一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘監(jiān)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：取甘藍(lán)型油菜幼苗的下胚軸，以下胚軸的下端為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；利用攜帶目的基因的農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體，然后進(jìn)行共培養(yǎng)；共培養(yǎng)后的外植體在含選擇劑的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生成抗性不定芽；進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得抗性苗。本發(fā)明因以甘藍(lán)型油菜下胚軸的下端為外植體，且使用了最適于甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)條件，特別是共培養(yǎng)基中的pH值和兩種高低濃度草甘膦分化篩選方式，成功獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植株，并與現(xiàn)有技術(shù)相比具有更高的抗性苗分化率，建立了一個(gè)高效的抗草甘膦的甘藍(lán)型油菜再生體系，為研究甘藍(lán)型油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以油菜下胚軸為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于植物組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]油菜是一種重要的油料作物，廣泛種植于中國(guó)、印度、加拿大和歐洲等地，且在全球油料作物產(chǎn)量中排名第三。1974年Kartha等人首次從油菜的莖切段誘導(dǎo)培養(yǎng)出小植株。此后，人們依據(jù)細(xì)胞全能性原理，利用油菜的不同外植體類(lèi)型誘導(dǎo)出愈傷組織，并獲得再生植株，如油菜的莖、子葉、葉片、小孢子、莖尖、下胚軸、根和原生質(zhì)體等。油菜再生體系的建立是其遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，油菜外植體的再生頻率降低，將造成其遺傳轉(zhuǎn)化效率的降低，因此建立一個(gè)高效的油菜再生體系是保證轉(zhuǎn)基因油菜遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。
[0003]有研究表明，油菜植株的高效再生與外植體的類(lèi)型有著密切關(guān)系，不同油菜外植體的再生頻率及轉(zhuǎn)化效率不相同。其中利用無(wú)菌苗下胚軸作為起始外植體建立的再生體系，與其他外植體類(lèi) 型相比，具有再生周期短、再生能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高，分化芽質(zhì)量好、易被農(nóng)桿菌感染和轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，因此下胚軸成為油菜再生和轉(zhuǎn)化體系的首選外植體類(lèi)型。
[0004]近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，油菜下胚軸的分化存在極性，再生頻率、轉(zhuǎn)化效率與下胚軸的部位有關(guān)。在目前已公開(kāi)的油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，大部分研究只考慮使用下胚軸作為外植體，很少研究下胚軸的分化極性對(duì)其再生頻率和轉(zhuǎn)化效率的影響。此外，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化受諸多因素的影響，在共培養(yǎng)階段農(nóng)桿菌Vir區(qū)控制著帶有目的基因T-DNA的轉(zhuǎn)移，除了酚類(lèi)化合物能夠活化Vir區(qū)基因，pH值對(duì)Vir區(qū)基因也有明顯的誘導(dǎo)作用。合適的共培養(yǎng)基PH值有利于提高抗性芽苗分化率，促進(jìn)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。
[0005]目前的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)普遍存在抗性苗分化率低，目的基因轉(zhuǎn)化效率差的現(xiàn)狀，如何能夠建立高效地轉(zhuǎn)化體系，提高抗性苗的分化率，是油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)重要研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，建立完整的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗草甘膦甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高再生體系的分化效率。
[0007]—種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
[0008](I)取甘藍(lán)型油菜幼苗的下胚軸，以下胚軸的下端為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；
[0009]所述下胚軸的下端為下胚軸靠近胚根的長(zhǎng)0.5~Icm的部分；所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L 蔗糖，pH 為 5.8 ;
[0010](2)利用攜帶抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體，然后進(jìn)行共培養(yǎng)；
[0011]所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH在5.0~5.4之間；
[0012](3)將共培養(yǎng)后的外植體,在含低濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基I上篩選培養(yǎng)10天,再接種到含高濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基II上，誘導(dǎo)生成抗性不定芽；
[0013]所述分化培養(yǎng)基I 為:MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/L AgN03+250mg/LTim+4.5mg/L 草甘勝，pH 為 5.8 ;
[0014]所述分化培養(yǎng)基II 為:MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/LAgN03+250mg/LTim+9.0mg/L 草甘勝，pH 為 5.8 ;
[0015](4)進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得抗性苗。 [0016]所述甘藍(lán)型油菜幼苗的培養(yǎng)方法包括:將油菜種子消毒后平鋪在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)直至獲得幼苗，所述同體培養(yǎng)基為:1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L瓊脂，pH為5.8。
[0017]所述農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體包括:制備侵染液，將愈傷化的外植體浸入侵染液中，取出后吹干。
[0018]所述愈傷化的外植體浸入侵染液的時(shí)間為3~10分鐘。
[0019]所述侵染液制備方法包括:
[0020](I)農(nóng)桿菌的活化；
[0021](2)將活化后的農(nóng)桿菌接入液體培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)液0D_值達(dá)到0.8~I時(shí)，分離獲得農(nóng)桿菌；
[0022](3)將分離得到的農(nóng)桿菌混入l/5MS+15g/L蔗糖的培養(yǎng)液中，懸浮制得侵染液。
[0023]所述液體培養(yǎng)基為:YEB+12mg/L四環(huán)素+50mg/L卡那霉素。
[0024]所述生根培養(yǎng)包括:當(dāng)抗性不定芽長(zhǎng)至3~5cm時(shí)，從基部切去愈傷組織，將抗性不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中。
[0025]所述生根培養(yǎng)基為:MS+0.2mg/L NAA+4.5mg/L草甘膦，pH為5.8。
[0026]當(dāng)抗性苗形成完整根系后，開(kāi)瓶煉苗天，取出抗性苗移入1/5MS培養(yǎng)液中，水培I周后，移栽到有機(jī)質(zhì)培養(yǎng)土中。
[0027]所述抗草甘膦基因GI號(hào)為:8469109。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0029]本發(fā)明因以甘藍(lán)型油菜下胚軸的下端為外植體，且在組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用了最適于甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)條件，特別是共培養(yǎng)基中的PH值和兩種高低濃度草甘膦的分化篩選方式，成功的獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植株，并與現(xiàn)有技術(shù)相比具有更高的抗性苗分化率，能夠建立一個(gè)高效的抗草甘膦的甘藍(lán)型油菜再生體系，為研究甘藍(lán)型油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)了油菜基因工程技術(shù)的發(fā)展。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為以甘藍(lán)型油菜下胚軸上端為外植體獲得的抗性芽苗生長(zhǎng)情況。
[0031]圖2為以甘藍(lán)型油菜下胚軸下端為外植體獲得的抗性芽苗生長(zhǎng)情況。
[0032]圖3為在共培養(yǎng)基的不同pH值條件下獲得的抗性芽苗的生長(zhǎng)情況；
[0033]A:pH5.0 ；B:pH5.2 ；C:pH5.4 ；D:pH5.8。
[0034]圖4為共培養(yǎng)的暗培養(yǎng)階段。
[0035]圖5為抗性植株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)；
[0036]M:DNA Marker ；1:陽(yáng)性對(duì)照；2~9:抗性植株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?！揪唧w實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1
[0038](I)挑選適量籽粒飽滿(mǎn)的“浙大619”甘藍(lán)型油菜種子，在75%的酒精中清洗30s，傾倒出酒精后，加入25mL左右的5%次氯酸鈉溶液消毒15min，同時(shí)震蕩，使消毒液和油菜種子充分接觸，倒出次氯酸鈉溶液后，無(wú)菌水沖洗4~5遍，然后將消毒好的種子均勻地平鋪在含有同體培養(yǎng)基的瓶子中。
[0039](2)固體培養(yǎng)基為1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L瓊脂，pH為5.8。每瓶同體培養(yǎng)基大約播種24粒種子，在25~27°C、光照16h、黑暗8h和光照強(qiáng)度為70 μ Hi0InT2iT1的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0040](3)無(wú)菌苗培養(yǎng)8d時(shí)，在超凈工作臺(tái)上分別切取油菜幼苗下胚軸上端和下端作為外植體，接種到預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)皿上，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH為
5.8，在26土 1°C、光照16h、黑暗8h和適宜的光照強(qiáng)度條件下，預(yù)培養(yǎng)3d，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。
[0041](4)將預(yù)培養(yǎng)后的下胚軸上端和下端分別接種到不含選擇劑的分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為 MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/LAgN03.pH5.8，且每 IOd 繼代培養(yǎng)次。
[0042](5)取浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院基因工程改良實(shí)驗(yàn)室提供的帶有抗草甘膦基因GlO (GI =8469109)的農(nóng)桿菌LBA4404置于_80°C條件下保存。利用接種針沾取少量農(nóng)桿菌菌液，解凍后劃平板于YEB+12mg/L四環(huán)素(Tet)+50mg/L卡那霉素(Kan)+4.8g/L進(jìn)口瓊脂的同體培養(yǎng)基上，27°C，200rpm的恒溫?fù)u床中暗培養(yǎng)2d后，挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于20mL的YEB+12mg/L Tet+50mg/L Kan (不含瓊脂)的液體培養(yǎng)基中，27°C，200rpm恒溫?fù)u床中暗培養(yǎng)過(guò)夜。
[0043](6)用分光光度計(jì)測(cè)定農(nóng)桿菌菌液濃度，當(dāng)OD6tltl值達(dá)到0.8~I左右時(shí)，將20mL的農(nóng)桿菌菌液移入20mL已滅菌的離心管中，5000rpm離心5min,然后用已滅菌的l/5MS+15g/L蔗糖溶液懸浮農(nóng)桿菌，制備侵染液。
[0044](7)獲取步驟(3)中預(yù)培養(yǎng)3d的愈傷化的下胚軸下端，將其接種到步驟(6)的制備好的農(nóng)桿菌侵染液中，侵染5min中后(侵染過(guò)程中可以輕微震蕩)倒出菌液，將侵染后的下胚軸下端在超凈工作臺(tái)上吹成半干狀態(tài)。
[0045](8)將上述侵染后的愈傷化下胚軸下端接種到鋪有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基上，27°C暗培養(yǎng)2d，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分為MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，以通常使用的pH值為5.8的共培養(yǎng)基為對(duì)照，增加pH值為5.0,5.2和5.4的三種處理，其余實(shí)驗(yàn)步驟不變。
[0046](9)愈傷化的下胚軸下端共培養(yǎng)后，用無(wú)菌水洗滌2~3次進(jìn)行脫菌，然后在含低濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基I上篩選培養(yǎng)10天，再接種到含高濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基II上，誘導(dǎo)生成抗性不定芽；分化培養(yǎng)基I為:MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/L AgN03+250mg/L Tim+4.5mg/L 草甘膦，pH 為 5.8 ;分化培養(yǎng)基 II 為:MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/LAgN03+250mg/L Tim+9.0mg/L 草甘膦，pH 為 5.8 ;且每 IOd 繼代培養(yǎng)一次。
[0047] (10)當(dāng)下胚軸下端再生的抗性不定芽在含有草甘膦選擇劑的分化培養(yǎng)基上長(zhǎng)到3~5cm時(shí)，從基部切去愈傷組織后，將再生的抗性不定芽轉(zhuǎn)移到瓶子中的生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L NAA+4.5mg/L草甘膦，pH為5.8。[0048](11)抗性苗形成完整根系后，開(kāi)瓶煉苗一天，取出抗性幼苗移入含有1/5MS溶液的玻璃瓶中，在光照培養(yǎng)箱中光照16h，溫度26± I°C，黑暗8h，20°C水培I周后，移栽到有機(jī)質(zhì)培養(yǎng)土中，繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至獲得抗性植株。
[0049](12)根據(jù)已知的抗草甘膦目的基因序列，設(shè)計(jì)目的基因部分序列的引物，引物序列如下:
[0050]引物F: 5' -AGCACAGCCATCCAAGAACTA-' 3 (N0.303Tm:57.5 °C )
[0051 ]引物 R: 5' -AGAGGACCGAGGAACATAAGG-' 3 (N0.782Tm:57.6 °C )
[0052](13)從抗性植株中提取DNA，并以引物序列為模板，建立PCR反應(yīng)體系:
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取甘藍(lán)型油菜幼苗的下胚軸，以下胚軸的下端為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； 所述下胚軸的下端為下胚軸靠近胚根的長(zhǎng)0.5~Icm的部分；所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L 蔗糖，pH 為 5.8 ; (2)利用攜帶抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體，然后進(jìn)行共培養(yǎng)； 所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH在5.0~5.4之間; (3)將共培養(yǎng)后的外植體，在含低濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基I上篩選培養(yǎng)10天，再接種到含高濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基II上，誘導(dǎo)生成抗性不定芽； 所述分化培養(yǎng)基 I 為:MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgN03+250mg/LTim+4.5mg/L 草甘勝，pH 為 5.8 ; 所述分化培養(yǎng)基 II 為:MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgN03+250mg/LTim+9.0mg/L 草甘勝，pH 為 5.8 ; (4)進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得抗性苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述甘藍(lán)型油菜幼苗的培 養(yǎng)方法包括:將油菜種子消毒后平鋪在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)直至獲得幼苗，所述固體培養(yǎng)基為:1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L瓊脂，pH為5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體包括:制備侵染液，將愈傷化的外植體浸入侵染液中，取出后吹干。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述愈傷化的外植體浸入侵染液的時(shí)間為3~10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述侵染液制備方法包括: (1)農(nóng)桿菌的活化； (2)將活化后的農(nóng)桿菌接入液體培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)液0D_值達(dá)到0.8~I時(shí)，分離獲得農(nóng)桿菌； (3)將分離得到的農(nóng)桿菌混入l/5MS+15g/L蔗糖的培養(yǎng)液中，懸浮制得侵染液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基為:YEB+12mg/L四環(huán)素+50mg/L卡那霉素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)包括:當(dāng)抗性不定芽長(zhǎng)至3~5cm時(shí)，從基部切去愈傷組織，將抗性不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基為:MS+0.2mg/L NAA+4.5mg/L草甘膦，pH為5.8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，還包括:當(dāng)抗性苗形成完整根系后，開(kāi)瓶煉苗一天，取出抗性苗移入1/5MS培養(yǎng)液中，水培I周后，移栽到有機(jī)質(zhì)培養(yǎng)土中。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103966258SQ201410177616
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】徐茜, 周偉軍, 劉宏波, 李蘭, 黃昌蓉, 許玲 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)