(jìn)入細(xì)胞膜后，E-環(huán)氧碳烯離子(E-carbenium ions)成為活性藥效基團(tuán)中間體OSW-1的構(gòu)效學(xué)研究表明，結(jié)合高活性中間體結(jié)構(gòu)物E-環(huán)氧碳烯離子(E-carbenium ions)的生成機(jī)理
經(jīng)過充分的構(gòu)效關(guān)系理論與試驗(yàn)證明，OSW-1在脫掉糖基和水后生成對(duì)應(yīng)有高度細(xì)胞毒性反應(yīng)的活性的中間體E-環(huán)(見圖)。參考文獻(xiàn)見Bioorganic & Medicinal Chemistry，9(1999)419-429；Bioorganic& Medicinal Chemistry，7(1997)633-636。
對(duì)于長(zhǎng)白山區(qū)虎眼萬年青(Ornithogalum Caudatum Ait)專門的化學(xué)成分研究，曾有抑制淋巴細(xì)胞增生作用的膽甾烷苷類多糖被發(fā)現(xiàn)，最近又有三新的甾體物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，它們是(25S，23S，24S)-螺甾-Δ-烯-1β，3β，23，24-四醇-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)[β-D-吡喃木塘基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷是新被發(fā)現(xiàn)的化合物被命名為虎眼萬年青苷。另外兩個(gè)被新分離出的已知化合物為?？略碥赵?3-O-{β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-[β-D-吡喃木塘基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷}；第三個(gè)被新分離出的已知化合物為β-谷甾醇。參考文獻(xiàn)見藥學(xué)學(xué)報(bào)2000，35(1)32～36這三個(gè)新分離出的化合物的結(jié)構(gòu)式為
皂苷，多糖類物質(zhì)等活性成分是虎眼萬年青的主要組成部分。本工藝提取的主要特征是采取D型非極性大孔的方法成功用于虎眼萬年青中皂苷的富集純化。虎眼萬年青皂苷，多糖類物質(zhì)有同于其它皂苷，多糖類物質(zhì)的共同特性就是糖基和苷元與糖基連接成苷后都有較大的極性，一般能溶于水和醇，特別適合大孔樹脂的富集和提純。常規(guī)法用正丁醇萃取而得到粗總皂苷，存在有機(jī)溶劑消耗多，正丁醇沸點(diǎn)較高，溶劑回收困難，萃取易乳化，色素等其它大分子雜質(zhì)去除不完全等缺點(diǎn)。
中國(guó)專利01138727公開了一種用乙醇回流提取的方法，該方法是對(duì)虎眼萬年青總的水溶性物質(zhì)和脂溶性物質(zhì)的提取。在虎眼萬年青的所有有效成分中，正如前面所綜述的，虎眼萬年青總皂苷是最重要的有效部位，尤其是OSW-1、虎眼萬年青皂苷等起著極其重要腫瘤抑制作用。大孔樹脂提取方法首先使皂苷成份得到富集，使之與其它無機(jī)鹽類物質(zhì)、低分子有機(jī)化合物及其它有機(jī)大分子得到分離。它具有選擇性好，吸附量大，解吸容易、機(jī)械強(qiáng)度高、耐污染、流體阻力小、可以反復(fù)使用、再生比較容易等優(yōu)點(diǎn)。
在D型非極性大孔的方法中草藥皂苷的富集純化已有很多成功的案例。如蔡雄等用D101大孔樹脂純化人參總皂苷，純化前人參總皂苷含量為14.9，純化后為60.2％，洗脫率為90％以上。唐弟光用D101大孔樹脂提取三七總皂苷所進(jìn)行的成功的工藝研究，將總皂苷含量8。78％的三七粉末用乙醇提取后，回收乙醇，加水制成0.5克/毫升的(生藥/藥液)溶液，通過D-101大孔吸附樹脂，水洗后用50％乙醇洗滌脫色后，減壓回收乙醇，最后制得三七總皂苷，提取率88％以上，含量91.34％。
虎眼萬年青提取實(shí)施。
因虎眼萬年青中含有的黃芩苷較為易得且含量在易測(cè)出范圍，故以黃芩苷作為虎眼萬年青總皂苷提取標(biāo)志物進(jìn)行定性定量測(cè)定。
儀器與材料日本島津LC-6A液相色譜儀，SPD-6A型紫外檢測(cè)器；SB3200型超聲清洗器；Mettler Ae240型1/10萬電子天平；島津UV-2201PC紫外分光光度計(jì)。
大孔吸附樹脂HPD100，HPD300，HPD400，HPD500，HPD600，HPD700，HPD800由河北滄州寶恩化工有限公司購(gòu)得D-101，LSA-10，LSA20，XDA-1型樹脂由西按藍(lán)深公司購(gòu)得。
對(duì)照品黃芩苷(baicalin)批號(hào)08232004。
色譜條件色譜柱Phenomenex C18(416mm×250mm，5Lm)；流動(dòng)相∶甲醇∶水∶磷酸(50∶50∶0102)；流速018mL min；檢驗(yàn)波長(zhǎng)277nm。
對(duì)照品對(duì)照品黃芩苷溶液制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品82186mg，置100mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。
供試品溶液的置備取提取物同對(duì)照品對(duì)照品黃芩苷溶液制備。
線性關(guān)系考察精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品8910mg，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即可。精密稱取015，110，210，321，421，510mL分別置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。分別精密吸取上述溶液各10LL，注入液相色譜儀，測(cè)定樣品相關(guān)吸收峰，以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方程Y＝0.0106x+158.4r＝0.99998.，線性范圍01203-2103Lg。
測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品與供試液溶液各10LL，注入液相色譜儀。測(cè)定樣品相關(guān)吸收峰。
精密度測(cè)定取同一供試品溶液，連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣5次，計(jì)算黃芩苷峰面積，其RSD＝01368％。
穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，于配制后0，1，2，4，6，24h依法測(cè)定。黃芩苷峰面積RSD＝2869％。
大孔樹脂預(yù)處理以95％乙醇溶液浸泡樹脂24h，充分膨脹后裝入層系析柱中，用95％乙醇洗脫，直到流出液在試管中加水稀釋不渾濁為止，再用蒸餾水沖至無乙醇狀態(tài)，備用。
適用樹脂的篩選采用靜態(tài)吸附法，采用測(cè)定吸附殘液和解吸液的指標(biāo)成分濃度篩選最合適的樹脂。量取大孔型樹脂40mL置錐型瓶中，分別加入濃度為0.5g/mL上柱樣品液，浸漬24h(每隔8h振搖一次)，濾過。100mL蒸餾水洗滌樹脂，洗滌液與濾液合并，測(cè)定吸附殘液中的指標(biāo)成分濃度評(píng)價(jià)吸附效果。向樹脂中加入60％乙醇，浸漬24h(沒隔8h振搖一次)，濾過。用乙醇50mL洗滌樹脂，洗滌液與濾液合并作為樣品溶液測(cè)定解吸液中的指標(biāo)成分濃度，評(píng)價(jià)解吸效果。結(jié)果見表1表1不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)黃芩苷的靜態(tài)吸附和解吸效果
表1顯示，HPD300、D101樹脂對(duì)黃芩的吸附量最高，因此都可作為虎眼萬年青工藝的適用樹脂型號(hào)。
乙醇洗脫濃度的確定稱取少于層吸柱中HPD300型樹脂吸附量的虎眼萬年青生藥提取液Ot1適量，加到裝有HPD300型樹脂的層吸柱上，先用水洗，然后依次用10％，30％，60％，75％，95％乙醇溶液進(jìn)行梯度解吸，分段收集吸液。測(cè)定解吸液中的指標(biāo)成分濃度，繪制解吸曲線。發(fā)現(xiàn)采用10％，30％，60％乙醇梯度洗脫，解吸液中都有較高的黃芩苷含量，表明可以用10％，30％，60％乙醇梯度洗脫達(dá)到回收洗脫解吸的所有虎眼萬年青皂苷的目的。
具體實(shí)施案例取100千克虎眼萬年青鮮品，洗凈，首先分別用2倍量80％與20％的乙醇各回流提取一次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，回收乙醇，濾液繼續(xù)濃縮至生藥量達(dá)到0.5g/mL。選用D101大孔樹脂100千克做預(yù)處理以95％乙醇溶液浸泡樹脂24h，充分膨脹后裝入層系析柱中，用95％乙醇洗脫，直到流出液在試管中加水稀釋不渾濁為止，再用蒸餾水沖至無乙醇狀態(tài)，備用。將濃縮好的濾液以每小時(shí)兩倍量樹脂體積(2BV，下同)速度上于已準(zhǔn)備好的D101大孔樹脂柱。用4BV蒸餾水洗至五色。再用2，4，6BV70％的乙醇洗脫。收集洗脫液濃縮除去乙醇，濃縮液做噴物干燥得干粉0.9503千克。
虎眼萬年青大孔樹脂提取物抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究目的探討虎眼萬年青(Ornithogalum Caudatum Ait)提取物對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
方法采用腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，觀察虎眼萬年青(OrnithogalumCaudatum Ait)提取物組(Op1，Op2，Op3，Od1，Od2，Od3)對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株(Q3)人胃癌細(xì)胞株(M GC2803)、人宮頸癌細(xì)胞株(Hela)、小鼠肺腺瘤細(xì)胞株(SPC2A21)細(xì)胞存活及蛋白合成影響。以大鼠肝細(xì)胞(BRL)為正常對(duì)照細(xì)胞株，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照及溶劑對(duì)照。受試物與細(xì)胞共培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞存活量及活細(xì)胞蛋白含量的變化。采用系統(tǒng)定性測(cè)試方法，對(duì)虎眼萬年青(Ornithogalum Caudatum Ait)提取物抗癌活性進(jìn)行測(cè)定。
蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Lowry法，參照《中國(guó)生物制品規(guī)程》。測(cè)定MAO-B活性，以芐胺為MAO-B酶反應(yīng)基質(zhì)，在一定條件下加入酶液，氧化生成芐醛，用過氯酸終止反應(yīng)，加入環(huán)烷提取單胺氧化產(chǎn)物，在242nm下測(cè)定O.D值，計(jì)算MAO-B的含量。
MAO-B活性單位/mg(蛋白)/hr＝O.D/mg×0.8538×100。
O.DMAO-B樣品測(cè)定光密度值。
0.8583校正因子(蛋白測(cè)定與MAO測(cè)定體積比)。
結(jié)果見表2表2對(duì)老齡大鼠腦細(xì)胞線粒體MAO-B活性的影響
老年組與成年組比較，*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001各劑量組、陽性藥物對(duì)照組與老年組比較。
表中結(jié)果表明，老年大鼠腦細(xì)胞MAO-B活性與成年組大鼠比較有明顯提高(P＜0.001)，而本藥物組合物顆粒制劑11.25g/kg、3.75g/kg可顯著降低老齡大鼠腦細(xì)胞MAO-B活性(P＜0.05、P＜0.01)，與陽性藥物對(duì)照組MAO-B活性改變相一致，提示該品具有延緩衰老的作用。
權(quán)利要求
1.一種虎眼萬年青(Ornithogalum Caudatum Ait)皂苷提取物以至少含有下列物質(zhì)為主要特征萬年青苷A、B(rhodexin A，B)，鈴蘭毒苷(convallatoxin)，肥皂草苷(saponarin)，黃芩苷，腺嘌呤核苷，胡蘿卜甙，豆甾醇3-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷，山奈酚3-O-β-D-葡萄糖苷，蘆丁，山奈酚3-O-β-蕓香糖苷，(25S，23S，24S)-螺甾-Δ-烯-1β，3β，23，24-四醇-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)[β-D-吡喃木塘基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，?？略碥赵?3-O-{β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-[β-D-吡喃木塘基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷。
2.權(quán)利要求一中所述提取物的制備工藝，其特征在于首先以下面方式的任何一種進(jìn)行預(yù)加工處理a)將虎眼萬年青鮮品洗凈干燥脫水至半干或全干，用0-95％的乙醇水溶液加熱提取數(shù)次，合并提取液，減壓濃縮，過濾除掉不溶物，得濃縮提取液O1；b)將虎眼萬年青鮮品洗凈切碎，用0-95％的乙醇水溶液加熱提取數(shù)次，合并提取液，減壓濃縮除去乙醇，過濾除掉不溶物，得濃縮提取液O2；c)將虎眼萬年青鮮品洗凈后高效粉碎以進(jìn)行鮮汁與固體物質(zhì)分離，過濾得濾液L1，藥渣用0-95％的乙醇水溶液加熱提取數(shù)次，合并提取液，減壓濃縮，過濾除掉不溶物得濾液L2，濾液L1與濾液L2合并得提取液O3。
3.權(quán)利要求將二中所提到的提取液O1、O2與O3的任何一種，通過大孔吸附樹脂柱，大孔吸附樹脂的孔徑類型為6～26nm，比表面積為250～1200m2/g，粒徑0.3～1.25nm。
4.權(quán)利要求大孔吸附樹脂洗脫液，采用10-95％的乙醇多次洗脫。對(duì)通過大孔吸附樹脂的權(quán)利二、三中提到的O1、O2與O3的任何一種所通過的吸附柱進(jìn)行洗脫。洗脫液各合并后減壓濃縮去除乙醇，濃縮后的流出液Ot1、Ot2與Ot3。
5.權(quán)利要求對(duì)權(quán)利四中的Ot1、Ot2與Ot3進(jìn)行噴物干燥得噴霧粉Op1、Op2與Op3。
6.權(quán)利要求對(duì)權(quán)利四中的Ot1、Ot2與Ot3進(jìn)行低溫真空凍干干燥得凍干粉Od1、Od2與Od3。
7.權(quán)利要求對(duì)五、六中得到的任何一種提取粉Op1、Op2、Op3、Od1、Od2與Od3均有可用于治療肝癌的藥物的用途。
8.權(quán)利要求對(duì)五、六中得到的任何一種提取粉Op1、Op2、Op3、Od1、Od2與Od3均有可用于治療胃癌的藥物的用途。
9.權(quán)利要求對(duì)五、六中得到的任何一種提取粉Op1、Op2、Op3、Od1、Od2與Od3均有可用于治療肺癌的藥物的用途。
10.權(quán)利要求對(duì)五、六中得到的任何一種提取粉Op1、Op2、Op3、Od1、Od2與Od3均有可用于治療膽管癌的藥物的用途。
11.權(quán)利要求對(duì)五、六中得到的任何一種提取粉Op1、Op2、Op3、Od1、Od2與Od3均有可用于治療婦科癌如乳腺癌、卵巢癌的藥物的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求七至十一中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述虎眼萬年青的提取物的給藥途徑包括口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉。
13.根據(jù)權(quán)利要求七至十二中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述虎眼萬年青的提取物制成膠囊劑、片劑時(shí)口服用量為2～800mg/kg體重/次。制成注射劑時(shí)的用量是2～500mg/kg體重/次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用大孔樹脂提取虎眼萬年青(Ornithogalum Caudatum Ait)皂苷的制備方法，以及其在制備治療肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等癌病藥物中的應(yīng)用。這種提取物的生產(chǎn)工藝方便、簡(jiǎn)單、實(shí)際可行，能最有效地獲得虎眼萬年青中極有抗癌潛力的皂苷有效部位。為肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、等癌病的治療發(fā)現(xiàn)新的高效低毒的天然治療藥物，具有重要的社會(huì)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1864725SQ20051006927
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2005年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月16日
發(fā)明者呂新波, 陸直, 殷允錄 申請(qǐng)人:李 東, 吉林天力泰藥業(yè)有限公司, 呂新波