本申請根據35U.S.C.§119(e)要求2014年3月21日提交的美國臨時申請系列第61/968,986號和2014年3月21日提交的美國臨時申請系列第61/968,905號的權益，所述兩個申請均據此通過引用并入。發(fā)明領域提供了非人動物，所述非人動物表現出免疫球蛋白重鏈基因座的高度多樣性和優(yōu)選地免疫球蛋白輕鏈基因座的極低多樣性，這允許選擇結合抗原的單結構域抗原結合蛋白，包括VH-單結構域結合蛋白和VL-單結構域結合蛋白。背景在大多數動物中，正常的免疫球蛋白重鏈只在與其同源輕鏈相偶聯時才會有很好的表達。在人中，單獨的重鏈發(fā)現于表現為功能失調的重鏈的重鏈疾病中，所述重鏈缺少可變重鏈結構域、CH1結構域或可變重鏈與CH1結構域的序列。不含輕鏈的重鏈可見于魚的某些種以及駱駝中。此類重鏈缺少功能性CH1結構域并且在它們的重鏈可變結構域中具有非人的特征。已有人嘗試通過修飾小鼠以表達模擬駱駝或魚的某些種中發(fā)現的VHH結構域的駱駝化基因，部分地通過去除IgM和IgG的CH1結構域并使重鏈可變區(qū)符合駱駝和/或魚的某些種的那些重鏈可變區(qū)來產生駱駝化抗體。不幸的是，預期駱駝化抗體可在非駱駝動物中誘導免疫應答。對于經遺傳修飾以包含失活的CH1結構域的非人動物的先前形式的另一個挑戰(zhàn)是抗原特異性單結構域抗原結合蛋白相較于常規(guī)抗體的降低的表達水平。此類降低可歸因于缺少可用于非駱駝重鏈可變區(qū)的允許重鏈可變區(qū)補償VL結構域的不存在的的機制。例如，在只有重鏈的結合蛋白中發(fā)現的駱駝VHH結構域包含CDRH3，所述CDRH3平均長于在非駱駝抗體中發(fā)現的那些CDRH3，被認為是對總體抗原親和力和特異性的主要影響，并且被認為補償只有駱駝重鏈的抗體中的VL結構域的不存在。因此，在本領域中存在對產生多種具有非駱駝VH結構域的單結構域結合蛋白的經遺傳修飾的非人動物的需要。概述如本文中所公開的，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白多肽鏈可由非人動物表達，并且形成VL-單結構域抗原結合蛋白，例如，包含可操作地連接至重鏈恒定結構域的輕鏈可變結構域的單結構域抗原結合蛋白，其中所述重鏈恒定結構域缺少例如選自IgG、IgA、IgE、IgD或其組合的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的功能性CH1結構域。所述VL-單結構域抗原結合蛋白可表現出相較于包含可操作地連接至缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定結構域的重鏈可變結構域的VH-單結構域抗原結合蛋白增強的穩(wěn)定性。因此，本文中提供了能夠表達包含輕鏈可變結構域和重鏈恒定區(qū)的VL-單結構域抗原結合蛋白的非人動物，其中所述重鏈恒定區(qū)缺少功能性CH1結構域，并且還可任選地缺少功能性鉸鏈區(qū)，以及制備和使用表達VL-單結構域抗原結合蛋白的非人動物的方法。還提供了來源于表達VL-單結構域抗原結合蛋白的非人動物的細胞、蛋白質和核酸，以及所述分離的細胞、蛋白質和核酸的用途。還如本文中所公開的，由能夠產生單結構域抗原結合蛋白例如VL-或VH-單結構域抗原結合蛋白的非人動物對單一重排的輕鏈的表達，相較于不表達所述單一重排的輕鏈的能夠產生單結構域抗原結合蛋白的相似非人動物，增加了響應于抗原攻擊的抗原特異性單結構域抗原結合蛋白的滴度。圖5.該數據表明單一重排的輕鏈在非人動物中的存在增加了產生抗原特異性單結構域抗原結合蛋白的可能性。因此，本文中提供了能夠表達單結構域抗原結合蛋白(例如，VH-和/或VL-單結構域抗原結合蛋白)和單一重排的輕鏈的非人動物以及產生和使用表達VL-單結構域抗原結合蛋白的非人動物的方法。還提供了來源于表達單結構域抗原結合蛋白和單一重排的輕鏈的非人動物的細胞、蛋白質和核酸，以及所述分離的細胞、蛋白質和核酸的用途。本文中還提供了包含VL-單結構域抗原結合蛋白和單一重排的輕鏈的非人動物，產生能夠產生高滴度的單結構域抗原結合蛋白的非人動物和/或增加能夠產生此類結合蛋白的非人動物的單結構域結合蛋白的產生的方法，使用所述非人動物產生抗原特異性單結構域抗原結合蛋白的方法和所產生的單結構域抗原結合蛋白。提供經遺傳修飾的細胞、非人胚胎、非人動物以及用于產生它們和使用它們的方法和組合物，其中所述動物被遺傳修飾來產生單結構域抗原結合蛋白，例如，包含缺少功能性CH1序列，并且還任選地缺少功能性鉸鏈區(qū)序列的重鏈恒定區(qū)的結合蛋白，并且其中所述動物還被遺傳修飾來將單結構域抗原結合蛋白表達為VL-單結構域抗原結合蛋白(例如，從可操作地連接至經修飾以使CH1結構域編碼序列失活或缺失的重鏈恒定區(qū)核酸序列的重排的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列編碼的)和/或單一重排的輕鏈(例如，從可操作地連接至動物種系中的輕鏈恒定區(qū)的單一重排的VL:JL序列編碼的)。如本文中所公開的動物可產生單結構域結合蛋白，所述單結構域結合蛋白，在一個方面，包含IgG同種型，諸如，例如，IgG1同種型。在一些實施方案中，所述單結構域抗原結合蛋白是VH-單結構域抗原結合蛋白，例如，包含可操作地連接至缺少功能性CH1的重鏈恒定區(qū)的重鏈可變區(qū)。在其它實施方案中，所述單結構域抗原結合蛋白是VL-單結構域抗原結合蛋白，例如，包含可操作地連接至缺少功能性CH1的重鏈恒定區(qū)(例如，包含鉸鏈、CH2、CH3、CH4或其組合的重鏈恒定區(qū))的輕鏈可變結構域。因此，在一些方面，如本文所述的單結構域抗原結合蛋白由來源于可操作地連接至重鏈恒定區(qū)(例如，選自由CH1、鉸鏈、CH2、CH3、CH4及其組合組成的組的重鏈恒定區(qū)結構域)的一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈V區(qū)段和一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈J區(qū)段的核酸序列編碼，其中所述重鏈恒定區(qū)包含在CH1區(qū)序列中的缺失或失活突變。在一個實施方案中，所述未重排的輕鏈V和J區(qū)段替換內源非人免疫球蛋白重鏈基因座中的一個或多個、基本上所有或所有功能性內源非人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因區(qū)段。在一些實施方案中，經修飾以包含輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的重鏈基因座可發(fā)現于非人動物的種系中，所述輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段可操作地連接至如本文中所公開的包含CH1區(qū)序列中的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū)。此類經修飾的基因座可處于內源重鏈基因座中，或存在于處于除內源重鏈基因座外的基因座中的轉基因中(例如，在基因組中的隨機位置處插入的)。在一個方面，包含編碼VL-單結構域抗原結合蛋白的核酸序列(例如，來源于一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈V區(qū)段和一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈J區(qū)段的核酸序列，所述輕鏈V區(qū)段和輕鏈J區(qū)段可操作地連接至在CH1區(qū)序列中包含缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū))的本文中所公開的動物還可包含含有輕鏈可變和輕鏈恒定區(qū)的第二免疫球蛋白多肽鏈，所述第二免疫球蛋白多肽鏈可由包含可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的人輕鏈V區(qū)段和人輕鏈J區(qū)段的第二核酸序列編碼。此類第二核酸序列還可發(fā)現于非人動物的種系中。此類核酸序列可存在于內源輕鏈基因座中，或存在于除內源輕鏈基因座外的基因座上的轉基因中(例如，在基因組中的隨機位置處插入的)。在另一個方面，經修飾以包含來源于一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈V區(qū)段和一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈J區(qū)段(所述輕鏈V區(qū)段和輕鏈J區(qū)段可操作地連接至包含在CH1區(qū)序列中的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū))的核酸序列的動物，還可被進一步修飾來表達單一重排的輕鏈，例如，共同輕鏈(ULC)。在一些實施方案中，所述單結構域抗原結合蛋白諸如，但不限于，VL-單結構域抗原結合蛋白和/或單一重排的輕鏈包含人獨特型。例如，如本文中所公開的單結構域抗原結合蛋白和/或經遺傳工程化的單一重排的輕鏈可包含人可變結構域和，在一個實施方案中，非人恒定結構域。在一個實施方案中，所述非人恒定結構域是內源非人恒定結構域。在一個實施方案中，所述非人恒定結構域是嚙齒類動物的恒定結構域，例如，鼠恒定結構域，例如，小鼠恒定結構域。在另一個實施方案中，所述恒定結構域是人恒定結構域。在一個方面，所述單結構域抗原結合蛋白是包含人輕鏈可變結構域和非人重鏈恒定結構域的VL-單結構域抗原結合蛋白。在一個實施方案中，編碼如本文中所公開的VL-單結構域抗原結合蛋白的未重排的輕鏈V和/或J區(qū)段是人區(qū)段。經遺傳修飾以產生如本文中所公開的單結構域抗原結合蛋白的動物可包含具有一個或多個未重排的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因區(qū)段、一個或多個未重排的人免疫球蛋白輕鏈V區(qū)段和一個或多個未重排的人免疫球蛋白輕鏈J區(qū)段對一個或多個或所有內源免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的替換的重鏈基因座。在一些方面，所有內源VH、DH和JH基因區(qū)段被一個或多個未重排的人VH、一個或多個未重排的人DH和一個或多個未重排的人JH基因區(qū)段替換。在其它方面，所有內源VH、DH和JH基因區(qū)段被一個或多個未重排的人免疫球蛋白輕鏈VL基因區(qū)段和一個或多個未重排的人免疫球蛋白輕鏈JL基因區(qū)段，例如，人卡kappa(κ)Vκ和/或Jκ基因區(qū)段和/或人lambda(λ)Vλ和/或Jλ基因區(qū)段替換。經遺傳修飾以產生單結構域結合蛋白(其包含重鏈可變區(qū)或在包含CH1區(qū)和/或鉸鏈區(qū)的缺失的重鏈恒定區(qū)的情況下的輕鏈可變區(qū))的動物，可具有內源重鏈基因座中的修飾(和/或本文所述的恒定區(qū)基因的基因座的其它修飾)，或可在轉基因上具有修飾，其中所述轉基因位于基因組中的任何地方，例如，被通過隨機插入引入基因組。在一些實施方案中，可在動物的種系中發(fā)現如本文所述的經修飾的重鏈基因座。在也經修飾以表達單一重排的輕鏈的動物中，所述單一重排的輕鏈可變區(qū)可被可操作地連接至內源輕鏈基因座中的輕鏈恒定區(qū)，或可存在于轉基因中，所述轉基因包含與同源(例如，自體的；針對非人動物)或異源輕鏈恒定區(qū)可操作地連接的所述單一重排的輕鏈可變區(qū)，并且存在于除內源輕鏈基因座外的基因座中(例如，隨機插入基因組的)。在其它實施方案中，本文中所公開的動物的重鏈基因座可在鉸鏈區(qū)中包含缺失或失活突變。另外，本文中所公開的動物可被修飾來包含和/或表達可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的單一重排的輕鏈可變基因序列(也稱為共同或通用輕鏈(ULC))，其可由包含單一重排的VL:JL基因序列的輕鏈基因座編碼。在一些實施方案中，所述輕鏈基因座包含其中VL序列為Vκ基因序列的單一重排的VL:JL基因序列。在一些方面，所述Vκ序列選自Vκ1-39或Vκ3-20。在一些方面，所述JL序列為Jκ基因序列，例如，Jκ1序列、Jκ2序列、Jκ3序列、Jκ4序列或Jκ5序列等。在一些實施方案中，所述輕鏈基因座包含選自由Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1組成的組的單一重排的Vκ:Jκ序列。在一個實施方案中，所述輕鏈基因座包含Vκ1-39Jκ5的單一重排的Vκ:Jκ序列。在另一個實施方案中，所述輕鏈基因座包含Vκ3-20Jκ1的單一重排的Vκ:Jκ序列。在一些實施方案中，所述單一重排的可變基因序列可操作地連接至非人輕鏈恒定區(qū)基因，例如，內源非人輕恒定區(qū)基因。在另一個實施方案中，所述單一重排的可變基因序列可操作地連接至人輕鏈恒定區(qū)基因。在一些方面，所述單一重排的可變基因序列為插入內源免疫球蛋白輕鏈基因座的人V:J序列，以使得所得的非人動物在一個或多個輕鏈基因座中不包含功能性未重排的V和/或J基因區(qū)段。因此，本文中提供了非人動物，所述非人動物具有包含在CH1編碼區(qū)中缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū)，以及(a)在包含CH1區(qū)中的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū)的情況下的輕鏈可變區(qū)和(b)所述單一重排的輕鏈之任一或兩者。例如，如本文中所公開的非人動物可包含來源于一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈V區(qū)段和一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈J區(qū)段(所述輕鏈V區(qū)段和輕鏈J區(qū)段可操作地連接至如本文中所公開的包含在CH1區(qū)序列中的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū))的核酸序列。在一個方面，如本文中所公開的非人動物包含編碼免疫球蛋白CH1結構域的核酸序列中的缺失或失活突變和可操作地連接至如本文中所公開的輕鏈恒定區(qū)和單一重排的輕鏈可變基因序列。在另一個方面，本文中所公開的非人動物包含來源于一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈V區(qū)段和一個或多個未重排的免疫球蛋白輕鏈J區(qū)段(所述輕鏈V區(qū)段和輕鏈J區(qū)段可操作地連接至包含在CH1區(qū)序列中的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū))和可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的單一重排的輕鏈可變基因序列的核酸序列。在一些實施方案中，所述重鏈恒定區(qū)是非人恒定區(qū)，例如，內源非人恒定區(qū)。在其它實施方案中，所述重鏈恒定區(qū)是人恒定區(qū)。在一些方面，非人動物在其種系中包含如本文中所公開的經修飾的重鏈基因座和/或經遺傳工程化的重排的輕鏈基因座。所述非人動物還可包含在以下免疫球蛋白基因的一個或多個中的缺失或失活突變：IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgE、IgA及其組合。在一個實施方案中，所述非人動物包含在IgG2a和IgG2b免疫球蛋白基因中的缺失或失活突變。在另一個實施方案中，所述非人動物包含在IgG3、IgD、IgA和IgE免疫球蛋白基因中的缺失或失活突變。在另一個實施方案中，所述非人動物包含在IgG3、IgD、IgG2a、IgG2b、IgA和IgE免疫球蛋白基因中的缺失或失活突變。在一些方面，如本文中所公開的非人動物還可包含能夠保持雄性非人動物的生育力的Adam6a基因(或其片段)和/或Adam6b基因(或其片段)。Adam6a基因、Adam6b基因或兩者可被異位放置，或可在靠近非人動物中的Adam6基因的位置的位置上。Adam6a基因、Adam6b基因或兩者在雄性非人動物中是有功能的。例如，所述非人動物是嚙齒類動物(例如，小鼠或大鼠)，并且Adam6a基因、Adam6b基因或兩者分別是小鼠或大鼠基因。在各個實施方案中，Adam6基因的維持或插入維持或賦予雄性非人動物(例如，賦予雄性小鼠或大鼠)的生育力。在一個方面，本文中所公開的非人動物包含由包含功能性CH1結構域編碼序列的IgM基因序列編碼的IgM免疫球蛋白，所述IgM免疫球蛋白可與同源輕鏈，例如，經遺傳工程化的單一重排的輕鏈締合。在另一個實施方案中，所述非人動物只產生具有IgM和IgG1同種型的重鏈，其中所述IgM重鏈包含功能性CH1結構域，而IgG1重鏈缺少功能性CH1結構域。在一個方面，與IgM重鏈締合的同源輕鏈由可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的單一重排的輕鏈可變基因序列編碼或來源于其。如本文中所公開的經遺傳工程化的單一重排的輕鏈的表達導致非人動物在被抗原攻擊后產生高滴度的抗原特異性單結構域抗原結合蛋白。至少1x102μg/mL、至少1x103μg/mL、至少1x104μg/mL或至少1x105μg/mL的滴度，例如，抗體或結合蛋白濃度(例如，如通過ELISA測量的)可被認為是高滴度。或者，如果所述結合蛋白的濃度為不包含遺傳工程化的重排的輕鏈的相應對照動物的濃度的至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍，則非人動物產生高滴度的結合蛋白。還提供了產生如本文所公開的非人動物的方法。此類方法包括修飾所述非人動物的非人重鏈恒定區(qū)，以使得所述重鏈恒定區(qū)包含編碼CH1結構域，例如，IgG1CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變。產生如本文中所公開的非人動物的方法還可包括在內源免疫球蛋白重鏈基因座中用一個或多個未重排的輕鏈V和/或一個或多個未重排的輕鏈J基因區(qū)段替換一個或多個、所有或基本上所有內源非人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段，以使得所述輕鏈V和J基因區(qū)段可操作地連接至包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū)。在一個實施方案中，所述未重排的輕鏈V和J基因區(qū)段能夠經歷有效重排(productiverearangement)，例如，包含重組信號序列(RSS)，所述信號序列允許未重排的輕鏈V和J基因區(qū)段組合，以使得經修飾的非人動物包含可操作地連接至重鏈恒定區(qū)核酸序列的重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL/JL)核苷酸序列，其中所述重鏈恒定區(qū)核酸序列包含在編碼CH1結構域的序列中的失活突變或缺失。在一個實施方案中，所述未重排的輕鏈V和J基因區(qū)段重組，以使得經修飾的非人動物包含重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL/JL)核苷酸序列，所述核苷酸序列包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或更多個N添加，并且可操作地連接至重鏈恒定區(qū)核酸序列，并且其中所述重鏈恒定區(qū)核酸序列包含在編碼CH1結構域的序列中的失活突變或缺失。在一個實施方案中，所述未重排的輕鏈V和J基因區(qū)段是人V和J區(qū)段。所述方法還可包括使動物表達來源于未重排的輕鏈V基因區(qū)段、未重排的輕鏈J基因區(qū)段和具有失活的或缺失的CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的VL-單結構域結合蛋白。在另一個實施方案中，產生如本文中所公開的非人動物的方法還可包括引入包含編碼單一重排的輕鏈，例如，通用輕鏈(ULC)的核酸的經遺傳工程化的單一重排的輕鏈基因座，和任選地，使動物表達具有失活的CH1結構域的重鏈免疫球蛋白基因座和所述單一重排的輕鏈基因座。在一個方面，產生如本文中所公開的非人動物的方法包括(a)修飾所述非人動物的非人重鏈恒定區(qū)，以使得所述重鏈恒定區(qū)包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變，和以下步驟之任一或兩者：(b)在內源免疫球蛋白重鏈基因座上用一個或多個未重排的輕鏈V和/或一個或多個未重排的輕鏈J基因區(qū)段替換一個或多個、所有或基本上所有內源非人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段，以使得所述輕鏈V和J基因區(qū)段可操作地連接至包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變的非人重鏈恒定區(qū)，和/或(c)引入編碼經遺傳工程化的單一重排的輕鏈基因座的核酸。本文中所公開的方法的步驟可以以任意順序、貫序地或同時進行。例如，如本文中所公開的方法包括(a)修飾所述非人動物的非人重鏈恒定區(qū)，以使得重鏈恒定區(qū)包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變，和(b)在內源免疫球蛋白重鏈基因座上用一個或多個未重排的輕鏈V和/或一個或多個未重排的輕鏈J基因區(qū)段替換一個或多個、所有或基本上所有內源非人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段，以使得所述輕鏈V和J基因區(qū)段可操作地連接至包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變的非人重鏈恒定區(qū)。在一個方面，如本文中所公開的方法包括(a)修飾所述非人動物的非人重鏈恒定區(qū)，以使得所述重鏈恒定區(qū)包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變，和(b)引入編碼經遺傳工程化的單一重排的輕鏈基因座的核酸。在另一個方面，產生如本文中所公開的非人動物的方法包括(a)修飾所述非人動物的非人重鏈恒定區(qū)，以使得所述重鏈恒定區(qū)包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變，(b)在內源免疫球蛋白重鏈基因座上利用一個或多個未重排的輕鏈V和/或一個或多個未重排的輕鏈J基因區(qū)段替換一個或多個、所有或基本上所有內源非人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段，以使得所述輕鏈V和J基因區(qū)段可操作地連接至包含編碼CH1結構域的核苷酸序列的缺失或失活突變的非人重鏈恒定區(qū)，和(c)引入編碼經遺傳工程化的單一重排的輕鏈基因座的核酸。產生如本文中所公開的非人動物的方法還可包括將Adam6a基因、Adam6b基因或兩者引入所述非人動物的基因組，例如，引入動物的種系。在一個方面，所述方法還包括例如通過免疫動物使動物表達具有失活的CH1結構域的重鏈免疫球蛋白基因座和/或經遺傳重排的輕鏈基因座(單一重排的輕鏈基因座)。在一個方面，使重鏈免疫球蛋白基因座的CH1結構域和任選地鉸鏈區(qū)失活的步驟使得非人動物產生如本文中所公開的單結構域抗原結合蛋白。在一個實施方案中，使重鏈免疫球蛋白基因座的CH1結構域和任選地鉸鏈區(qū)失活，包括用使重鏈基因座例如IgG重鏈基因座的CH1結構域和任選地鉸鏈區(qū)缺失或將失活突變引入所述CH1結構域和鉸鏈區(qū)的靶向載體靶向內源重鏈免疫球蛋白基因座。在一個實施方案中，使重鏈免疫球蛋白基因座的CH1結構域和任選地鉸鏈區(qū)失活，包括同源重組。在另一個實施方案中，所述失活步驟還可包括用以下區(qū)段的任一個或多個替換重鏈基因的基因座的一個或多個、基本上所有或所有內源可變區(qū)基因區(qū)段：一個或多個重鏈可變區(qū)基因區(qū)段、一個或多個輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段、一個或多個人可變區(qū)基因區(qū)段和一個或多個未重排的可變區(qū)基因區(qū)段。可在非人動物的種系中進行使重鏈基因的基因座的CH1結構域和任選地鉸鏈區(qū)失活的步驟。在一個方面，所述方法包括引入編碼經遺傳工程化的重排的輕鏈基因座，例如，如本文所述的經遺傳工程化的通用輕鏈的核酸。在一個方面，引入編碼經遺傳工程化的重排的輕鏈基因座的核酸的步驟還包括替換非人動物的所有或基本上所有內源免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個方面，引入編碼經遺傳工程化的重排的輕鏈基因座的核酸的步驟還包括使非人動物的所有或基本上所有內源免疫球蛋白輕鏈基因座功能性失活。在另一個方面，將編碼經遺傳工程化的重排的輕鏈的核酸引入動物的種系。在一個實施方案中，產生如本文中所公開的非人動物的方法包括(a)獲得第一非人動物，其包含具有缺失的或失活的CH1結構域的重鏈基因座(和任選地可操作地連接至具有缺失的或失活的CH1結構域的重鏈恒定區(qū)序列的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列)，和任選地缺失的或失活的鉸鏈區(qū)，以使得所述非人動物產生如本文中所公開的單結構域抗原結合蛋白(諸如VL單結構域結合蛋白)，和(b)使(a)的第一非人動物與第二非人動物交配，所述第二非人動物在一個方面可以是與所述第一非人動物不同的品系，其中所述第二非人動物表達通用輕鏈，以及其中所述交配導致產生，例如，包含單結構域抗原結合蛋白和經遺傳工程化的重排的輕鏈(單一重排的輕鏈；ULC)的后代。在一些方面，產生如本文中所公開的非人動物的方法還包括使選自由IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgE和IgA組成的組的一個或多個免疫球蛋白基因失活或缺失。在一個實施方案中，使IgG2b和IgG2a/IgG2c免疫球蛋白基因缺失。在另一個實施方案中，使IgD、IgG3、IgG2b、IgG2a/IgG2c、IgE和IgA基因缺失，以使得所述非人動物產生具有IgM或IgG1同種型的免疫球蛋白重鏈，其中所述IgG1同種型在CH1結構域和任選地鉸鏈區(qū)中具有缺失或失活突變。在一個方面，非人動物已能夠產生單結構域抗原結合蛋白，并且本文中提供了增加所述非人動物的單結構域抗原結合蛋白的產生的方法。此類方法包括使非人動物的B細胞表達編碼經遺傳工程化的單一重排的輕鏈，例如，如本文所述的經遺傳工程化的通用輕鏈的核酸。使B細胞表達此類核酸還可包括失活或阻止B細胞表達內源輕鏈基因。在一個方面，如本文中所公開的非人動物是大鼠或小鼠。在另一個實施方案中，如本文中所公開的非人動物是小鼠。因此，本文中提供了經遺傳修飾的小鼠，其包含(a)在小鼠重鏈基因座中用一個或或多個人重鏈V、D和J基因區(qū)段對所有或基本上所有內源免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區(qū)段的替換，其中所述一個或多個人重鏈V、D和J基因區(qū)段可操作地連接至小鼠重鏈恒定區(qū)(例如，內源小鼠重鏈恒定區(qū))，其中所述小鼠重鏈恒定區(qū)包含全長IgM基因；和包含在編碼選自由IgG1、IgG2a、IgG2c、IgG2b及其組合組成的組的IgG基因中的CH1區(qū)的核苷酸序列中的缺失或失活突變的IgG基因，其中所述小鼠表達包含具有CH1區(qū)的IgM的B細胞受體，其中所述IgM包含與同源輕鏈締合的重鏈；和(b)用單一重排的可變Vκ:Jκ基因序列對所有或基本上所有內源免疫球蛋白輕鏈V和J基因區(qū)段的替換。在一些實施方案中，所述同源輕鏈來源于單一重排的可變Vκ:Jκ基因序列。在一些實施方案中，所述單一重排的可變Vκ:Jκ基因序列可操作地連接至小鼠輕鏈恒定序列，例如，內源小鼠輕鏈恒定序列。在另一個方面，本文中提供了非人動物，例如，大鼠或小鼠，其包含(a)小鼠重鏈基因座中的所有或基本上所有內源免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區(qū)段的缺失或功能性失活以及一個或多個人重鏈V、D和J基因區(qū)段的引入，其中所述一個或多個人重鏈V、D和J基因區(qū)段可操作地連接至小鼠重鏈恒定區(qū)(例如，內源小鼠重鏈恒定區(qū))，其中所述小鼠重鏈恒定區(qū)包含全長IgM基因；和IgG基因，其包含在編碼選自由IgG1、IgG2a、IgG2c、IgG2b及其組合組成的組的IgG基因中的CH1區(qū)的核苷酸序列中的缺失或失活突變，其中所述小鼠表達包含具有CH1區(qū)的IgM的B細胞受體，其中所述IgM包含與同源輕鏈締合的重鏈；和/或(b)所有或基本上所有內源免疫球蛋白輕鏈V和J基因區(qū)段的缺失或功能性失活和單一重排的可變Vκ:Jκ基因序列的引入。本文中還提供了經遺傳修飾的小鼠，其包含(a)小鼠重鏈基因座中用一個或多個人輕鏈V和J基因區(qū)段對所有或基本上所有內源免疫球蛋白重鏈V、D和J基因區(qū)段的替換，其中所述一個或多個人輕鏈V和J基因區(qū)段可操作地連接至小鼠重鏈恒定區(qū)，其中所述小鼠重鏈恒定區(qū)包含全長IgM基因；和包含在編碼選自由IgG1、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgG3及其組合組成的組的IgG基因中的CH1區(qū)的核苷酸序列中的缺失或失活突變的IgG基因，其中所述小鼠表達包含具有CH1區(qū)的IgM的B細胞受體，其中所述IgM包含與同源輕鏈締合的重鏈；和(b)用單可變Vκ:Jκ基因序列對所有或基本上所有內源免疫球蛋白輕鏈V和J基因區(qū)段的替換。在一些實施方案中，所述同源輕鏈來源于單一重排的可變Vκ:Jκ基因序列。在一個方面，提供了用于產生缺少CH1結構域的結合蛋白的方法，所述方法包括：(a)從如本文所述的非人動物分離所述結合蛋白，產生所述結合蛋白的細胞或編碼所述結合蛋白序列的核苷酸序列。在一個方面，所述分離步驟可包括以下步驟的一個或多個步驟：(a)用抗原免疫如本文所述的非人動物；(b)在足以使非人動物產生結合蛋白的條件下維持所述非人動物和/或(c)鑒定由所述非人動物產生的缺少功能性CH1結構域和/或缺少功能性鉸鏈區(qū)的結合蛋白。在一些方面，所分離的結合蛋白是單結構域抗原結合蛋白。在一個方面，單結構域抗原結合蛋白是單體的。在一個方面，提供了用于產生抗原結合蛋白的方法，所述方法包括(a)用抗原免疫如本文所述的非人動物；(b)在足以產生結合蛋白的條件下維持所述非人動物；(c)鑒定由所述非人動物產生的結合蛋白，其中所述結合蛋白缺少功能性CH1結構域或缺少功能性CH1結構域及缺少鉸鏈區(qū)；(d)鑒定編碼免疫球蛋白多肽上的可變結構域的可變區(qū)序列，所述免疫球蛋白多肽缺少CH1結構域，或缺少鉸鏈區(qū)和CH1結構域，其中所述可變結構域特異性結合所述抗原；(e)在合適的表達系統中表達由與(d)的可變區(qū)序列相同或基本上相同的序列編碼的蛋白質，其中(d)的可變區(qū)序列與缺少CH1區(qū)或缺少CH1區(qū)和鉸鏈的重鏈可變序列的核酸序列連接；和/或(f)分離(e)的表達的蛋白質。在一些實施方案中，表達由所述可變區(qū)序列編碼的蛋白質和/或(f)分離表達的蛋白質的步驟包括培養(yǎng)細胞，例如用所述可變區(qū)序列轉染的細胞，從分離自本文中所公開的動物的細胞形成的雜交瘤，和/或從培養(yǎng)的細胞收集上清液。在一個方面，提供了用于產生抗原結合蛋白的方法，所述方法包括用抗原免疫如本文所述的非人動物，鑒定編碼特異性結合所述抗原的可變結構域的可變區(qū)核酸序列，和在適當的表達系統中使用所述可變區(qū)核酸序列，其中使可變區(qū)核酸序列與缺少CH1或缺少CH1和鉸鏈的重鏈恒定基因連接；其中所述表達系統表達特異性結合抗原的抗原結合蛋白。因此，本文中還提供了此類分離的結合蛋白、細胞和核酸序列。其它實施方案已被描述，并且根據確保詳細描述的綜述對于本領域技術人員來說將變得顯而易見。附圖簡述圖1A舉例說明靶向小鼠IgG1基因、IgG2b和IgG2a基因(未按比例)以產生表達缺少CH1結構域的IgG1的經遺傳修飾的小鼠免疫球蛋白重鏈基因座；將由空心三角形表示的人免疫球蛋白重鏈V、D和J區(qū)段插入小鼠恒定基因座，其中使IgG1CH1外顯子*和IgG2a/2b**缺失，橢圓形代表增強子。圖1B舉例說明包含單一重排的人VL/JL基因序列***的小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座(不按比例)。圖1C舉例說明由具有圖1B和1C的Ig基因座的小鼠表達的IgM，其中所述IgM包含完整的CH1結構域。圖1C還舉例說明在在類別轉換后，由具有圖1A和1C的Ig基因座的小鼠表達的IgG1是缺少CH1結構域的單結構域重鏈抗原結合蛋白。圖2舉例說明兩條通用輕鏈的基因組結構(不按比例)，其中一條通用輕鏈包含含有Vκ1-39Jκ5的單一重排的人可變區(qū)，其中另一條通用輕鏈包含含有Vκ3-20Jκ1的單一重排的人可變區(qū)。圖3舉例說明小鼠中的野生型IgG1基因座(IgG1，上方)，顯示了與CH1基因區(qū)段融合的JH區(qū)基因區(qū)段，其后是鉸鏈區(qū)、CH2基因區(qū)段和CH3基因區(qū)段；被使CH1結構域缺失的構建體(IgG1ΔCH1；I)靶向的IgG1基因座；被使CH1結構域和鉸鏈區(qū)缺失的構建體(IgG1ΔCH1Δ鉸鏈；II)靶向的IgG1基因座；被使IgG1CH1結構域、IgG2b和IgG2a缺失的構建體(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；III)靶向的恒定區(qū)基因座；被使IgG1CH1結構域、鉸鏈區(qū)、IgG2b和IgG2a缺失的構建體(IgG1ΔCH1&Δ鉸鏈ΔIgG2b/2a；IV)靶向的恒定區(qū)基因座；或被使IgG1CH1結構域、IgG2b、IgG2a、IgG3、IgD、IgA和IgE以及任選地鉸鏈區(qū)缺失的構建體(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E(任選地Δ鉸鏈)；V)靶向的恒定區(qū)基因座。基因座的示意圖不按比例呈現。IgG2a/c標示IgG2a或IgG2c基因座，因為取決于其品系，小鼠可具有IgG2a等位基因或IgG2c等位基因。圖4A舉例說明靶向小鼠重鏈序列(不按比例)以產生含有人重鏈可變基因區(qū)段(空心三角形)并且缺少功能性IgG1CH1結構域以及缺少IgG2a和IgG2b基因座的經遺傳修飾的基因座(在一些實施方案中被稱為1673)。圖4B舉例說明靶向小鼠IgG1基因(所有可變基因區(qū)段是小鼠并且由實心三角形標示)以產生表達缺少CH1結構域和鉸鏈的IgG1的經遺傳修飾的基因座(不按比例)(在一些實施方案中被稱為1576)。圖4C舉例說明靶向小鼠重鏈恒定區(qū)(不按比例)以產生缺少IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgG2b、IgG2a、IgE和IgA基因區(qū)段的經遺傳修飾的基因座(圖4D中繼續(xù)的克隆IgG1ΔCH1ΔIgG2b/IgG2a、ΔIgG3、ΔIgD/A/E的第一部分)。人可變基因區(qū)段由空心三角形標示。圖4D舉例說明靶向圖4C的小鼠恒定區(qū)以產生包含人重鏈可變基因區(qū)段、完全和功能性鼠IgM基因區(qū)以及缺乏功能性CH1結構域和任選地缺少功能性鉸鏈區(qū)的IgG1基因區(qū)的經遺傳修飾的基因座(不按比例)(所述小鼠也缺少IgG2b/IgG2a、IgG3和IgD/A/E；在一些實施方案中也被稱為6180)。人可變基因區(qū)段由空心三角形標示。圖5A顯示在用β-半乳糖苷酶(βgal)免疫之前和之后，以下各種單結構域IgG1小鼠之間的比較性總的血清IgG1滴度：對于mVHIgG1ΔCH1&鉸鏈和小鼠κ鏈是純合的小鼠(1576)；對于mVHIgG1ΔCH1&鉸鏈和為單一重排的輕鏈Vκ3-20Jκ1ULC的κ鏈是純合的小鼠(1576/1635)；或具有相同遺傳背景的野生型(WT)小鼠。HO對于遺傳修飾是純合的。圖5B舉例說明相較于mVHIgG1ΔCH1&鉸鏈純合小鼠(1576HO)或mVHIgG1ΔCH1-鉸鏈xVκ3-20Jκ1ULC1純合小鼠(1576HO1635HO)的被免疫的WT小鼠中的抗原特異性IgG1血清滴度。利用β-半乳糖苷酶(βgal)作為模型抗原免疫小鼠，通過ELISA測量抗原特異性IgG1滴度。圖6提供了在非還原條件下制備的并用抗小鼠IgG顯現的，來自2只hVHIgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2b/2axVκ1-39Jκ5ULC純合小鼠(1859HO1633HO)、3只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2axVκ3-20Jκ1ULC純合小鼠(1673HO1635HO)和3只具有人可變區(qū)(VH和Vκ)和二聚體單結構域抗原結合蛋白(37-37同二聚體)或單體ΔCH1單結構域結合蛋白(缺失了CH1鉸鏈的單鏈)的小鼠恒定區(qū)的對照小鼠(VI3IgG1)的小鼠血清的蛋白質印跡的圖像。圖7顯示在用抗原X(一種細胞表面蛋白)腹膜內免疫后，hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2axVκ1-39Jκ5純合小鼠(1673X1633)或hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2axVκ3-20Jκ1純合小鼠(1673X1635)的在不同的時間點(x-軸)上于動物的血漿中發(fā)現的IgG1滴度(y-軸)。圖8提供了在還原條件下制備的并用抗小鼠IgG顯現的，來自3只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ1-39Jκ5ULC純合小鼠(6180HO1634HO)、兩只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E純合小鼠(6180HO)和3只具有人可變區(qū)(VH和Vκ)和二聚體單結構域抗原結合蛋白(37-37同二聚體)或單體ΔCH1單結構域結合蛋白(缺失了CH1的單鏈)的小鼠恒定區(qū)的VI3對照小鼠的小鼠血清的蛋白質印跡的圖像。圖9顯示hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ1-39Jκ5(6180HOx1634HO)小鼠和hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E(6180HO)動物以及VI3對照動物的血漿中的穩(wěn)定狀態(tài)的IgM和IgG的濃度。圖10顯示來自代表性純合對照VI3和hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E(6180HO)xVκ1-39Jκ5(6180HO1634HO)小鼠的針對CD19和CD3被染色的單線態(tài)門控的脾細胞的等值曲線(A)。還顯示了來自代表性對照VI3小鼠和代表性純合hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ1-39Jκ5(6180HOx1634HO)小鼠的針對免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)被染色的CD19+B細胞門控的脾細胞的等值曲線(C)。注意，所述B細胞是IgD-，因為IgD恒定結構域已缺失。因此，該曲線中的術語“成熟”只表示IgD而非其它非IgM免疫球蛋白的不存在。還提供了顯示來自每一個組的3只代表性小鼠的CD19+B細胞的總數(y-軸；細胞/脾X107)的圖(B)。其等值曲線被包括的動物被加圈表示。圖11顯示來自代表性對照VI3小鼠和代表性純合hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ1-39Jκ5(6180HOx1634HO)小鼠的(A)針對CD93和B220被染色的分離自脾的CD19+門控的B細胞，(B)針對IgM和CD23被染色的未成熟或成熟門控的B細胞或(C)針對CD21/35和IgM被染色的未成熟或成熟門控的B細胞的等值曲線。圖12顯示針對CD19和CD39被染色的從代表性對照VI3小鼠和代表性純合hVHIgG1ΔCH1&IgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ1-39Jκ5(6180HOx1634HO)小鼠的股骨分離的骨髓的等值曲線。還顯示了來自每一個組的3只代表性小鼠的每股骨的細胞或CD19+B細胞的總數(y-軸；細胞/股骨x107)。其等值曲線被包括的動物被加圈指示。圖13顯示針對IgM和B220被染色的從代表性對照VI3小鼠和代表性純合hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ1-39Jκ5(6180HOx1634HO)小鼠的股骨分離的骨髓的等值曲線。還顯示了來自每一個組的3只代表性小鼠的每股骨的成熟(IgM+B220hi)和未成熟(IgM+B220int)B細胞的總數(y-軸；細胞/股骨x107)。其等值曲線被包括的動物被加圈指示。圖14A舉例說明小鼠重鏈基因座的示意圖(不按比例)。所述小鼠重鏈基因座的長度為約3Mb，并且含有約200個重鏈可變(VH)基因區(qū)段、13個重鏈多樣性(DH)基因區(qū)段和4個重鏈連接(JH)基因區(qū)段以及增強子(Enh)和重鏈恒定(CH)區(qū)。圖14B舉例說明人κ輕鏈基因座的示意圖(不按比例)。人κ輕鏈基因座被復制成分別跨越約440kb和600kb的相反極性的近側和遠側重疊群。介于兩個重疊群之間的是被認為不含Vκ基因區(qū)段的約800kb的DNA。人κ輕鏈基因座含有約76個Vκ基因區(qū)段、5個Jκ基因區(qū)段、內含增強子(Enh)和單個恒定區(qū)(Cκ)。圖15顯示向其中內源重鏈可變區(qū)基因區(qū)段已缺失的小鼠重鏈基因座內逐步插入40個人Vκ和5個人Jκ基因區(qū)段的靶向策略(不按比例)。顯示了具有重組酶識別位點(FRT)的潮霉素(HYG)和新霉素(NEO)選擇盒。還顯示了用于Adam6a、Adam6b和IGCR1基因的插入的靶向策略(不按比例)。人可變基因區(qū)段由空心三解形標示。圖16顯示圖15的經修飾的小鼠重鏈基因座(hJκ、40hVκ、Adam6；上方)；產生來自圖15的經修飾的小鼠重鏈基因座(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1、ΔIgG2b、ΔIgG2a；中間)的IgG1基因序列、IgG2b基因序列和IgG2a基因序列的CH1結構域的缺失和/或失活的靶向策略，和產生來自包含未重排的人Jκ基因區(qū)段和40個人Vκ基因區(qū)段的經修飾的小鼠重鏈基因座的選擇盒的缺失的靶向策略，其中所述經修飾的小鼠重鏈基因座缺少IgG1基因中的功能性CH1結構域并且還缺少功能性IgG2b和IgG2a基因(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1、ΔIgG2b、ΔIgG2a選擇盒已缺失；也稱為6082，下方)。人可變基因區(qū)段由空心三解形標示。圖17A顯示從以下3個不同組的動物的脾和骨髓分離的B細胞(x-軸)的相對mRNA表達(針對HPRT1mRNA標準化的；y-軸)：野生型(WT)小鼠、對于圖16的經修飾的重鏈基因座(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1ΔIgG2bΔIgG2a選擇盒已缺失；KoHCH1缺失)是純合的小鼠，以及對于表達人重鏈V、D和J區(qū)段，在IgG1基因中缺少功能性CH1結構域，以及還缺少功能性IgG2b和IgG2a基因和包含單一重排的輕鏈基因座(CH1缺失xULC)的兩個經修飾的小鼠重鏈基因座是純合的小鼠。設計探針來檢測有效重排，并且由檢測人Jκ區(qū)段與鼠gG1鉸鏈之間的重組的探針(hJκ/mIgG1鉸鏈探針；左圖)或檢測人JH區(qū)段與鼠IgG1鉸鏈之間的重組的探針(hJH/mIgG1鉸鏈探針；右圖)組成。ND：未檢測到的(Ct≥35)。n＝2(對于WT)，2(對于KoHCH1缺失)，和3(對于CH1缺失xULC)。圖17B顯示從以下3個不同的組的動物(x-軸)的脾和骨髓分離的B細胞的相對mRNA表達(針對mκCmRNA標準化的；y-軸)：野生型(WT)小鼠、對于圖16的重鏈基因座(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1ΔIgG2bΔIgG2a選擇盒已缺失；KoHCH1缺失)是純合的小鼠，以及對于表達人重鏈V、D和J區(qū)段，在IgG1基因序列中缺少功能性CH1結構域，以及還缺少功能性IgG2b和IgG2a基因序列的兩個經修飾的小鼠重鏈基因座是純合的并且包含單一重排的輕鏈基因座(CH1缺失xULC)的小鼠。設計探針來檢測有效重排，并且由檢測人Jκ區(qū)段與鼠gG1鉸鏈之間的重組的探針(hJκ/mIgG1鉸鏈探針；左圖)或檢測人JH區(qū)段和鼠IgG1鉸鏈的探針(hJH/mIgG1鉸鏈探針；右圖)組成。ND：未檢測到的(Ct≥35)。n＝2(對于WT)，2(對于KoHCH1缺失)，和3(對于CH1缺失xULC)。圖18提供了在非還原條件下制備的并用抗小鼠IgG顯現的，來自3只hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bxVκ3-20Jκ1ULC純合小鼠(6082HO1635HO)、3只具有人可變區(qū)(VH和Vκ)和小鼠恒定區(qū)的小鼠(VI3IgG1)以及2只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E小鼠(6180HO)的小鼠血清的蛋白質印跡的圖像，其顯示了二聚體單結構域抗原結合蛋白(37-37同聚物)或單體ΔCH1單結構域結合蛋白(CH1缺失單鏈)的存在或不存在。詳述本發(fā)明不限于所述的特定方法和實驗條件，因為此類方法和條件可變化。本文中使用的術語僅為了描述特定實施方案，并且不旨在是限制性，因為本發(fā)明的范圍將只由權利要求限制。除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與為本發(fā)明所屬領域內的普通技術人員通常所理解的含義相同的含義。雖然可在本發(fā)明的實踐或測試中使用與本文所述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但現描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出版物和專利文獻通過引用以其整體并入本文。本發(fā)明提供了在它們的基因組中，例如在它們的種系中包含編碼單結構域抗原結合蛋白(包括VH-單結構域抗原結合蛋白和VL-單結構域抗原結合蛋白)和/或單一重排的輕鏈的核苷酸序列的經遺傳修飾的非人動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)；產生所述非人動物的方法；以及使用所述非人動物的方法。除非另外定義，否則本文中使用的所有術語和短語包括所述術語和短語在本領域中已獲得的含義，除非明確地指出相反或從其中使用所述語和短語的背景明確地表現出相反。術語"抗體"包括典型的免疫球蛋白分子，其包含4條多肽鏈，通過二硫鍵鏈間連接的2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。術語還包括與抗原或其片段具有反應性的免疫球蛋白。合適的抗體包括，但不限于人抗體、靈長類動物化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多克隆抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體，人源化抗體，合成抗體，重組抗體，雜合抗體，突變型抗體，移植綴合抗體(即，綴合或融合至其它蛋白質、放射性標記、細胞毒素的抗體)和體外生成的抗體。技術人員將容易地識別常用抗體同種型，例如，具有選自由IgG、IgA、IgM、IgD和IgE或其任何亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)組成的組的重鏈恒定區(qū)的抗體。短語“重鏈”或“免疫球蛋白重鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白重鏈序列，包括免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列。除非另有所指，否則重鏈可變結構域包括3個重鏈CDR和4個FR區(qū)。重鏈的片段包括CDR、CDR和FR及其組合。典型的重鏈在可變結構域之后具有(從N末端至C末端)CH1結構域、鉸鏈、CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域(在IgM或IgE的情況下)。重鏈的功能性片段包括能夠特異性識別表位(例如，以在微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內的KD識別表位)的片段，所述片段能夠從細胞表達和分泌，并且包含至少一個CDR。重鏈可變結構域由可變區(qū)基因序列編碼，所述基因序列通常包含來源于存在于種系中的VH、DH和JH區(qū)段的庫的VH、DH和JH區(qū)段?？稍谝娪趙ww.imgt.org的國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)的網站上查看各種生物的V、D和J重鏈區(qū)段的序列、位置和命名。短語“輕鏈”包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈序列，并且除非另有所指，否則包括人κ及λ輕鏈和VpreB，以及替代輕鏈。除非另有所指，否則輕鏈可變結構域通常包括3個輕鏈CDR和4個框架(FR)區(qū)。通常地，全長輕鏈從氨基端至羧基端包括可變結構域(其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈可變結構域由輕鏈可變區(qū)基因序列編碼，所述基因序列通常包含來源于存在于種系中的VL和JL基因區(qū)段的庫的VL和JL基因區(qū)段。可在見于www.imgt.org的國際免疫遺傳學信息系統(IMGT)的網站上查看各種生物的V和J輕鏈區(qū)段的序列、位置和命名。輕鏈包括例如不選擇性結合被它們出現在其中的表位結合蛋白選擇性結合的第一或第二表位的那些輕鏈。輕鏈還包括結合并識別重鏈，或幫助重鏈結合并識別一個或多個被它們出現在其中的表位結合蛋白選擇性結合的表位。短語輕鏈包括"共同輕鏈”，也被稱為"通用輕鏈"(ULC)。共同或通用輕鏈(ULC)包括來源于免疫球蛋白輕鏈基因座的那些輕鏈，所述免疫球蛋白輕鏈基因座包含與輕鏈恒定區(qū)可操作地連接的單一重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列，其中所述免疫球蛋白輕鏈基因座的表達只產生來源于可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的單一重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的輕鏈，無論是否在免疫球蛋白輕鏈基因座中包含其它核酸序列，例如，其它輕鏈基因區(qū)段。通用輕鏈包括人Vκ1-39Jκ基因(例如，Vκ1-39Jκ5基因)或人Vκ3-20Jκ基因(例如，Vκ3-20Jκ1基因)，并且包括所述基因的體細胞突變(例如，親和力成熟的)形式。短語“基因區(qū)段”或“區(qū)段”包括提及V(輕鏈或重鏈)或D或J(輕鏈或重鏈)免疫球蛋白基因區(qū)段，所述基因區(qū)段包括可參與重排(例如，由內源重組酶介導的)以形成重排的V/J(輕鏈)或V/D/J(重鏈)序列的免疫球蛋白基因座(在例如人和小鼠中)中的未重排的序列。除非另有所指，否則V、D和J區(qū)段包含按照12/23法則允許進行V/J重組或V/D/J重組的重組信號序列(RSS)。除非另有所指，否則所述區(qū)段還包含天然地與它們締合的序列或其功能性等效物(例如，對于V區(qū)段、啟動子和前導序列)。關于核酸序列的術語“未重排的”包括存在于動物細胞的種系，優(yōu)選來源于未被遺傳修飾的，例如包含野生型基因組的動物的細胞中的核酸序列。通常地，重鏈可變區(qū)以其天然種系構型包含未重排的VH基因區(qū)段、未重排的DH基因區(qū)段和未重排的JH基因區(qū)段，而輕鏈可變區(qū)包含未重排的VL基因區(qū)段和未重排的JL基因區(qū)段。在B細胞成熟過程中，這些基因區(qū)段重排以產生重排的可變區(qū)基因。關于免疫球蛋白核酸序列的術語“種系”包括可被傳遞至后代的核酸序列。短語“互補決定區(qū)”或術語“CDR”包括由生物體的免疫球蛋白基因的核酸序列編碼的氨基酸序列，所述互補決定區(qū)通常(即，在野生型動物中)出現在免疫球蛋白分子(例如，抗體或T細胞受體)的輕或重鏈的可變區(qū)中的兩個框架區(qū)之間。CDR可由例如種系序列或重排的或未重排的序列和例如由天然或成熟B細胞或T細胞編碼。CDR可經體細胞突變(例如，由動物種系中編碼的序列改變)、人源化和/或經氨基酸取代、添加或缺失而修飾。在一些情況下(例如，對于CDR3而言)，CDR可由不連續(xù)(例如，在未重排的核酸序列中)，但是例如由于剪接或連接該序列(例如，V-D-J重組形成重鏈CDR3)，在B細胞核酸序列中連續(xù)的兩個或更多個序列(例如，種系序列)編碼。短語“體細胞突變”包括提及來自已經歷類別轉換的B細胞的核酸序列，其中類別轉換的B細胞中的免疫球蛋白可變區(qū)的核酸序列(例如，編碼重鏈可變結構域或包括重鏈CDR或FR序列的核苷酸序列)與類別轉換之前的B細胞中的核酸序列不同，諸如，例如，未經歷類別轉換的B細胞與已經歷類別轉換的B細胞之間的CDR或框架核酸序列的差異?！绑w細胞突變”包括提及來自與未親和力成熟的B細胞中的相應免疫球蛋白可變區(qū)序列(即，種系細胞的基因組中的序列)不同的親和力成熟的B細胞的核酸序列。短語“體細胞突變”還包括提及在B細胞暴露于目標表位后來自B細胞的免疫球蛋白可變區(qū)核酸序列，其中所述核酸序列不同于B細胞暴露于目標表位之前的相應核酸序列。短語“體細胞突變”是指來自已在動物，例如，具有人免疫球蛋白可變區(qū)核酸序列的小鼠中，響應于免疫原攻擊而生成的，并且由此類動物中固有操作性選擇過程產生的結合蛋白的序列。術語“同源的”，當在“與……同源”的意義上使用時，例如第一VL結構域與第二VL結構域“同源”，旨在包括提及來自根據本發(fā)明由小鼠產生的相同結合蛋白的兩個VL結構域之間的關系。例如，根據本發(fā)明的實施方案遺傳修飾的小鼠，例如，具有其中VH、DH和JH區(qū)被VL和JL區(qū)替換的重鏈基因座的小鼠，產生抗體樣結合蛋白，所述抗體樣結合蛋白具有由相同小鼠CH區(qū)(例如，IgM同種型)與第一人VL結構域融合構成的兩條相同多肽鏈，和由相同小鼠CL區(qū)與第二人VL結構域融合構成的兩條相同多肽鏈。在小鼠中的克隆選擇期間，通過克隆選擇過程選擇第一和第二人VL結構域以在單一抗體樣結合蛋白的情況下一起出現。因此，由于克隆選擇過程，在單一抗體樣分子中一起出現的第一和第二VL結構域被稱為是“同源的”。相反地，在第一抗體樣分子中出現的VL結構域與在第二抗體樣分子中出現的VL結構域不是同源的，除非所述第一和第二抗體樣分子具有相同的重鏈(即，除非與第一人重鏈融合的VL結構域和與第二人重鏈區(qū)融合的VL結構域相同)。在抗體發(fā)育早期，抗體重鏈經歷其中自然通過多種選擇方案選擇合適的重鏈以經歷進一步的選擇來最終形成功能性和親和力成熟的抗體的選擇過程。源自重鏈和輕鏈可變基因重排的多樣性存在于骨髓中，并且在類別轉換之前發(fā)生。從祖先B細胞(或，原B細胞)中的重組重鏈基因區(qū)段表達的抗體重鏈通常與替代輕鏈配對，以在IgM同種型的情況下呈現在原B細胞的表面上，以形成稱為前B細胞受體或前BCR的結構(其包括其它共受體)。一旦前BCR被呈現在細胞表面上，所述前BCR被認為就向細胞發(fā)出其復合物正確形成的信號，從而有效地指示細胞重鏈已通過該早期選擇步驟。因此細胞被告知所述重鏈可經歷進一步選擇。如果所述重鏈含有當在IgM和替代輕鏈的情況下呈遞時對前BCR的形成不利的缺陷，則所述細胞將經歷細胞凋亡。如果所述細胞經歷細胞凋亡，則重鏈的重鏈可變區(qū)的有用性或對多樣性的貢獻將損失。因此，抗體選擇中的非常早的步驟需要在IgM同種型的情況下將重鏈與替代輕鏈一起呈遞?？贵w生成B細胞的正常發(fā)育通常需要CH1結構域的存在。所有重鏈同種型(包括IgM)均包含CH1結構域。替代輕鏈和同源輕鏈被認為在IgM的情況下通過重鏈的CH1結構域與給定的重鏈相互作用。在B細胞離開骨髓后，與抗原的接合(這需要表達為細胞表面IgM的重排的抗體之間的低親和力相互作用)刺激體細胞高頻突變和類別轉換的協同誘導。類別轉換后，由表面B細胞受體產生的差異抗原識別允許從原始IgM的高頻突變衍生物的庫中選擇具有增強的親和力的抗體。術語“只有重鏈的抗體”、“只有重鏈的抗原結合蛋白”、“單結構域抗原結合蛋白”、“單結構域結合蛋白”等是指包含免疫球蛋白樣鏈的單體或同二聚體免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白樣鏈包含可操作地連接至重鏈恒定區(qū)的可變結構域，所述重鏈恒定區(qū)通常不能與輕鏈締合，因為所述重鏈恒定區(qū)通常缺少功能性CH1結構域。因此，術語“只有重鏈的抗體”、“只有重鏈的抗原結合蛋白”、“單結構域抗原結合蛋白”、“單結構域結合蛋白”等包括(i)單體單結構域抗原結合蛋白，其包含含有可操作地連接至缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的可變結構域免疫球蛋白樣鏈之一，或(ii)同二聚體單結構域抗原結合蛋白，其包含兩個免疫球蛋白樣鏈，所述每一個免疫球蛋白樣鏈包含可操作地連接至缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的可變結構域。在各個方面，同二聚體單結構域抗原結合蛋白包含兩個相同的免疫球蛋白樣鏈，所述每一個免疫球蛋白樣鏈包含可操作地連接至相同的缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的相同的可變結構域。另外，單結構域抗原結合蛋白的每一個免疫球蛋白樣鏈包含連接至在重鏈恒定區(qū)基因(例如，IgG、IgA、IgE、IgD或其組合)的CH1編碼序列(和，任選地，鉸鏈區(qū))中包含缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū)(CH)基因序列的可變結構域，所述可變結構域可來源于重鏈可變區(qū)基因區(qū)段(例如，VH、DH、JH)、輕鏈基因區(qū)段(例如，VL、JL)或其組合。包含來源于重鏈基因區(qū)段的可變結構域的單結構域抗原結合蛋白可被稱為“VH-單結構域抗體”或“VH-單結構域抗原結合蛋白”。包含來源于輕鏈基因區(qū)段的可變結構域的單結構域抗原結合蛋白可被稱為“VL-單結構域抗原結合蛋白”。如上所公開的，通過經工程化以產生單結構域抗原結合蛋白的非人動物的單結構域抗原結合蛋白的產生，導致相較于常規(guī)抗體相對低的響應于抗原的抗原特異性單結構域抗原結合蛋白的表達。本領域表明只有當幾乎無至無重排的輕鏈表達時才可能產生高滴度。具體地，有人斷言不表達重排的輕鏈的動物能夠產生較高水平的特異性結合抗原的單結構域抗原結合蛋白。Janssens等(2006)PNAS103:15130-15135；Zou等(2004)J.Exp.Med.204:3271-32。與本領域相反，本文中提供的數據顯示表達經遺傳工程化的單一重排的輕鏈的動物將在攻擊后生成高滴度的抗原特異性單結構域抗原結合蛋白。本文中還顯示了輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段與包含在CH1序列中的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū)重排和組合以編碼能夠特異性結合抗原的VL-單結構域抗原結合蛋白的能力。此類VL-單結構域抗原結合蛋白的輕鏈可變結構域有可能通過在重排的輕鏈可變區(qū)基因序列中添加例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或更多個N添加來補償同源輕鏈的缺少，在從內源和未經修飾的免疫球蛋白輕鏈基因座重排的輕鏈可變區(qū)基因序列中通常未看到所述添加。因此，在一個方面，提供了非人動物，其中所述動物包含單結構域抗原結合蛋白和經遺傳工程化的單一重排的輕鏈，例如，共同輕鏈，其中單結構域抗原結合蛋白的至少一個重鏈缺少功能性CH1結構域。在另一個方面，提供了非人動物，其中所述動物包含含有輕鏈可變區(qū)和缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的VL-單結構域抗原結合蛋白。在另一個方面，提供了非人動物，其中所述動物包含含有輕鏈可變區(qū)和缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)以及經遺傳工程化的單一重排的輕鏈，例如，共同輕鏈的VL-單結構域抗原結合蛋白。還提供了產生經遺傳修飾的非人動物的方法、從經遺傳修飾的非人動物分離的蛋白質(例如，單結構域抗原結合蛋白)、細胞，以及從所述經遺傳修飾的動物分離蛋白質和細胞的方法。術語“高親和力”抗體是指具有約10-9M或更低(例如，約1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或約1x10-12M)的針對其靶表位的KD的抗體。在一個實施方案中，通過表面等離子體共振技術例如BIACORETM測量KD；在另一個實施方案中，通過ELISA測量KD。術語“細胞”包括適合用于表達重組核酸序列的任何細胞。細胞包括原核生物和真核生物的那些細胞(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如，大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬種(Bacillusspp.)、鏈霉菌屬種(Streptomycesspp.)的菌株等)、分枝桿菌屬(mycobacteria)的細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、甲醇畢赤酵母(P.methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如，SF-9、SF-21、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾細胞等)、非人動物細胞、人細胞或細胞融合物諸如，例如，雜交瘤或四重雜交瘤。在一些實施方案中，所述細胞是人細胞、猴細胞、猿細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞或小鼠細胞。在一些實施方案中，所述細胞是真核細胞并且選自以下細胞：CHO(例如，CHOK1、DXB-11CHO、素食者-CHO)、COS(例如，COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎細胞(例如，HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60、(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、塞爾托利氏細胞(Sertolicell)、BRL3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞和來源于前述細胞的細胞系。在一些實施方案中，所述細胞包含一個或多個病毒基因，例如表達病毒基因的視網膜細胞(例如，PER.C6TM細胞)。術語"保守的”，當用于描述保守氨基酸取代時，包括具有擁有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的側鏈R基因的另一種氨基酸殘基對氨基酸殘基的取代。一般地，保守氨基酸取代基本上不會改變蛋白質的目標功能性質，例如，可變區(qū)以所需親和力特異性結合靶表位的能力。具有擁有相似化學性質的側鏈的氨基酸的組的實例包括脂肪族側鏈諸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；脂肪族-羥基側鏈諸如絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺側鏈諸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族側鏈諸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側鏈諸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性側鏈諸如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫側鏈諸如半胱氨酸和甲硫氨酸含硫。保守氨基酸的取代組包括，例如，纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、賴氨酸/精氨酸、丙氨酸/纈氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些實施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸對蛋白質中的任何天然殘基的取代，如在例如丙氨酸掃描誘變中使用的。在一些實施方案中，產生在于Gonnet等(1992)ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequenceDatabase,Science256:1443-45(據此通過引用并入)中公開的PAM250對數似然矩陣中具有正值的保守取代。在一些實施方案中，所述取代是其中取代在PAM250對數似然矩陣中具有非負值的中度保守取代。在一些實施方案中，免疫球蛋白輕鏈或重鏈的殘基位置相異在于一個或多個保守氨基酸取代。在一些實施方案中，免疫球蛋白輕鏈或其功能性片段(例如，允許表達并且從例如B細胞分泌的片段)中的殘基位置與其氨基酸序列列于本文中的輕鏈不相同，但相異在于一個或多個保守氨基酸取代。短語“表位結合蛋白”或"抗原結合蛋白"包括具有至少一個CDR并且能夠選擇性識別表位，例如能夠以為約1微摩爾或更低的KD(例如，為約1x10-6M、1x10-7M、1x10-9M、1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或約1x10-12M的KD)結合表位的蛋白質。治療性表位結合蛋白(例如，治療性結合蛋白)通常需要在納摩爾或皮摩爾范圍內的KD。短語“功能性片段”包括可被表達、分泌并以在微摩爾、納摩爾或皮摩爾范圍內的KD特異性結合表位的表位結合蛋白的片段。特異性識別包括具有至少在微摩爾范圍、納摩爾范圍或皮摩爾范圍內的KD。關于序列比較的術語"同一性"包括如通過本領域中已知的可用于測量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的許多不同算法中的任一種測定的同一性。在一些實施方案中，如本文所述的同一性使用ClustalW1.83版(slow)比對，采用10.0的開放空位罰分、0.1的延伸空位罰分以及使用Gonnet相似性矩陣(MACVECTORTM10.0.2,MacVectorInc.,2008)來測定。術語“同一性”包括多聚分子之間，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的整體關聯性。在一些實施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，則所述聚合分子被認為與所述另一個聚合分子“基本上相同”。正如本領域技術人員所理解的，多種算法是可用的，其允許序列的比較以測定其同源程度，包括通過在考慮不同序列中哪些殘基彼此“對應”時，在一個序列中相對于另一個序列允許指定長度的空位。兩個核酸序列之間的百分比同一性的計算，例如，可通過為了最佳比較目的而對齊兩個序列來進行(例如，為了最佳比對可在第一和第二核酸序列之一或兩者引入空位，并且為了比較目的，可忽略非對應序列)。在某些實施方案中，為了比較目的而對齊的序列的長度為參照序列的長度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。隨后比較對應核苷酸位置上的核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中對應位置相同的殘基占據時，則所述分子在該位置相同。兩個序列之間的百分比同一性是序列共有的相同位置的數目的函數，考慮到了為了兩個序列的最佳比對需要引入的空位數目和每個空位的長度。用于測定兩個核苷酸序列之間的百分比同一性的代表性算法和計算機程序包括，例如，已被整合進ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)，該算法使用PAM120加權殘基表、12的空位長度罰分和4的空位罰分)。兩個核苷酸序列之間的百分比同一性可選擇地，例如使用GCG軟件包中的GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩陣來測定。短語“微摩爾范圍”旨在意指1-999微摩爾；短語“納摩爾范圍”旨在意指1-999納摩爾；短語“皮摩爾范圍”旨在意指1-999皮摩爾。術語"可操作地連接的"是指其中可操作連接的組分以其預期方式起作用的關系。在一種情況下，編碼蛋白質的核酸序列可操作地連接至調控序列(例如，啟動子、增強子、沉默子序列等)，以保持恰當的轉錄調控。在一種情況下，免疫球蛋白可變區(qū)(或V(D)J區(qū)段)的核酸序列可操作地連接至免疫球蛋白恒定區(qū)的核酸序列，以使得序列之間恰當重組成重排的免疫球蛋白重或輕鏈基因序列。關于基因替換，術語“替換”是指將外源遺傳物質置于內源基因的基因座中，從而用直系同源或同源核酸序列替換所述內源基因的全部或部分。術語"非人動物"旨在包括任何脊椎動物諸如圓口類動物、硬骨魚類、軟骨魚類諸如鯊魚和鰩魚、兩棲動物、爬行動物、哺乳動物和鳥類。合適的非人動物包括哺乳動物。合適的哺乳動物包括非人靈長類動物、山羊、綿羊、豬、狗、牛和嚙齒類動物。在本發(fā)明的一些方面，所述非人動物包括例如跳鼠總科或鼠總科的小型哺乳動物。在一個實施方案中，所述經遺傳修飾的動物是嚙齒類動物。在一個實施方案中，嚙齒類動物選自小鼠、大鼠、松鼠、豪豬或倉鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒類動物選自鼠總科。在一個實施方案中，所述經遺傳修飾的動物來自選自從麗倉鼠科(例如，小鼠樣倉鼠)、倉鼠科(例如，倉鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘小鼠、冠鼠)、馬島鼠科(攀鼠、巖鼠、白尾鼠、馬達加斯加大鼠和小鼠)、豬尾鼠科(例如，刺榛睡鼠)和鼴形鼠科(例如，鼴鼠屬、竹鼠和鼢鼠)的科。在具體的實施方案中，經遺傳修飾的嚙齒類動物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘小鼠和冠鼠。在一個實施方案中，經遺傳修飾的小鼠來自鼠科的成員。在一個實施方案中，所述動物是嚙齒類動物。在具體的實施方案中，嚙齒類動物選自小鼠和大鼠。在一個實施方案中，所述非人動物是小鼠。在具體的實施方案中，所述非人動物是嚙齒類動物，其為選自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一個實施方案中，所述小鼠為選自由為以下品系的品系組成的組的129品系：129P1、129P2、129P3,129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(參見，例如，Festing等(1999)Revisednomenclatureforstrain129mice,MammalianGenome10:836，也參見，Auerbach等(2000)EstablishmentandChimeraAnalysisof129/SvEv-andC57BL/6-DerivedMouseEmbryonicStemCellLines)。在具體的實施方案中，所述經遺傳修飾的小鼠是前述129品系與前述C57BL/6品系的混合物。在另一個具體的實施方案中，所述小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在具體的實施方案中，所述混合物的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一個實施方案中，所述小鼠是BALB品系，例如，BALB/c品系。在另一個實施方案中，所述小鼠是BALB品系與另一個前述品系的混合物。在一個實施方案中，所述非人動物是大鼠。在一個實施方案中，所述大鼠選自Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠(DarkAgouti)。在一個實施方案中，所述大鼠品系是選自由Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠組成的組的兩個或更多個品系的混合物。如本文中所用，“經遺傳工程化的”、“經遺傳修飾的”等包括導致例如通過動物的非天然多肽的產生的核酸序列的人工操作、修飾和/或重組。用于單結構域抗原結合蛋白的產生的經遺傳工程化的動物本文中提供了經遺傳修飾的非人動物，其包含(a)單結構域抗原結合蛋白，例如，VH-或VL-單結構域結合蛋白，其可各自由經修飾的免疫球蛋白重鏈基因座中的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)基因序列編碼，所述免疫球蛋白重鏈基因座含有一個或多個其中功能性CH1結構域已失活和/或被去除然而保留完整IgMCH1恒定區(qū)的非IgM免疫球蛋白恒定區(qū)，和/或(b)經遺傳工程化的單一重排的輕鏈，其可由輕鏈基因座中的單一重排的可變基因序列，例如，被插入免疫球蛋白κ基因座的單一重排的Vκ:Jκ基因序列編碼?？贵w用作人治療劑。單結構域結合蛋白也用作人治療劑。因為單結構域結合蛋白缺少輕鏈，因此它們比含有輕鏈的抗體更小，從而預期表現出比含有輕鏈的抗體更好的組織穿透力，又具有相似的或更有利的藥代動力學特征，并且還保留相較于常規(guī)抗體相似的效應子功能。因為它們較小，因此單結構域結合蛋白也能夠在給定的體積中以較高的劑量進行施用。施用結合蛋白的常用方法是通過皮下注射，并且對于給定劑量的抗體的施用體積的減小可為患者提供益處，并且避免因大體積的皮下注射而引起的并發(fā)癥和疼痛。單結構域結合蛋白的另一個有利方面是通過使具有針對單一治療劑中的兩個不同表位的特異性的免疫球蛋白鏈異二聚化來產生雙特異性抗體的能力。因為單結構域結合蛋白缺少輕鏈，因此它們特別適合用于產生雙特異性抗體，因為不存在可產生可干擾另一條鏈的結合親和力或特異性的輕鏈的輕鏈重排。駱駝中，某些魚中以及病理病況中的觀察揭示，在某些情況下，在其重鏈恒定區(qū)中缺少功能性CH1結構域的結合蛋白可在同源輕鏈不存在的情況下表達。因此，在一個實施方案中，結合蛋白可被稱為“單結構域結合蛋白”，其在本領域也被公知為缺乏包含輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的輕鏈的抗體，即，只包含一個或兩個各自包含重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白多肽鏈的“只有重鏈的抗體”，其中只有重鏈的抗體的免疫球蛋白多肽鏈的至少一個缺少功能性CH1結構域。關于只有重鏈的抗體的教導見于本領域中，例如，參見PCT公布WO02085944、WO02085945、WO2006008548和WO2007096779。也參見美國專利第5,840,526號；美國專利第5,874,541號；美國專利第6,005,079號；美國專利第6,765,087號；美國專利第5,800,988號；EP1589107；WO9734103；和美國專利第6,015,695號(通過引用并入本文)。經遺傳修飾以產生只有重鏈的抗原結合蛋白的非人動物在本領域中是公知的。參見，例如，Janssens等(2006)PNAS103:15130-15135；Zou等(2004)J.Exp.Med.204:3271-32。例如，已被遺傳修飾來例如在免疫球蛋白G(IgG)基因中缺少功能性CH1序列，隨后表達單結構域抗原結合蛋白的動物，特別是嚙齒類動物(例如，小鼠)。雖然對駱駝、某些魚中和病理病況的觀察揭示，在某些情況下，缺少其重鏈恒定區(qū)的CH1結構域的結合蛋白可在同源輕鏈不存在的情況下表達，抗體生成B細胞的正常發(fā)育通常需要CH1結構域的存在。所有重鏈同種型(包括IgM)包含CH1結構域。替代輕鏈和同源輕鏈被認為在IgM的情況下通過重鏈的CH1結構域與給定的重鏈相互作用。在一定程度上，單結構域結合蛋白的開發(fā)依賴于IgM同種型重鏈的結構完整性或功能性，IgM的結構完整性或功能的破壞將是不期望的。抗體的正常開發(fā)需要抗體從始至終在多次復合物選擇方案后保存下來，這導致功能性和有用的抗體的保存和最終表達?？贵w結構的破壞可被證明對抗體的保存和最終表達不利，達到結構破壞導致抗體不能效地競爭和演化至一個或多個天然抗體選擇方案的滿意度的程度。在抗體開發(fā)早期，抗體重鏈經歷選擇過程，在所述選擇過程中，自然通過多種選擇方案選擇合適的重鏈來經歷進一步選擇以最終形成功能性和親和力成熟的抗體。從祖先B細胞(或，原-B細胞)中的重組重鏈基因區(qū)段表達的抗體重鏈通常與替代輕鏈配對，以IgM同種型的形式呈現在原B細胞的表面上，以形成稱為前B細胞受體或前BCR的結構(其包括其它共受體)。一旦前BCR被呈現在細胞表面上，所述前BCR被認為就向細胞發(fā)出其復合物正確形成的信號，從而有效地指示細胞重鏈已通過該早期選擇步驟。因此細胞被告知所述重鏈可經歷進一步選擇。如果所述重鏈含有當在IgM和替代輕鏈的情況下呈遞時對前BCR的形成不利的缺陷，則所述細胞將經歷細胞凋亡。如果所述細胞經歷細胞凋亡，則重鏈的重鏈可變區(qū)的有用性或對多樣性的貢獻將損失。因此，抗體選擇中的非常早的步驟需要在IgM同種型的情況下將重鏈與替代輕鏈一起呈遞。替代輕鏈被認為至少部分地過IgM的CH1結構域與IgM相互作用。在該早期接合時的抗體結構的失效或破壞(例如，無功能的CH1結構域)可導致克隆選擇失敗，表達重鏈的原B細胞的損失，以及使用有用抗體中的特定重鏈可變結構域的可能性的喪失。一旦具有前BCR的細胞通過該選擇步驟，則下一選擇步驟需要重鏈與同源輕鏈(例如，在小鼠和人中κ或λ)配對。配對的重鏈/同源輕鏈結構再次在IgM同種型的情況下通過IgM的CH1結構域被呈遞在細胞(現為初始前B細胞)的表面上。表面上的該復合物產生功能性膜結合的B細胞受體(BCR)。該BCR被認為向細胞發(fā)出所述信號指示重鏈適合用于進一步選擇，以及所述細胞現可負責表達該特定輕鏈和進行至進一步的B細胞成熟步驟，包括親和力成熟和類別轉換。如果所述重鏈包含當在IgM及其同源輕鏈的情況下呈遞時對BCR的形成不利的缺陷，則所述細胞將經歷細胞凋亡。如果所述細胞經歷細胞凋亡，則所述重鏈的重鏈可變區(qū)的有用性或對多樣性的貢獻將損失。因此，抗體選擇中的非常早的步驟需要在IgM同種型的情況下將重鏈與同源替代輕鏈一起呈遞。再次地，在該早期接合時抗體結構的失效或破壞(例如，無功能的CH1結構域)可導致表達重鏈的前B細胞的克隆選擇失敗和伴隨的損失。在到目前為止經選擇保存下來后，在IgM的情況下呈遞與其同源輕鏈配對的重鏈的前B細胞隨后經歷成熟過程，所述成熟過程最終導致類別轉換和進一步的選擇機制，其中所述重鏈和同源輕鏈在IgG同種型的情況下被呈遞在B細胞表面上。在該步驟中缺少CH1結構域或缺少CH1結構域和鉸鏈區(qū)的IgG重鏈的任何選擇將發(fā)生。在根據本發(fā)明的動物中，有人認為增加的重鏈基因座中的可變區(qū)的庫可用于基于可變結構域是否保存下來以在缺少CH1結構域或缺少CH1結構域和鉸鏈區(qū)的IgG重鏈中表達的選擇。相反地，具有受損的IgM的小鼠可能不提供重鏈可變區(qū)的完全庫，因為只有能夠在于受損的IgM的情況下經歷選擇而保存下來的那些可變區(qū)才可用于類別轉換。因此，缺少功能性IgM的動物可經歷在另外的合適的重鏈可變基因區(qū)段重排后產生B細胞群體的能力的顯著降低。在這樣的情況下，即使當供給充足的可變區(qū)是可獲得的(即，所述動物具有適當數目的能夠在例如重鏈免疫球蛋白基因座中重排和可操作地連接至重鏈恒定區(qū)的可變區(qū)基因區(qū)段)的時候，展示所需程度的多樣性的令人滿意的B細胞群體可能因在選擇過程中減少重鏈的保存的IgM損傷而不形成。期望維持適當數目的可在IgM的情況下在于B細胞發(fā)育過程中呈遞時有效地經選擇保存下來的重鏈免疫球蛋白基因座中的重排的可變區(qū)，以通過用目標免疫原免疫非人動物產生足夠的多樣性來產生抗體。因此，在免疫球蛋白重鏈中包含無功能的CH1結構域或無功能的CH1結構域和任選地無功能的鉸鏈區(qū)的經遺傳修飾的非人動物應當在IgM等位基因之一或兩者中不包含CH1缺失。US2011/0145937(其通過引用并入本文)中公開的此類動物表現出至IgG恒定基因區(qū)(其中CH1結構域已缺失或失活)的類別轉換，并且表達單結構域表面IgG(B細胞受體)，所述單結構域表面IgG1)折疊并在細胞表面上表達而無輕鏈伴侶，以及2)在輕鏈不存在的情況下仍然識別抗原，以被抗原刺激和選擇。在本發(fā)明的不同實施方案中，提供了經遺傳修飾的非人動物，所述非人動物產生缺少CH1結構域的結合蛋白，包括單結構域抗原結合蛋白，諸如但不限于VH和VL單結構域結合蛋白。所述經遺傳修飾的非人動物可包含遺傳修飾，其包括功能性免疫球蛋白重鏈結構域(CH1結構域)例如IgG1CH1結構域的缺少，以及在一些實施方案中在缺少功能性CH1結構域的免疫球蛋白重鏈中包含鉸鏈區(qū)的缺失的進一步修飾，其中所述非人動物表達功能性IgM。其它修飾包括使得除IgG1和IgM外的同種型無功能，例如，對于IgD、IgG3、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgA和IgE，在基因中產生缺失、或產生基因的缺失或在基因中產生失活突變，諸如IgD、IgG3、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgA和IgE的CH1結構域或鉸鏈區(qū)的缺失或失活突變。還提供了用于產生非人動物、非人胚胎和細胞的經遺傳修飾的非人胚胎、細胞和靶向構建體。還提供了用于產生動物的組合物和方法，所述動物產生缺少免疫球蛋白CH1結構域(和任選地鉸鏈區(qū))的結合蛋白，包括單結構域抗原結合蛋白，其可包含VH結構域(例如，內源的或人VH結構域)或VL結構域(例如，人VL結構域)。所述方法包括選擇性地使內源非IgMCH1區(qū)無功能(例如，通過CH1結構域的序列的缺失或失活)，和在內源可變區(qū)基因座中使用未重排的內源重鏈可變區(qū)(HCVR)基因區(qū)段、未重排的人可變區(qū)(hHCVR)基因區(qū)段或未重排的人輕鏈可變區(qū)(hLCVR)來在非人中產生嵌合人結合蛋白。在一個或多個免疫球蛋白恒定區(qū)基因(例如，IgG1、IgD、IgG3、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgA或IgE基因)中但非在IgM基因中產生CH1結構域的缺失。在其中缺失存在于IgG中的實施方案中，該方法選擇性地使一個或多個IgGCH1結構域無功能，然而保留功能性IgM。除了一個或多個IgGCH1結構域的缺失以外，其它實施方案還提供了使缺少功能性CH1結構域的IgG的鉸鏈區(qū)缺失或使所述鉸鏈區(qū)無功能。在該特定的實施方案中，IgGCH1缺失法在動物的天然B細胞發(fā)育中使用相對保守的破壞，因為并非所有經遺傳修飾的非人動物的Ig同種型將表現出無功能的CH1或CH1結構域(和，任選地鉸鏈)的缺失。因此，CH1修飾不在IgM分子中進行，并且從而不影響依賴于具有功能性CH1的IgM的早期B細胞發(fā)育中的如上所述的這些步驟。因為不修飾IgM，因此具有IgG的CH1結構域(和任選地IgG的鉸鏈區(qū))而非IgM的CH1結構域的一個或多個缺失的動物，應當能夠在IgG的情況下呈現可變結構域之前，在克隆選擇步驟中加工令人滿意地大的可變區(qū)的庫。因此在各個實施方案中，遺傳修飾對可用于單結構域結合蛋白的可變區(qū)的多樣性的任何不利作用應當不會負面影響可用于在IgG情況下的選擇的可變區(qū)的庫。另外，當被使得在種系中無功能(例如，缺失)的CH1序列為IgG1時，動物將缺乏產生編碼CH1結構域的任何RNA的能力。遺傳修飾非人動物以使得CH1結構域或CH1結構域和任選地一個或多個非IgM免疫球蛋白同種型的鉸鏈區(qū)無功能，可產生能夠從V區(qū)基因區(qū)段(例如VH或VL區(qū))的完全或基本上完全的庫選擇合適的V區(qū)來在單結構域結合蛋白中表達的動物。選擇性修飾IgG同種型(而非IgM)避免了因CH1結構域的缺少或IgM中的CH1結構域的缺少而導致的經選擇保存下來的可變區(qū)數目的潛在減少。因此，更完全的V區(qū)的庫可用于在IgG(缺少CH1結構域或缺少CH1結構域和缺少鉸鏈區(qū)的)的情況下的選擇。因此，根據本發(fā)明的經遺傳修飾的動物中的V結構域的選擇，不依賴于例如哪個V結構域可能幫助克服歸因于經修飾的IgM結構的早期IgM-依賴性B細胞發(fā)育障礙。相反地，早期IgM依賴性步驟應當如常發(fā)生，從而導致可用于針對它們在缺少CH1結構域或缺少CH1結構域和缺少鉸鏈區(qū)的IgG的情況下表達的適宜性的選擇的大的重鏈庫。因此，在各個實施方案中，根據本發(fā)明的經遺傳修飾的動物應當保持功能性IgM表達，所述表達應當提供更加天然的克隆選擇過程的機會。例如，借助于功能性IgM(例如，包含功能性CH1結構域的IgM)，替代輕鏈和同源輕鏈均能夠通過IgM的CH1結構域締合并參與早期B細胞發(fā)育中的選擇過程。在根據本發(fā)明的經遺傳修飾的動物中，認為至IgG同種型的類別轉換是第一選擇步驟，在所述第一選擇步驟中遇到可在缺少功能性CH1結構域或缺少功能性CH1結構域和功能性鉸鏈的恒定結構域的情況下表達的重鏈可變結構域的任何選擇。在各個實施方案中，包含在CH1結構域中的缺失或失活突變的非人動物中的非IgM重鏈恒定區(qū)是非人重鏈恒定區(qū)，例如，內源非人重鏈恒定區(qū)。在另一個實施方案中，包含在CH1結構域中的缺失或失活突變的非人動物中的非IgM重鏈恒定區(qū)是人重鏈恒定區(qū)。在其中動物額外地包含可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的單一重排的輕鏈基因序列的其它實施方案中，所述輕鏈恒定區(qū)是非人輕鏈恒定區(qū)，例如，內源非人輕鏈恒定區(qū)；或所述輕鏈是人輕鏈恒定區(qū)。VL-單結構域結合蛋白，例如，具有輕鏈可變結構域的單結構域抗原結合蛋白本文中提供了經遺傳修飾的非人動物，其包含兩種類型的單結構域抗原結合蛋白：(1)VH單結構域結合蛋白，其由重排的重鏈可變區(qū)基因序列編碼，和(2)VL單結構域結合蛋白，其由重排的輕鏈可變區(qū)基因序列編碼，每一個所述基因序列也由含有一個或多個非IgM免疫球蛋白恒定區(qū)的經修飾的免疫球蛋白重鏈基因座編碼，在所述非IgM免疫球蛋白恒定區(qū)中，功能性CH1結構域已失活和/或被去除，然而保留完整的IgMCH1恒定區(qū)。因此，在一個實施方案中，本文中提供了經遺傳工程化以包含可操作地連接至重鏈恒定區(qū)的輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段，例如，Vκ、Jκ、Vλ和/或Jλ基因區(qū)段的重鏈基因座。使重鏈基因座包含輕鏈可變區(qū)的遺傳工程已被描述。例如，在美國專利申請第20120096572號(其通過引用整體并入本文)中，描述了包含含有一個或多個輕鏈可變區(qū)VL和/或JL基因區(qū)段對一個或多個、基本上所有或所有免疫球蛋白重鏈可變區(qū)VH、DH和/或JH基因區(qū)段的替換的免疫球蛋白重鏈基因座的非人動物的產生。本領域技術人員將容易地認識到，替換性VL和/或JL基因區(qū)段可包含未重排的VL和/或未重排的JL基因區(qū)段，所述基因區(qū)段能夠經歷有效重排。另外，所述VL和/或JL基因區(qū)段可以是選自Vκ、Jκ、Vλ、Jλ基因區(qū)段的一個或多個區(qū)段，并且可以是其組合。在一個實施方案中，所述一個或多個重鏈可變區(qū)基因區(qū)段被允許產生具有人獨特型的可變結構域的一個或多個人輕鏈可變基因區(qū)段替換。如本文中所提供的，經遺傳工程以包含可操作地連接至重鏈恒定區(qū)的輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段，例如，Vκ、Jκ、Vλ和/或Jλ基因區(qū)段的重鏈基因座可經歷有效基因重排，以甚至當使所述重鏈恒定區(qū)的一個或多個結構域或基因區(qū)段失活或缺失時，形成免疫球蛋白鏈。如本文中所示，與例如，IgG1基因基因中的CH1結構域的缺失偶聯的輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段對重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的替換，導致具有輕鏈可變區(qū)的單結構域抗原結合蛋白。具體地，kappa(κ)V和J基因區(qū)段(Vκ和Jκ)對重鏈基因座的內源重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的替換產生可操作地連接至重鏈恒定區(qū)的κ可變區(qū)(KoH)。使CH1結構域缺失的對重鏈基因座的進一步修飾(CH1缺失)產生編碼包含輕鏈可變區(qū)和缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白多肽鏈的免疫球蛋白基因座(KoHCH1缺失)，其中所述免疫球蛋白多肽鏈可形成單結構域抗原結合蛋白，例如，VL-單結構域抗原結合蛋白。因此，在一些實施方案中，提供了經遺傳修飾的非人動物，所述非人動物包含含有可操作地連接至缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的輕鏈可變結構域的VL單結構域結合蛋白，其中所述免疫球蛋白多肽鏈可形成單結構域抗原結合蛋白，所述單結構域抗原結合蛋白可由包含一個或多個非IgM免疫球蛋白恒定區(qū)的經修飾的免疫球蛋白重鏈基因座中的輕鏈可變區(qū)基因序列編碼，在所述非IgM免疫球蛋白恒定區(qū)中功能性CH1結構域已失活和/或被去除，然而保留完整的IgM恒定區(qū)。本文中描述的方面包括包含由雜交免疫球蛋白基因編碼的雜交鏈的VL結合蛋白，所述雜交免疫球蛋白基因包含或來源于，優(yōu)選未重排的人VL基因區(qū)段(或其部分)和優(yōu)選未重排的人JL基因區(qū)段(或其部分)，以及更優(yōu)選與人JL基因區(qū)段(或其部分)重排的人VL基因區(qū)段(或其部分)，所述人VL基因區(qū)段(或其部分)和人JL基因區(qū)段(或其部分)可操作地連接至編碼一個或多個重鏈恒定區(qū)基因(例如，IgM、IgD、IgG、IgA或IgE)的核苷酸序列，其中所述IgD、IgG、IgA或IgE基因包含在CH1編碼序列中的缺失或失活突變。VL結合蛋白、抗原結合VL蛋白等包括包含抗原結合位點(含有兩個輕鏈可變結構域)的抗原結合蛋白。在一個實施方案中，VL結合蛋白的至少兩個輕鏈可變結構域是同源的。在一些實施方案中，兩個輕鏈可變結構域的每一個由輕鏈可變區(qū)(VL)基因區(qū)段和/或輕鏈連接區(qū)(JL)基因區(qū)段編碼或來源于其。在優(yōu)選實施方案中，兩個輕鏈可變結構域之一可以是雜交免疫球蛋白鏈的部分，并且所述兩個輕鏈可變結構域的另一個可以是免疫球蛋白輕鏈(L)的部分。如本文中所用，短語“免疫球蛋白雜交鏈”、“雜交鏈”、“雜交免疫球蛋白鏈”等是指從氨基端至羧基端包含輕鏈可變結構域(其可以被或可以不被體細胞突變)和重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白蛋白。通常地，雜交鏈由可操作地連接至重鏈恒定區(qū)基因序列的重排的輕鏈可變區(qū)基因序列編碼。如本文中所公開的，VL-單結構域結合蛋白包含雜交鏈，其中所述雜交鏈由可操作地連接至具有在CH1編碼序列中的缺失或失活突變的重鏈恒定區(qū)基因序列的重排的輕鏈可變區(qū)基因序列編碼。雜交免疫球蛋白鏈的輕鏈可變區(qū)基因序列通?？砂瑏碜暂p鏈可變(VL)基因區(qū)段(或其部分)和輕鏈連接(JL)基因區(qū)段(或其部分)的序列。在優(yōu)選實施方案中，編碼雜交鏈可變結構域的輕鏈可變區(qū)基因序列，例如，重排的VL-JL基因序列來源于未重排的VL和JL基因區(qū)段，優(yōu)選地種系未重排的VL-和JL-基因區(qū)段的庫，所述未重排的VL和JL基因區(qū)段(a)能夠經歷有效基因重排，例如，能夠重排以形成框內輕鏈可變區(qū)基因序列和(b)可操作地連接至一個或多個重鏈恒定區(qū)基因區(qū)段，例如，未重排的恒定區(qū)基因區(qū)段的簇或一個恒定區(qū)基因區(qū)段。在輕鏈基因區(qū)段重排后，獲得包含與編碼重鏈恒定區(qū)的序列融合的編碼輕鏈可變區(qū)的序列的重排的核苷酸序列。該序列編碼具有與重鏈恒定結構域融合的輕鏈可變結構域的雜交免疫球蛋白鏈。因此，在一個實施方案中，如本文中所公開的雜交免疫球蛋白從N端至C端基本上由VL結構域和CH結構域組成。在一個實施方案中，所述CH結構域包含功能性CH1區(qū)(在IgM的情況下)、鉸鏈、CH2區(qū)、CH3區(qū)和任選地CH4區(qū)。在另一個實施方案中，所述CH結構域缺少功能性CH1區(qū)，例如，缺少完整或部分的CH1區(qū)，和可例如在IgG、IgA、IgE和/或IgD的情況下額外地缺少鉸鏈區(qū)。在另一個實施方案中，所述CH結構域缺少功能性CH1區(qū)，例如，缺少完全的或部分的CH1區(qū)，并且可額外地缺少其它非IgM同種型恒定區(qū)。本文所述的經修飾的非人動物可產生具有IgM同種型的VL結合蛋白，所述VL結合蛋白還包含與雜交鏈配對以產生VL結合蛋白的同源輕鏈，所述VL結合蛋白是抗體樣的，例如，可以是四聚體，但其中VL結合蛋白而非重鏈(或重鏈的對)包含雜交鏈(或雜交鏈的對)，所述雜交鏈包含與IgMCH結構域融合的VL結構域-而非VH結構域。由于本文中所公開的非人動物優(yōu)選包含具有功能性CH1結構域的IgM恒定區(qū)基因，因此本文中所公開的非人動物也包含導致VL結合蛋白(所述VL結合蛋白與一些常規(guī)抗體的四聚體結構相似，但相異在于結合特征)的表達，以及導致所述VL結合蛋白在所述非人動物的細胞的膜表面上的表達的免疫球蛋白基因座的人源化。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物能夠在VL結合蛋白的雜交鏈或輕鏈或雜交鏈和輕鏈上生成結合抗原的人VL結構域；在一些實施方案中，此類非人哺乳動物產生和/或具有表達結合蛋白的B細胞群體，所述結合蛋白包含不由任何VH、DH和/或JH基因區(qū)段序列編碼或不來源于其的可變結構域。在一些實施方案中，由此類非人動物表達的VL結合蛋白的特征在于所述抗原-結合部分只由人VL結構域組成。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含來自非人動物和異源物種(例如，人)的內源免疫球蛋白重鏈基因座遺傳物質，并且在內源免疫球蛋白輕鏈基因座中包含來自非人動物和異源物種(例如，人)的遺傳物質。在各個實施方案中，經修飾的非人動物產生VL單結構域結合蛋白，其中雜交鏈的VL結構域表現出相對于輕鏈的VL結構域增強的程度的體細胞高頻突變。在一些實施方案中，雜交鏈的VL區(qū)表現出為與CL區(qū)融合的VL區(qū)的約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍或更多倍的體細胞高頻突變。在一些實施方案中，所述經修飾的非人動物，例如，小鼠，響應于抗原，表現出包含雜交鏈的VL結構域的VL單結構域結合蛋白的群體，其中VL單結構域結合蛋白的群體在雜交鏈的VL結構域中表現出為由野生型小鼠響應于相同抗原表現出的在輕鏈(例如輕鏈的VL結構域)的群體中觀察到的平均體細胞高頻突變的平均約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或更多倍的體細胞高頻突變。在一個實施方案中，雜交鏈的VL結構域中的體細胞高頻突變包含在CDR3中的一個或多個或兩個或更多個N添加。在各個實施方案中，所述VL結合蛋白，例如，VL單結構域結合蛋白，包含含有由免疫球蛋白輕鏈序列編碼的可變結構域的雜交鏈，所述免疫球蛋白輕鏈序列包含比對于從內源輕鏈基因座重排(例如，形成與重鏈恒定區(qū)基因可接操作地連接的重排的可變區(qū)基因的VL和人JL基因區(qū)段重排)的輕鏈天然觀察到的N添加更大數目的N添加，其中所述重排的輕鏈可變區(qū)包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或更多個N添加。在各個實施方案中，如本文中所公開的VL結合蛋白，例如，VL-單結構域結合蛋白，例如，由本文中所公開的經遺傳修飾的非人動物例如小鼠產生的那些VL-單結構域結合蛋白可分別平均小于常規(guī)抗體或只有重鏈的抗體，并且具有與較小的尺寸相關的有利方面。較小的尺寸至少部分通過由DH區(qū)(通常存在于VH結構域中)編碼的氨基酸序列的不存在來實現。還可在來源于例如Vκ區(qū)和Jκ區(qū)的CDR3的形成中實現較小的尺寸。在一個方面，提供了包含免疫球蛋白雜交鏈基因座的非人動物，例如，小鼠。在一個實施方案中，在內源重鏈基因座內產生所述雜交鏈基因座，其中內源小鼠免疫球蛋白重鏈基因座中的一個或多個免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)基因區(qū)段、重鏈多樣性(DH)基因區(qū)段和重鏈連接(JH)基因區(qū)段被一個或多個輕鏈可變區(qū)(VL)基因區(qū)段和一個或多個輕鏈連接區(qū)(JL)基因區(qū)段替換，所述輕鏈可變區(qū)(VL)基因區(qū)段和輕鏈連接區(qū)(JL)基因區(qū)段重排，以形成與內源小鼠CH基因重組(以形成來源于VL基因區(qū)段、JL基因區(qū)段和內源小鼠CH基因的重排的基因)的重排的可變區(qū)VL/JL基因序列，其中所述CH基因是IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，并且其中所述IgD、IgG、IgA或IgE缺少功能性CH1結構域。在一個方面，提供了包含雜交鏈基因座的非人動物，所述雜交鏈基因座替換了內源免疫球蛋白重鏈基因座，例如，一個或兩個重鏈基因座的所有或基本上所有內源VH、DH和JH基因區(qū)段被一個或多個VL基因區(qū)段和一個或多個JL基因區(qū)段替換，所述VL基因區(qū)段和JL基因區(qū)段形成與內源小鼠CH基因重組(以形成來源于VL基因區(qū)段、JL基因區(qū)段和內源小鼠CH基因的重排的基因)的重排的可變區(qū)VL/JL基因序列，其中所述CH基因是IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，并且其中所述IgD、IgG、IgA或IgE缺少功能性CH1結構域.在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含包括未重排的人VL基因區(qū)段和/或人JL基因區(qū)段的免疫球蛋白雜交鏈基因座和包括未重排的人VL基因區(qū)段和/或人JL基因區(qū)段的免疫球蛋白輕鏈基因座。在一些實施方案中，本發(fā)明的非人動物包含包括未重排的人VL基因區(qū)段和/或人JL基因區(qū)段的免疫球蛋白雜交鏈基因座和，優(yōu)選地包括可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)基因序列的單一重排的人VL/JL可變區(qū)基因序列和編碼共同輕鏈的免疫球蛋白輕鏈基因座。表達單結構域結合蛋白和重排的輕鏈的經遺傳工程化的非人動物在另外的實施方案中，本文中提供了非人動物，所述非人動物包含(a)內編碼源免疫球蛋白重鏈基因座中的至少一個內源免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因的CH1結構域的核苷酸序列中的缺失或失活突變，其中所述至少一個內源免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因是IgG、IgA、IgE、IgD或其組合，(b)免疫球蛋白輕鏈基因座，所述基因座包含含有VL和JL基因區(qū)段序列的單一重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)VL/JL基因序列，其中所述單一重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因序列可操作地連接至免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)基因序列，以及例如編碼單一輕鏈，和任選地還包含(c)包含至少一個未重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)基因區(qū)段和至少一個未重排的免疫球蛋白輕鏈連接(JL)基因區(qū)段的核酸序列對內源免疫球蛋白重鏈基因座中的內源VH、DH、JH基因區(qū)段的替換，其中每一個所述未重排的VL和JL基因區(qū)段能夠重組，以形成重排的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL/JL)核苷酸序列，其可操作地連接至包含在編碼CH1結構域的核苷酸序列中的缺失或失活突變的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因。已描述了單一重排的輕鏈，例如，包含重排的輕鏈可變區(qū)的輕鏈的遺傳工程。例如，包含單一重排的可變基因序列VL:JL的通用輕鏈小鼠(ULC)的產生和那些小鼠中的抗原特異性抗體的生成描述于例如美國專利申請第13/022,759號、第13/093,156號、第13/412,936號、第13/488,628號、第13/798,310號和第13/948,818號(分別為公布第2011/0195454號、第2012/0021409號、第2012/0192300號、第2013/0045492號、第US20130185821號和第US20130302836號)中，所述每一個專利申請通過引用整體并入本文。經遺傳工程化的單一重排的輕鏈，例如，通用輕鏈的表達在IgM期的早期引起抗體的擴增，其中大量多樣性和從而抗原識別在重鏈上發(fā)生。不限定本發(fā)明，有人提出經遺傳工程化的單一重排的輕鏈在IgM期的早期的擴增將產生更多的細胞，所述細胞具有能夠保存下來以經歷至IgG同種型的類別轉換和在IgG(缺少功能性CH1結構域，或缺少功能性CH1結構域并且缺少功能性鉸鏈區(qū))的情況下的選擇的重或輕鏈可變區(qū)。因此，提供了經遺傳修飾的非人動物以及用于產生所述動物的方法和組合物，其中所述遺傳修飾導致不為IgM結構域的Ig結構域中缺少功能性CH1結構域(在其它實施方案中缺少功能性鉸鏈區(qū))，并且其中所述動物還表達經遺傳工程化的單一重排的輕鏈，例如，工程化的共同輕鏈(ULC)，其可與完整IgM締合。美國申請公布第2011/0195454號、第2012/0021409號、第2012/0192300號和第2013/0045492號中描述的經工程化的共同輕鏈小鼠包含編碼輕鏈選項(例如，包含不超過兩個VL基因區(qū)段或單一重排的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列的共同或通用輕鏈“ULC”)的有限庫的核酸序列。為了獲得該有限的庫，將小鼠工程化以使得其產生或重排天然小鼠輕鏈可變結構域的能力無功能或基本上無功能。在一個方面，這例如通過使小鼠的輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段缺失來實現。如先前所述，隨后可利用可操作地連接至內源小鼠輕鏈恒定結構域的所選擇的合適的外源輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段，優(yōu)選地人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段，以使得所述外源可變區(qū)基因區(qū)段可與內源小鼠輕鏈恒定區(qū)基因組合并形成重排的反向嵌合輕鏈基因(人可變，小鼠恒定)的方式來修飾內源小鼠基因座。在各個實施方案中，所述輕鏈可變區(qū)能夠被體細胞突變。在各個實施方案中，為了最大化所述輕鏈可變區(qū)獲得體細胞突變的能力，可在小鼠中保留適當的增強子。在一個方面，在修飾小鼠κ輕鏈基因座以用人κ輕鏈基因區(qū)段替換內源小鼠κ輕鏈基因區(qū)段時，功能性維持或不破壞小鼠κ內含增強子和小鼠κ3’增強子。因此，提供了表達與多種反向嵌合(人可變，小鼠恒定)重鏈締合的反向嵌合(人可變，小鼠恒定)輕鏈的有限庫的經遺傳工程化的小鼠。在各個實施方案中，使所述內源小鼠κ輕鏈基因區(qū)段缺失并用可操作地連接至內源小鼠Cκ基因的單一(或兩個)重排的人輕鏈區(qū)替換其。在用于最大化重排的人輕鏈區(qū)的體細胞高頻突變的實施方案中，維持小鼠κ內含增強子和小鼠κ3’增強子。在各個實施方案中，所述小鼠還包含無功能的λ輕鏈基因座，或其缺失或使得所述基因座不能產生λ輕鏈的缺失。因此，在一個實施方案中，本文中提供了非人動物(例如，嚙齒類動物，例如，小鼠或大鼠)，所述嚙齒類動物在其基因組中，例如在其種系中包含來自優(yōu)選地人輕鏈可變基因區(qū)段的有限庫的優(yōu)選地人輕鏈可變區(qū)或單一重排的人輕鏈可變區(qū)的有限庫，其中所述非人動物還包含在其基因組中，例如在其種系中于編碼CH1結構域的核苷酸序列中的缺失或失活突變。提供了經遺傳工程化的動物，所述動物表達來自人輕鏈可變區(qū)基因序列的有限庫的人輕鏈可變結構域或單一人輕鏈可變結構域的有限庫。在一個實施方案中，所述單一重排的V/J人輕鏈序列選自Vκ1-39Jκ和Vκ3-20Jκ，例如，Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1。在一些實施方案中，如本文中所公開的非人動物包含含有單一重排的V/J輕鏈序列對所有內源VL和所有內源JL基因區(qū)段的替換的經修飾的輕鏈基因座，其中所述單一重排的V/J輕鏈序列可操作地連接至內源輕鏈恒定區(qū)基因。在一些實施方案中，所述經修飾的輕鏈基因座存在于非人動物的種系基因組中。在一個實施方案中，所述非人動物在其種系基因組中包含可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)基因序列的單一重排的輕鏈可變基因序列，其中所述單一重排的輕鏈可變區(qū)基因序列包含人種系VL和人種系JL基因區(qū)段，例如，人種系Vκ1-39和人種系Jκ5或人種系Vκ3-20和Jκ1。在一些實施方案中，如本文中所公開的非人動物包含B細胞，例如，未曾經歷類別轉換的B細胞，所述B細胞在其基因組中包含可操作地連接至內源輕鏈恒定區(qū)基因的單一重排的V/J輕鏈序列，其中所述單一重排的V/J輕鏈相較于可操作地連接至在非人動物的種系基因組中發(fā)現的內源輕鏈恒定區(qū)基因的單一重排的V/J輕鏈序列，不包含體細胞突變。在其它實施方案中，如本文中所公開的非人動物包含B細胞，例如已經歷類別轉換的B細胞，所述B細胞在其基因組中包含可操作地連接至內源輕鏈恒定區(qū)基因的單一重排的V/J輕鏈序列，其中所述單一重排的V/J輕鏈相較于可操作地連接至在非人動物的種系基因組中發(fā)現的內源輕鏈恒定區(qū)基因的單一重排的V/J輕鏈序列，包含體細胞突變。產生經遺傳修飾的動物還提供了產生如本文中所公開的非人動物的方法。此類方法包括(a)使非人動物的重鏈免疫球蛋白基因座，諸如IgG1重鏈基因座的CH1結構域和任選地鉸鏈區(qū)失活或缺失，引入編碼經遺傳工程化的重排的輕鏈基因座的核酸，和使動物表達具有失活的CH1結構域的重鏈免疫球蛋白基因座和經遺傳重排的輕鏈基因座(ULC)。通過使用小鼠作為舉例說明，在本文中方便地描述了用于產生表達單結構域結合蛋白的動物的遺傳修飾，雖然此類修飾可被容易地改造以適用于或施用于其它動物?？梢砸远喾N方式來產生根據本發(fā)明的經遺傳修飾的動物，在下文中論述了所述方式的特定實施方案。在圖1(上方)中提供IgG1基因座的示例性示意圖(不按比例)顯示IgG1基因座中的CH結構域重排。如所舉例說明的，結構域CH1、CH2和CH3以及鉸鏈區(qū)以容易辨別的核苷酸跨度存在于轉換區(qū)的下游?？赏ㄟ^本領域已知的任何方法產生缺少編碼IgG1的CH1結構域的功能性核苷酸序列但含有鉸鏈區(qū)的經遺傳修飾的非人動物，例如，小鼠。例如，可產生用缺少CH1結構域但含有鉸鏈的截短的IgG1替換IgG1基因的靶向載體。在一個實例中，通過靶向構建體靶向小鼠基因組，所述靶向構建體具有5’(相對于基因組IgG1基因的轉錄的方向)同源臂(包含內源CH1結構域的上游序列)、隨后是編碼IgG1鉸鏈、IgG1CH2結構域、IgG1CH3結構域、藥物選擇盒(例如，lox化抗性基因)和IgG1跨膜結構域的核苷酸序列以及包含相對于跨膜結構域處于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重組和去除藥物選擇盒(例如，通過Cre處理)后，內源IgG1被缺少CH1結構域的IgG1替換(圖3)(IgG1ΔCH1；I)。在一些實施方案中，將表達IgG1的所得的基因座的結構具有與鉸鏈序列融合的J區(qū)序列?？赏ㄟ^本領域已知的任何方法產生缺少編碼IgG1的CH1結構域的核苷酸序列和缺少編碼鉸鏈區(qū)的核苷酸序列的經遺傳修飾的非人動物，例如，小鼠。例如，可產生用缺少編碼CH1結構域的序列以及缺少編碼鉸鏈區(qū)的序列的截短的IgG1替換IgG1基因的靶向載體。在另一個實施方案中，通過靶向構建體靶向小鼠基因組，所述靶向構建體具有5’(相對于基因組IgG1基因的轉錄方向)同源臂(含有內源CH1結構域的上游序列)、隨后是編碼IgG1CH2結構域、IgG1CH3結構域、藥物選擇盒(例如，lox化抗性基因)和IgG1跨膜結構域的核苷酸序列以及含有相對于跨膜結構域處于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重組和去除藥物選擇盒(例如，通過Cre處理)后，內源IgG1基因被缺少編碼CH1結構域的序列的IgG1基因替換(圖3)(IgG1ΔCH1&鉸鏈；II)。在一些實施方案中，所得的基因座的結構將表達具有與CH2結構域融合的J區(qū)序列的IgG1?？赏ㄟ^使一個或多個其它IgG同種型例如IgG2b和IgG2a/IgG2c，和/或一個或多個其它Ig同種型，例如，IgD、IgA和/或IgE缺失，通過使編碼這些同種型的序列缺失或功能性失能，來進一步修飾缺少IgG1CH1序列(IgG1ΔCH1)或缺少IgG1CH1序列以及缺少鉸鏈(IgG1ΔCH1&鉸鏈)的經遺傳修飾的非人動物，例如，小鼠，以有利于經修飾的IgG1同種型的使用。例如，產生靶向構建體，其具有5’同源臂(含有內源鉸鏈區(qū)序列的上游(或內源CH1結構域序列的上游)的序列)，編碼IgG1CH2和CH3結構域的序列，藥物選擇盒，隨后是編碼IgG1跨膜結構域的序列，隨后另一個藥物選擇盒(如果需要的話)，和含有相對于IgG2a/c基因處于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重組并去除藥物選擇盒(例如，通過Cre處理)后，內源重鏈恒定基因座只含有兩個IgG基因：內源IgG3和IgG1ΔCH1或IgG1ΔCH1&鉸鏈。(圖3)(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；III或IgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2b/2a；IV)。如上所述工程化的動物還可被進一步修飾來在重鏈基因座的IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgD、IgA和/或IgE基因區(qū)段中包含缺失或失活突變。例如，可產生缺失重鏈基因座的恒定區(qū)基因序列的靶向載體。在一個實例中，通過靶向構建體靶向小鼠基因組，所述靶向構建體具有5’(相對于基因組恒定區(qū)基因序列的轉錄方向)同源臂(含有內源IgM結構域的上游序列)，隨后是編碼藥物選擇盒的核苷酸序列(例如，lox化抗性基因)和含有IgA基因區(qū)段的下游離序列的3’同源臂。在于基因座中同源重組和去除藥物選擇盒(例如，通過Cre處理)后，使內源恒定區(qū)缺失和/或用可選擇標記替換其。(圖4C)。可用可被產生來重新引入IgM基因區(qū)段和IgG1基因(其缺少功能性CH1結構域序列和任選地缺少功能性鉸鏈區(qū))的靶向載體進一步修飾動物。(圖4D)。在一個實例中，通過靶向構建體靶向動物的基因組，所述靶向構建體具有含有可選擇標記基因的上游序列的5’同源臂，隨后是編碼完全IgM恒定區(qū)和缺少功能性CH1結構域(和任選地缺少功能性鉸鏈)的IgG1恒定區(qū)、藥物選擇盒(例如，lox化抗性基因)的核苷酸序列和含有相對于所述可選擇標記處于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重組和去除藥物選擇盒(例如，通過Cre處理)后，重新引入IgM基因區(qū)段以及缺少功能性CH1結構域序列和任選地缺少功能性鉸鏈區(qū)的IgG1基因。(圖3)(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E(任選地Δ鉸鏈)；V)。還提供了內源免疫球蛋白基因座的其它操作，例如，各種非IgM免疫球蛋白同種型的CH1區(qū)的缺失或失活突變。除了通過設計適當的恒定區(qū)構建體和將所述構建體通過如上所述的同源重組引入基因座，來將缺失或失活引入非IgM免疫球蛋白恒定區(qū)的CH1結構域和任選地鉸鏈的遺傳操作以外，還可通過本領域中已知的其它方法，例如只在抗原免疫后被引入小鼠的條件非IgMCH1缺失等，來在非IgMCH1中產生缺失或失活。用于基因座的條件失活的方法在本領域中是已知的。如上所述的重鏈基因座的遺傳修飾還可包括以下基因區(qū)段對一個或多個、基本上所有或所有內源重鏈可變基因區(qū)段(例如，VH基因區(qū)段、DH基因區(qū)段和/或JH基因區(qū)段)的替換：(a)人VH基因區(qū)段、DH基因區(qū)段和/或JH基因區(qū)段，所述基因區(qū)段可被重排或能夠經歷重排以編碼具有人獨特型的結合蛋白，(b)輕鏈可變基因區(qū)段，例如，輕鏈V基因區(qū)段和/或輕鏈J基因區(qū)段，所述基因區(qū)段可被重排或能夠經歷重排以編碼具有連接至缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的輕鏈可變區(qū)的免疫球蛋白多肽鏈，例如，VL單結構域結合蛋白，例如，包含輕鏈可變區(qū)的單結構域抗原結合蛋白，或(c)人輕鏈可變基因區(qū)段，例如，人輕鏈V基因區(qū)段和/或人輕鏈J基因區(qū)段，所述基因區(qū)段可被重排或能夠經歷重排以編碼具有連接至缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的人輕鏈可變區(qū)的免疫球蛋白多肽鏈，例如，VL單結構域結合蛋白，例如，包含具有人獨特型的人輕鏈可變區(qū)的單結構域抗原結合蛋白。在圖14中提供小鼠重鏈和人κ輕鏈基因座的示意圖(不按比例)來顯示小鼠基因座的約200個重鏈可變(VH)基因區(qū)段、13個重鏈多樣性(DH)基因區(qū)段和4個重鏈連接(JH)基因區(qū)段以及增強子(Enh)和重鏈恒定(CH)區(qū)，和人κ基因座的約76個Vκ基因區(qū)段、5個Jκ基因區(qū)段和內含增強子(Enh)和單個恒定區(qū)(Cκ)。圖15中顯示了用于將人κ基因區(qū)段插入鼠重鏈基因座的示意圖(不按比例)，通過同源重組修飾所述重鏈基因座，以通過mVH、mDH和mJH基因區(qū)段的靶向缺失來使內源小鼠重鏈基因座失活。如圖15中所示，可使用本領域中公認的標準分子技術將4個單獨的靶向載體用于逐步地將人Vκ基因區(qū)段和人Jκ基因區(qū)段插入失活的小鼠重鏈基因座。用于工程化所述4個靶向構建體的人κ基因區(qū)段可天然地存在于種系人κ輕鏈基因座的近側重疊群中。可通過本領域中已知的任何方法產生包含經遺傳工程化的重排的輕鏈的經遺傳修飾的小鼠。例如，可產生用單一重排的V:J基因或完整的未重排的輕鏈基因座，或用包含可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的單一重排的V:J基因的經遺傳工程化的輕鏈基因座替換內源輕鏈基因座的內源未重排的輕鏈可變V和J基因區(qū)段的靶向載體。在另一個方面，對如本文所述的非人動物進一步工程化以包含編碼ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)、其功能性片段、同源物或直系同源物的異位核苷酸序列。在一些實施方案中，可對本文所述的非人動物的重鏈基因座進一步工程化以包含編碼小鼠ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)、其功能性片段、同源物或直系同源物的異位核苷酸序列。在各個實施方案中，所述ADAM6蛋白在非人雄性動物中是有功能的。在例如美國專利第8,642,835號(其通過引用并入本文)中描述了用于工程化此類非人動物的方法和組合物。在一些實施方案中，通過將合適的靶向構建體引入合適的ES細胞(在一個或多個獨立靶向中)來產生如上所述的經遺傳修飾的動物和其它動物，并且鑒定包含所述靶向構建體的標記和選擇盒的陽性克隆并使其生長。隨后在適合于產生嵌合動物或完全ES細胞來源的動物的條件下將克隆在宿主胚胎中用作供體ES細胞?？扇芜x地在ES細胞期或在嵌合或ES細胞來源的小鼠中，例如通過使用lox化盒和與含有Cre的品系交配，或通過用Cre表達盒對ES細胞進行電穿孔來去除所述標記和選擇盒。因此，在一些實施方案中，所述遺傳修飾在動物的種系中發(fā)生。在一些實施方案中，產生如本文中所公開的動物的方法包括使能夠產生單結構域抗原結合蛋白的第一動物(例如，在其種系中包含缺少功能性CH1結構域的IgG重鏈基因座的第一動物)與能夠產生經遺傳修飾的重排的輕鏈的第二動物(例如，在其種系中包含具有可操作地連接至輕鏈恒定區(qū)的單一重排的V:J可變區(qū)的經遺傳工程化的輕鏈基因座的第二動物)雜交，以產生經遺傳工程化的F1動物，其中所述F1動物包含所述第一動物的IgG重鏈基因座和所述第二動物的輕鏈基因座?？赏ㄟ^動物交配或通過以其它方式組合配子(包括體外操作)進行所述雜交。對于其中合適的可遺傳修飾的ES細胞是不容易獲得的非人動物，將與本文所述的那些方法不同的方法用于產生包含遺傳修飾的非人動物。此類方法包括，例如，修飾非ES細胞基因組(例如，成纖維細胞或誘導的多潛能干細胞)和使用細胞核轉移來將經修飾的基因組轉移至合適的細胞，例如，卵母細胞，和在形成胚胎的合適條件下使經修飾的細胞(例如，經修飾的卵母細胞)在非人動物中孕育。產生單結構域抗原結合蛋白一旦獲得能夠產生單結構域抗原結合蛋白和/或經遺傳修飾的單一重排的輕鏈的經遺傳工程化的動物，就可通過用抗原免疫動物來容易地獲得針對抗原的免疫球蛋白和結合蛋白制劑。如本文所用的"多克隆抗血清組合物"包括親和純化的多克隆結合蛋白制劑。在一個方面，提供了用于產生缺少CH1結構域的結合蛋白的方法，所述方法包括：(a)用抗原免疫如本文所述的非人動物；(b)在足以使非人動物產生結合蛋白的條件下維持所述非人動物；(c)鑒定由小鼠產生的缺少功能性CH1結構域和/或缺少功能性鉸鏈區(qū)的結合蛋白；和(d)從所述非人動物分離所述結合蛋白、產生所述結合蛋白的細胞或編碼所述結合蛋白的序列的核苷酸序列。多種抗原可用于免疫轉基因動物。此類抗原包括但不限于細胞蛋白質、微生物，例如病毒和單細胞生物(諸如細菌和真菌)、活的、減毒的或死的微生物的碎片，或從所述微生物分離的抗原分子。可以以任何方便的方式，利用或不利用佐劑，向轉基因動物施用所述抗原，以及可按照預定的方案施用所述抗原。為了產生單克隆結合蛋白，從被免疫的轉基因動物分離脾細胞，并將其用于與轉化細胞系的細胞融合以用于產生雜交瘤，或通過標準分子生物學技術克隆編碼抗體的cDNA，并將其在轉染的細胞中表達。用于產生單克隆抗體的方法在本領域中已被很好地建立。參見，例如，歐洲專利申請0583980A1("MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits")、美國專利第4,977,081號("StableRabbit-MouseHybridomasAndSecretionProductsThereof")、WO97/16537("StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereof")和EP0491057B1("HybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinG")，所述參考資料的公開內容通過引用并入本文。從克隆的cDNA分子體外產生單克隆抗體已由Andris-Widhopf等，"Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay",JImmunolMethods242:159(2000)和由Burton,D.R.,"Phagedisplay",Immunotechnology1:87(1995)進行了描述。一旦已生成單克隆單結構域抗原結合蛋白，如果需要，就可使用標準分子生物學技術將此類結合蛋白容易地轉變成全長人結合蛋白。完全人單克隆結合蛋白在人中不具有免疫原性，并且適合用于人受試者的治療性治療。因此，在一個實施方案中，其中所述單結構域抗原結合蛋白包含人VH或人VL區(qū)和包含在非IgMCH1結構域中的缺失或失活突變的小鼠重鏈恒定區(qū)，可將單結構域抗原結合蛋白的VH或VL結構域的序列于合適的表達載體中克隆在人恒定區(qū)(任選地缺少CH1結構域)的上游，從而產生編碼可在合適的細胞，例如通常用于抗體表達的細胞，例如真核細胞(例如CHO細胞)中表達的完全人單結構域抗原結合蛋白的表達構建體。因此，本文中還提供了來源于如本文中所公開的經遺傳修飾的動物的單克隆結合蛋白生成細胞以及來源于其的核酸。還提供了來源于其的雜交瘤。還提供了來源于其的完全人單結構域結合蛋白以及編碼核酸。本文所述的單結構域抗原結合蛋白還可用于產生雙特異性抗體。本文所述的單結構域抗原結合蛋白的優(yōu)點是通過異二聚化具有針對單一治療劑中的兩個不同表位的特異性的重鏈，來產生雙特異性抗體的能力。實施例提供以下實施例來為本領域普通技術人員描述如何制備和使用本發(fā)明的方法和組合物，而非旨在限制本發(fā)明人視為它們的發(fā)明的范圍。已努力確保關于使用的數字(例如量、溫度等)的準確性，但應當解釋一些實驗誤差和偏差。所述實施例不包括對本領域普通技術人員來說是公知的常規(guī)方法(分子克隆技術等)的詳細描述。實施例1：編碼VH單結構域結合蛋白的小鼠:包含具有重鏈可變區(qū)和缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白鏈并且包含單一重排的輕鏈(ULC)的小鼠實施例1.1:動物的產生按照US2011/0145937,Macdonald等(其通過引用并入本文)中描述的方法產生經遺傳修飾以包含重鏈基因座的小鼠，所述重鏈基因座包含完全和功能性IgM基因序列以及缺少功能性CH1基因序列和任選地缺少功能性鉸鏈區(qū)的IgG1基因序列(圖1A)。產生幾種形式的小鼠，其缺少重鏈恒定基因序列的各種組合并包含CH1結構域的缺失但包含完全且功能性IgM(圖3)。例如，產生對于包含小鼠重鏈可變基因區(qū)段和完全且功能性IgM基因序列以及缺少功能性CH1基因序列和鉸鏈區(qū)的IgG1基因序列的重鏈基因座是純合的小鼠(mVHIgG1ΔCH1&鉸鏈；1576HO，圖3和4B中的“II”)。另外，產生對于包含人重鏈可變基因區(qū)段和完全且功能性IgM基因序列、缺少功能性CH1基因序列和鉸鏈區(qū)的IgG1基因序列，并且缺少IgG2b和IgG2a基因序列的重鏈基因座是純合的小鼠(hVHIgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2b/2a；1859HO，參見，例如，圖3中的“IV”)。另外，產生對于包含人重鏈可變基因區(qū)段和完全且功能性IgM基因序列、缺少功能性CH1基因序列的IgG1基因序列，并且缺少IgG2b和IgG2a基因序列的重鏈基因座是純合的小鼠(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；1673HO，參見，例如，圖3和4A中的“III”)。另外，產生對于包含人重鏈可變基因區(qū)段和完全且功能性IgM基因序列、缺少功能性CH1的IgG1基因序列，并且缺少IgD、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA基因序列的重鏈基因座是純合的小鼠(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E；6180HO，參見圖3和4C-D中的“V”)。重鏈恒定區(qū)中的修飾的另外的示例性形式示于圖3中。產生CH1缺失/失活和/或免疫球蛋白恒定基因缺失/失活的組合的其它形式，例如，產生其中IgG1和IgG2a均包含CH1結構域缺失的小鼠，并且所述小鼠還包含IgD、IgE、IgG3和IgG2b的缺失。如圖4中所示，重鏈基因座還可被修飾來包含人可變區(qū)，所述人可變區(qū)可以是人重鏈可變區(qū)[或人輕鏈可變區(qū)(圖16，參見下面的實施例2和3)]。重鏈基因座還可被修飾來包含Adam6a基因、Adam6b基因或兩者，或所述基因的片段，其中所述基因或其片段在雄性小鼠中具有功能(參見，例如，U.S.2012/0322108，通過引用并入本文)。包含單一重排的可變基因序列V:J(例如，Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1共同輕鏈小鼠)的共同輕鏈小鼠(也稱為通用輕鏈或ULC小鼠)的產生和這些小鼠中的抗原特異性抗體的生成描述于，例如，美國專利申請第13/022,759號、第13/093,156號、第13/412,936號、第13/488,628號、第13/798,310號和第13/948,818號(分別為公布第2011/0195454號、第2012/0021409號、第2012/0192300號、第2013/0045492號、第US20130185821號和第US20130302836號)(所述專利申請中的每一個申請通過引用整體并本文)中。具體地，產生在它們的種系中表達經遺傳工程化的Vκ1-39Jκ5κ輕鏈(1633HO或1634HO)或經遺傳工程化的Vκ3-20Jκ1κ輕鏈(1635HO或1636HO)的小鼠。將含有單一重排的人種系輕鏈區(qū)(ULCVκ1-39Jκ5；1633或1634)或(ULCVκ3-20Jκ1；1635或1636)的小鼠與攜帶有經修飾的IgG恒定區(qū)的小鼠交配。具體地，將此類ULC小鼠與以下小鼠交配：具有可操作地連接至其中IgG1CH1和IgG1鉸鏈區(qū)已缺失或失活的鼠重鏈恒定區(qū)的鼠重鏈可變區(qū)的小鼠(mVHIgG1ΔCH1&鉸鏈，1576)、具有可操作地連接至其中IgG1CH1和IgG1鉸鏈區(qū)以及IgG2a和IgG2b基因已缺失或失活的鼠重鏈恒定區(qū)的人重鏈可變區(qū)的小鼠(hVHIgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2b/2a；1859)、具有可操作地連接至其中IgG1CH1區(qū)以及IgG2a和IgG2b基因已缺失或失活的鼠重鏈恒定區(qū)的人重鏈可變區(qū)的小鼠(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；1673)，或具有可操作地連接至其中IgG1CH1區(qū)以及IgG2a和IgG2b、IgD、IgG3、IgA及IgE基因已缺失或失活的鼠重鏈恒定區(qū)的人重鏈可變區(qū)的小鼠(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E；6180)，以獲得以下后代小鼠：mVHIgG1ΔCH1&鉸鏈xVκ3-20Jκ1ULC或mVHIgG1ΔCH1&鉸鏈xVκ1-39Jκ5ULC純合小鼠(1576HO1635HO或1576HO1633HO)，hVHIgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2b/2axVκ3-20Jκ1ULC或hVHIgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2b/2axVκ1-39Jκ5ULC純合小鼠(1859HO1635HO或1859HO1633HO)，hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2axVκ3-20Jκ1ULC或hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2axVκ1-39Jκ5ULC純合小鼠(1673HO1635HO或1673HO1633HO)，和hVHIgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ3-20Jκ1ULC或hVHIgG1ΔCH1&鉸鏈ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/ExVκ1-39Jκ5ULC純合小鼠(6180HO1635HO或6180HO1634HO)。將包含CH1結構域中的缺失或失活突變和免疫球蛋白恒定區(qū)基因中的缺失或失活突變的小鼠的其它形式，與包含如上所述的單一重排的人種系輕鏈區(qū)的小鼠交配。實施例1.2：利用抗原免疫小鼠和表達單結構域結合蛋白用不同抗原免疫對于修飾是純合的小鼠，并使用多種佐劑通過各種途徑進行加強免疫。通過ELISA或蛋白質印跡評價IgG1特異性應答的滴度。如圖5A所示，對于IgG1ΔCH1/鉸鏈和ULC修飾均為純合的小鼠在免疫之前和之后表現出相較于只具有IgG1ΔCH1的小鼠增加的血清中的IgG1的總量的表達。ΔCH1/鉸鏈xULC小鼠中的較高的滴度表明通用輕鏈的存在增加了生成抗原特異性單結構域抗原結合蛋白的可能性。圖5B。圖7表明可利用經遺傳工程化以包含ΔCH1和ULC修飾的小鼠的各種形式獲得高滴度。另外，圖6和8顯示單結構域抗原結合蛋白存在并且可從包含在CH1區(qū)中具有缺失的人重鏈可變區(qū)和單一重排的輕鏈(通用輕鏈)的小鼠從離。實施例1.3:表達單結構域結合蛋白和單一重排的輕鏈(ULC)的小鼠中的B細胞發(fā)育和成熟使用如本文中指定的各種細胞表面標志物的流式細胞術，分析來自對于經修飾的CH1結構域和單一重排的輕鏈(ULC)是純合的小鼠的脾、血液和骨髓室的B細胞含量的通過B細胞發(fā)育和B細胞成熟的進展(參見圖2)。簡言之，處死ULC小鼠和對于經修飾的CH1結構域和重排的輕鏈是純合的小鼠，并收集血液、脾和骨髓。將血液收集至具有EDTA(BDBiosciences)的微量采血管中。通過用完全RPMI培養(yǎng)基(補充有胎牛血清、丙酮酸鈉、Hepes、2-巰基乙醇、非必需氨基酸和慶大霉素的RPMI培養(yǎng)基)沖洗從股骨收集骨髓。利用ACK裂解緩沖液(LonzaWalkersville)裂解來自脾和骨髓制劑的RBC，隨后用完全RPMI培養(yǎng)基洗滌。在冰上將細胞(1x106)與抗小鼠CD16/CD32(2.4G2,BD)孵育10分鐘，隨后在冰上利用以下抗體標記30分鐘：綴合有APC-H7的抗小鼠CD19(克隆1D3,BD)、綴合有太平洋藍的抗小鼠CD3(克隆17A2,)、PeCy7-IgM(II/41,)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,)、APC-eFluor780-B220(RA3-6B2,)、APC-CD19(MB19-1,)、PE-CD93(AA4.1,)、FITC-CD23(B3B4,BD)、APC-CD21/CD35(7G6,BD)。骨髓：未成熟B細胞(B220intIgM+)、成熟B細胞(B220hiIgM+)。血液和脾：B細胞(CD19+)、成熟B細胞(CD19+IgMintIgDhi)、過渡型/未成熟B細胞(CD19+IgMhiIgDint)。染色后，洗滌細胞，并將其在2％甲醛中進行固定。在LSRII流式細胞儀上進行數據獲取，并利用FLOWJOTM軟件(TreeStar,Inc.)分析。圖9顯示這些小鼠具有正常血清穩(wěn)定狀態(tài)的IgM和IgG水平。圖10和11顯示脾室的結果，顯示了脾中接近正常的B細胞數目和接近正常的B細胞成熟。圖12和13顯示骨髓室的結果，顯示了骨髓中的正常B細胞數目和接近正常的B細胞發(fā)育。實施例2：編碼VL單結構域結合蛋白的小鼠:包含具有輕鏈可變區(qū)和缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白鏈的小鼠實施例2.1：動物的產生如美國專利公布第2012/0096572號中所述，產生將輕鏈基因區(qū)段引入重鏈基因座的小鼠。具體地，各種靶向構建體使用遺傳工程技術來制備以修飾小鼠基因組細菌人工染色體(BAC)文庫(參見，例如，美國專利第6,586,251號和Valenzuela,D.M.,Murphy,A.J.,Frendewey,D.,Gale,N.W.,Economides,A.N.,Auerbach,W.,Poueymirou,W.T.,Adams,N.C.,Rojas,J.,Yasenchak,J.,Chernomorsky,R.,Boucher,M.,Elsasser,A.L.,Esau,L.,Zheng,J.,Griffiths,J.A.,Wang,X.,Su,H.,Xue,Y.,Dominguez,M.G.,Noguera,I.,Torres,R.,Macdonald,L.E.,Stewart,A.F.,DeChiara,T.M.,Yancopoulos,G.D.(2003).High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis.NatBiotechnol21,652-659)。通過同源重組修飾小鼠BACDNA以通過VH、DH和JH基因區(qū)段的靶向缺失使內源小鼠重鏈基因座失活，以確保插入未重排的人種系κ輕鏈基因序列(圖15的上方)。簡言之，使用重組酶介導的重組在兩個連續(xù)的靶向事件中使小鼠重鏈基因座缺失。第一靶向事件包括使用從5’至3’包含5’小鼠同源臂、重組酶識別位點、新霉素盒和3’同源臂的靶向載體在小鼠重鏈基因座的5’末端進行的靶向。所述5’和3’同源臂包含小鼠重鏈基因座的5’序列。第二靶向事件包括使用第二靶向載體靶向JH基因區(qū)段的區(qū)域中的小鼠重鏈基因座的3’末端，所述第二靶向載體從5’至3’包含5’小鼠同源臂、5’重組酶識別位點、第二重組酶識別位點、潮霉素盒、第三重組酶識別位點和3’小鼠同源臂。5’和3’同源臂包含側接小鼠JH基因區(qū)段以及內含增強子和恒定區(qū)的5’的序列。含有用兩種靶載體(如上所述的)靶向的經修飾的重鏈基因座的陽性ES細胞通過核型分析來確認。隨后從雙靶向的ES細胞分離DNA，并使其經歷利用重組酶的治療，從而介導第一靶向載體中的5’重組酶識別位點與第二靶向載體中的5’重組酶識別位點之間的小鼠重鏈基因座的基因組DNA的缺失，留下單個重組酶識別位點和側接有兩個重組合酶識別位點的潮霉素盒(參見圖15的上方)。因此，生成含有完整CH基因的經修飾的小鼠重鏈基因座來用于使用圖15中概述的靶向載體以精確的方式逐步地插入人κ種系基因區(qū)段。對4個單獨的靶向載體進行工程化以逐步地將40個人Vκ基因區(qū)段和5個人Jκ基因區(qū)段插入失活的小鼠重鏈基因座(上述的)(圖15)。用于工程化4個靶向構建體的人κ基因區(qū)段天然地存在于種系人κ輕鏈基因座的近側重疊群中(圖14B)。將對于此類修飾的重鏈基因座是雜合的小鼠交配以獲得對于如上所述的重鏈基因座是純合的小鼠。根據圖16中提供的方案和使用美國專利公開第US2011/0145937號，Macdonald等(其通過引用并入本文)中描述的方法靶向包含此類經修飾的重鏈基因座(包含輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段)的胚胎干細胞，以產生對于包含輕鏈可變區(qū)和在IgG1基因中缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)并且還缺少IgG2b和IgG2a基因的重鏈基因座是純合的小鼠。因此，使用如圖16中所述的工程化重鏈基因座的靶向載體來進一步修飾例如US2012/0096572中描述的包含輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段的經修飾的重鏈基因座小鼠的種系，以使得IgG1基因區(qū)段缺少功能性CH1結構域并且使IgG2a和IgG2b基因缺失，以獲得對于包含人κ可變結構域和鼠IgG1恒定區(qū)的單結構域抗原結合蛋白是純合的小鼠，其中所述IgG1恒定結構域缺少功能性CH1區(qū)(hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2aΔIgG2b；6082HO)。產生CH1缺失和/或免疫球蛋白恒定基因缺失的組合的另外的變型，例如，產生包含含有人輕鏈κ可變區(qū)的重鏈基因座的小鼠，其中IgG1和IgG2a兩者均包含CH1結構域缺失，并且所述小鼠還包含IgD、IgE、IgG3和IgG2b的缺失。蛋白質印跡已確認只有輕鏈的單結構域結合蛋白存在并且可從經遺傳修飾以包含人κ可變結構域和鼠IgG1恒定區(qū)的小鼠分離，其中所述IgG1恒定結構域缺少功能性CH1區(qū)(6082HO，數據未顯示)。實施例2.2:編碼VL單結構域結合蛋白的基因序列的有效重排的確認從以下小鼠的脾和骨髓分離B細胞的mRNA：(a)對于包含輕鏈可變區(qū)和在IgG1基因中缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定基因序列并且還缺少IgG2b和IgG2a基因的重鏈基因座是純合的小鼠，(b)對照野生型和(c)對于兩個經修飾的小鼠重鏈基因座是純合的對照CH1缺失xULC小鼠，所述經修飾的小鼠重鏈基因座表達人重鏈V、D和J區(qū)段，在IgG1基因中缺少功能性CH1結構域，并且還缺少功能性IgG2b和IgG2a基因，以及包含也被稱為共同或通用輕鏈的單一重排的輕鏈基因座，參見，例如，美國專利公布第2011/0195454號。在TAQMAN測定中使用以下探針和引物分析所述分離的mRNA的有效重排：hJk/mIgG1鉸鏈-組71(訂購自BiosearchTechnologies)(有義)5’-GGACCAAGCTGGAGATCAAAC-3’(SEQIDNO:1)，(反義)5’-CTTCTGGGACTGTACATATGCAA-3’(SEQIDNO:2)，(探針)5’-FAM-CCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCC–BHQ1-3’(SEQIDNO:3)；hJH/mIgG1鉸鏈-組72(訂購自AppliedBiosystems)(有義)5’-TGGTCACCGTCTCCTCAGTG-3’(SEQIDNO:4)，(反義)5’-CACACGTGACCTTAGGAGTCAGAG-3’(SEQIDNO:5)，(探針)5’-FAM-TGGTTGTAAGCCTTGC-MGB-3’(SEQIDNO:6)；mHPRT1-組51(訂購自BiosearchTechnologies)(有義)5’-CGAGTCTGAAGCTCTCGATTTCCT-3’(SEQIDNO:7)，(反義)5’-CAGCCAACACTGCTGAAACATG-3’(SEQIDNO:8)，(探針)5’-FAM-CAGCATCTAAGAGGTTTTGCTCAGTGGA-BHQ-3(SEQIDNO:9)’；如圖17A和17B所示，替換內源重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的未重排的輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段能夠與缺少功能性CH1結構域的內源重鏈恒定IgG1基因經歷有效重排。實施例3：編碼VL單結構域結合蛋白的小鼠:包含具有輕鏈可變區(qū)和缺少功能性CH1結構域的重鏈恒定區(qū)的免疫球蛋白并且包含單一重排的輕鏈(ULC)的小鼠將含有單一重排的人種系輕鏈區(qū)(ULCVκ3-20Jκ1；1635，或者也使用ULCVκ1-39Jκ5；1633)的人源化小鼠與攜帶包含可操作地連接至鼠恒定區(qū)的人輕鏈κ可變區(qū)的經修飾的重鏈基因座(其中IgG1CH1結構域以及IgG2a和IgG2b基因已缺失或失活(hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2b；6082))的小鼠交配，以獲得以下后代小鼠：hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bxVκ3-20Jκ1ULC純合小鼠(6082HO1635HO)。這些小鼠表達VL單結構域結合蛋白(圖18)。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3