以幼花為外植體的虎眼萬年青離體快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于花卉繁殖方法，具體涉及花卉的無性快速繁殖方法。以虎眼萬年青幼花序的幼花基部為外植體進行組織培養(yǎng)，脫分化率及分化率均可達75％以上。由一塊外植體誘導的愈傷組織經(jīng)反復(fù)繼代可分化出500株左右叢生芽，叢生芽表型統(tǒng)一。叢生芽生根率可達90％以上，在適宜環(huán)境下移栽成活率達100％。使虎眼萬年青在相對短的時間內(nèi)大規(guī)模繁殖出遺傳背景完全相同、外觀整齊的植株，再生植株變異低；再生體系非常高效；平均單株再生苗的成本極低，適合虎眼萬年青的大批量高效快速繁殖，非常適用于工廠化生產(chǎn)。
【專利說明】以幼花為外植體的虎眼萬年青離體快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于花卉繁殖方法，具體涉及花卉的無性快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]虎眼萬年青，別名海蔥、鳥乳花。是百合科萬年青屬的一種多年生草本植物，原產(chǎn)于非洲南部。鱗莖卵球形，綠色，直徑可達10厘米。葉5-6枚，帶狀或長條狀披針形，長30-60厘米，寬2.5-5厘米。早在70年代，虎眼萬年青以一種觀賞植物引進中國，并在海南、西安、長白山試栽。經(jīng)眾多學者實驗研究后發(fā)現(xiàn)，從虎眼萬年青中分離到虎眼萬年青皂甙(簡稱0SW-1)。在生理活性篩選實驗中，發(fā)現(xiàn):“0SW-1”體外抗癌活性比臨床使用的紫杉醇、阿霉素、喜樹堿等抗癌藥物強十倍甚至百倍。而且對正常細胞沒有毒性。從虎眼萬年青中分離出的皂甙0SW-1對肺癌、乳腺癌有明顯的抗癌活性，是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10~100倍。這一驚人發(fā)現(xiàn)將意味著虎眼萬年青有可能取代紫杉醇、阿霉素、喜樹堿等藥物，經(jīng)濟價值十分巨大，同時作為一種觀賞花卉也具有很高的觀賞價值。目前虎眼萬年青的繁殖方法主要以分球和播種繁殖為主，雖然較易成活，但是一個成熟種球，每年分球不到10個，繁殖效率很低，播種繁殖出苗率不高，繁殖周期長，大約3年左右，極大地影響了生產(chǎn)效率。植物組織培養(yǎng)即植物離體培養(yǎng)技術(shù)，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等)、組織(如形成層、表皮、皮層、胚乳等)或細胞(如大孢子、小孢子、體細胞等)以及原生質(zhì)體，在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根、形成完整的植株或產(chǎn)生具有經(jīng)濟價值的其它產(chǎn)品的技術(shù)。由植物組織培養(yǎng)所產(chǎn)生的再生植株除了極低的變異外基本都能保持親本(外植體來源植株)的優(yōu)良性狀。植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)明以來已經(jīng)取得了很大的進展。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)離體快速繁殖虎眼萬年青可以大規(guī)模產(chǎn)生株型統(tǒng)一的植株，快速繁殖虎眼萬年青，進一步滿足國內(nèi)國際市場的需求。前人所做的虎眼萬年青組織培養(yǎng)實驗雖然已經(jīng)初步獲得成功，通常采用鱗莖為外植體進行誘導愈傷，由于使用鱗莖為外植體生葉生根較快，不利于繼代培養(yǎng)，繁殖系數(shù)較低。這就限制了虎眼萬年青組織培養(yǎng)技術(shù)在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。而本發(fā)明可使虎眼萬年青在一年以內(nèi)實現(xiàn)快速繁殖。一塊外植體可再生出500株左右的再生植株，非常適合工廠化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為克服虎眼萬年青的傳統(tǒng)繁殖方法，依靠自然分球繁殖，繁殖速度慢的缺點；克服前人虎眼萬年青組織培養(yǎng)實驗中再生率低、再生周期長、不適合工廠化生產(chǎn)的缺點。提供一種虎眼萬年青無性快速繁殖方法，使虎眼萬年青在相對短的時間內(nèi)大量產(chǎn)生遺傳背景完全相同、株型一致的再生植株。
[0004]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0005]1.外植體接種及愈傷組織誘導:將幼花序花苞從子房下端剪開取下，將完整的花苞放入無菌超凈臺中，用75 % (體積/體積)酒精浸泡60~90秒，用0.1~0.2 % (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡8~10分鐘，無菌水沖洗3~5遍。將花苞從子房上部切開，然后將花苞上部大部分切掉，剩余部分縱切一刀或兩刀，接種在含6-BA1.5~2.0mg/L、ΝΑΑ0.1~
0.2mg/L、蔗糖3.0~4.5% (質(zhì)量/體積)，pH值為5.5~6.5的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000LUX。25~35天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化。
[0006]2.不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉(zhuǎn)接到誘導分化培養(yǎng)基:MS+6_BA(1~1.5mg/L) +2，4-D (I~2mg/L) +3.5~4.5 %蔗糖(質(zhì)量/體積)，pH值為5.5~6.5，40~50天繼代一次，20°C~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000Lux。該愈傷分化能力可持續(xù)一年以上，從一塊愈傷經(jīng)反復(fù)繼代可分化出500株左右的再生苗。
[0007]3.根的誘導:再生植物轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA (0.5~2mg/L) +蔗糖2 % (質(zhì)量/體積)，pH值為5.5~6.5的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12~14小時，光照強度1500 ~2000Lux。
[0008]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3:1:1的種植基質(zhì)中，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質(zhì)121°C滅菌30~45分鐘，10~15天燒一次透水便可成活。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:以虎眼萬年青幼花序的幼花基部為外植體，脫分化率及分化率均可達75%以上。由一塊外植體誘導的愈傷組織經(jīng)反復(fù)繼代可分化出500株左右叢生芽，叢生芽表型統(tǒng)一。叢生芽生根率可達90%以上，在適宜環(huán)境下移栽成活率達100%。使虎眼萬年青在相對短的時間內(nèi)大規(guī)模繁殖出遺傳背景完全相同、外觀整齊的植株，再生植株變異低；再生體系非常高效；平均單株再生苗的成本極低，適合虎眼萬年青的大批量高效快速繁殖，非常適用于工廠化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0010]下面將結(jié)合實例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于以下2個實施例:
[0011]實施例一:
[0012]1.外植體接種及愈傷組織誘導:當花苞大小已經(jīng)或接近發(fā)育完全但仍為綠色，將幼花序上的花苞從子房下端剪開取下，將完整的花苞放入無菌超凈臺中，用75 % (體積/體積)酒精浸泡60秒，用0.1 (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡10分鐘，無菌水沖洗5遍。將花苞從子房上部切開，然后將花苞上部大部分切掉，剩余部分縱切兩刀，接種在含6-BA2.0mg/L、NAA0.lmg/L、蔗糖4% (質(zhì)量/體積)，pH值為6.2的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000LUX。25~35天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化。
[0013] 2.不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉(zhuǎn)接到誘導分化培養(yǎng)基:MS+6-BA(1.5mg/L) +2，4-D (1.5mg/L) +3.5%蔗糖(質(zhì)量/體積)，pH值為6.0，40~50天繼代一次，20。。~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000LUX。從一塊愈傷經(jīng)反復(fù)繼代可分化出500株左右的再生苗。
[0014]3.根的誘導:再生植物轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA(1.5mg/L) +蔗糖2% (質(zhì)量/體積)，pH值為5.8的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12~14小時，光照強度1500~2000Luxo
[0015]4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3:1:1的種植基質(zhì)中，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質(zhì)121°C滅菌45分鐘，10~15天澆一次透水便可成活。
[0016]實施例二:
[0017]1.外植體接種及愈傷組織誘導:當花苞大小已經(jīng)或接近發(fā)育完全但仍為綠色，將幼花序上的花苞從子房下端剪開取下，將完整的花苞放入無菌超凈臺中，用75 % (體積/體積)酒精浸泡90秒，用0.2% (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡8分鐘，無菌水沖洗5遍。將花苞從子房上部切開，然后將花苞上部大部分切掉，剩余部分縱切一刀，接種在含6-BA1.5mg/L、NAA0.15mg/L、蔗糖3.5% (質(zhì)量/體積)，pH值為5.9的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000LUX。25~35天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化。
[0018]2.不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉(zhuǎn)接到誘導分化培養(yǎng)基:MS+6-BA(lmg/L)+2，4-D (lmg/L) +3.8%蔗糖(質(zhì)量/體積)，pH值為6.5，40~50天繼代一次，20°C~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000Lux。從一塊愈傷經(jīng)反復(fù)繼代可分化出500
株左右的再生苗。
[0019]3.根的誘導:再生植物轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA(0.5mg/L) +蔗糖2% (質(zhì)量/體積)，pH值為6.2的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12~14小時，光照強度1500~2000Luxo
[0020] 4.再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3:1:1的種植基質(zhì)中，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質(zhì)121°C滅菌30~45分鐘，10~15天燒一次透水便可成活。
【權(quán)利要求】
1.以幼花為外植體的虎眼萬年青離體快繁方法，其特征在于包括下列步驟: 1)外植體接種及愈傷組織誘導:將幼花序花苞從子房下端剪開取下，將完整的花苞放入無菌超凈臺中，用75 % (體積/體積)酒精浸泡60~90秒，用0.1~0.2 % (質(zhì)量/體積)的升汞溶液浸泡8~10分鐘，無菌水沖洗3~5遍。將花苞從子房上部切開，然后將花苞上部大部分切掉，剩余部分縱切一刀或兩刀，接種在含6-BA1.5~2.0mg/L、ΝΑΑ0.1~0.211^/1、蔗糖3.0~4.5% (質(zhì)量/體積)，pH值為5.5~6.5的MS培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈照射4~6小時，光照強度1500~2000LUX。25~35天繼代一次，待長出黃綠色愈傷時即便可誘導分化； 2)不定芽的誘導:將黃綠色的愈傷轉(zhuǎn)接到誘導分化培養(yǎng)基:MS+6-BA(l~1.5mg/L)+2,4-D(l~2mg/L)+3.5~4.5%蔗糖(質(zhì)量/體積)，pH值為5.5~6.5，40~50天繼代一次，20°C~30°C每天日光燈光照8~10小時，光照強度1500~2000Lux。該愈傷分化能力可持續(xù)一年以上，從一塊愈傷經(jīng)反復(fù)繼代可分化出500株左右的再生苗； 3)根的誘導:再生植物轉(zhuǎn)到1/2MS+NAA(0.5~2mg/L) +蔗糖2 % (質(zhì)量/體積)，pH值為5.5~6.5的生根培養(yǎng)基上，20°C~30°C每天日光燈光照12~14小時，光照強度1500~2000Lux ； 4)再生植株移栽:植株生根后即可移栽，移栽至草炭:蛭石:細沙=3: I: I的種植基質(zhì)中，移栽前將植株上的瓊脂等雜物沖洗干凈，種植基質(zhì)121°C滅菌30~45分鐘，10~15天燒一次透水便可成活。
【文檔編號】A01H4/00GK103931498SQ201410143770
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】崔金騰, 張克中, 李月華, 王杰, 田娜 申請人:北京農(nóng)學院