本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因玉米雙單倍體純合后代的方法。

背景技術(shù)：

玉米(Zea mays)是重要的糧食和飼料作物，在我國玉米種植面積已升至為第一位、單產(chǎn)和總產(chǎn)保持第二位，僅次于水稻(李少昆，2010)。同時由于玉米也是進(jìn)行遺傳研究的良好材料隨著世界經(jīng)濟的發(fā)展，物質(zhì)生活水平的提高，人們對玉米的需求趨勢呈剛性增長。利用雜種優(yōu)勢、選育優(yōu)良玉米雜交種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵選育優(yōu)良玉米自交系。傳統(tǒng)選育優(yōu)良自交系是根據(jù)育種目標(biāo)選用優(yōu)異種質(zhì)資源組配基礎(chǔ)材料后連續(xù)自交5～6代以上，性狀穩(wěn)定后進(jìn)行配合力測定,再根據(jù)雜種優(yōu)勢模式組配雜交組合。玉米單倍體是指具有配子體染色體數(shù)目的植物體,采用玉米單倍體育種技術(shù)可在一定程度上克服傳統(tǒng)育種方法存在的不足。利用單倍體研究進(jìn)行育種可以縮短產(chǎn)生純合品系的時間。

目前普遍使用的玉米單倍體誘導(dǎo)系Stock6是Ed Coe(1950)發(fā)現(xiàn)的,該系自交后代中可產(chǎn)生約2.52％的單倍體植株。后又經(jīng)過兩次回交和兩次自交導(dǎo)入了控制子粒性狀和植株性狀(紫色葉片、莖稈、雄穗和花藥)的顯性標(biāo)記基因，90％個體的顯性色素基因已達(dá)純合,基因型為ABPICR-njy,它具有兩個標(biāo)記性狀：子粒有斑紋、成株葉片和葉鞘呈紫色，均是由互補基因控制。表現(xiàn)型是果穗子粒為白色硬粒型，子粒頂端有紫色斑塊和紫色胚芽，植株具有深紫色的葉片、莖稈、雄穗和花藥,具有三重性狀標(biāo)記。Stock6誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的原理已經(jīng)清楚，雙授精過程中一個精子與極核結(jié)合，而另一個精子不能與卵結(jié)合形成授精卵。在育種實踐中用作父本被誘導(dǎo)的育種試材作母本，大約有3％的單倍體胚。Stock6具有雜交誘導(dǎo)母本雌配子體形成高頻率單倍體的能力,符合單倍體育種的基本要求,從而使玉米單倍體育種變?yōu)橐环N現(xiàn)實的育種方法。但是在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)Stock6存在許多缺陷,如花粉量很少或者不散粉、自交結(jié)實性很差、穗粒腐病嚴(yán)重、子粒Navajo遺傳標(biāo)記表達(dá)較弱。

國外通過雜交改良的方法已經(jīng)從Stock6中衍生出了一些新的誘導(dǎo)系,如法國的SW14、俄羅斯的Krasnodar Markers和摩爾多瓦的ZMS等。這些新的誘導(dǎo)系不但適應(yīng)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境,而且誘導(dǎo)率有了進(jìn)一步的提高。因此利用價值已經(jīng)大大超出Stock6。

我國利用單倍體誘導(dǎo)系選育自交系的研究開展較晚,單倍體育種體系都是以改良Stock6為主,選育的單倍體誘導(dǎo)系較少。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉志增(1998)用高油玉米群體BHO和Stock6雜交,經(jīng)多代自交和測交選育出農(nóng)大高誘1號單倍體誘導(dǎo)系,其誘導(dǎo)率可高達(dá)5.8％。2007年吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的才卓等從Stodk6與M278的雜交后代中連續(xù)6代測交和選擇,育成了高頻率單倍體誘導(dǎo)系吉高誘系3號,對20個沒基因型材料的單倍體誘導(dǎo)結(jié)果表明,其單倍體誘導(dǎo)率介于5.50％～15.94％,平均為10.40％。

在使用單倍體誘導(dǎo)系選系程序中,單倍體個體必須加倍成為二倍體才能產(chǎn)生可育后代。單倍體的加倍頻率直接關(guān)系到單倍體育種的效率。人們對誘導(dǎo)單倍體進(jìn)行了大量研究,并取得了一定成績。據(jù)Chase報道,單倍體的自然加倍頻率為10％左右；Zabirova等和Shatskaya的資料顯示,許多材料的單倍體自然加倍率低于5％，有些材料不發(fā)生自然加倍。誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體植株自然加倍率很低,需經(jīng)過人工加倍才能得到更多的DH系,以滿足育種需要。早在1952年Chase曾提出用秋水仙素溶液注射幼苗的盾片節(jié)進(jìn)行加倍,Gayen在1994年使用浸種法,使加倍率達(dá)到了18％。盡管如此,到目前為止玉米單倍體的化學(xué)加倍率仍比較低。為此需要探索更為有效的加倍方法，提高加倍率，以期為玉米單倍體人工加倍提供一種有效方法。

玉米的遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，一般低于5％，且具有較強基因型依賴性，再生頻率較高、宜于誘導(dǎo)II型胚性愈傷組織的是玉米雜交種HiII。公認(rèn)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌侵染HiII的幼胚，經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷組織、分化出再生植株。之后將轉(zhuǎn)基因的HiII后代與普通玉米自交系雜交后回交6-8代，自交2-3代，將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入普通玉米自交系中，試驗周期長，耗時費力。利用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，對轉(zhuǎn)基因的HiII后代與普通玉米自交系雜交的F1代進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)進(jìn)而加倍成純合二倍體，可大大加速基因型純合的速度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種快速創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因玉米雙單倍體純合后代的方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明包括：

試驗材料：玉米單倍體誘導(dǎo)系東誘1號、L7和JY3，為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組選育，具有R-nj標(biāo)記；用于創(chuàng)建單倍體的F1雜交種，其母本為轉(zhuǎn)玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系，父本為合344；上述常規(guī)玉米材料公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組獲得；

試驗方法：

材料的種植：采用隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，雙行區(qū)，行長5m，株距30cm，行寬70cm，每行17株；兩地田間管理標(biāo)準(zhǔn)一致，同普通玉米生產(chǎn)田；5米行長，株距30cm，行距70cm；雜交種一次播種，時間為當(dāng)年4月29日，誘導(dǎo)系分3期播種，時間分別為當(dāng)年4月29日，5月7日和5月11日；

授粉：用誘導(dǎo)系給F1雜交種授粉，掛牌記錄授粉時間，每個誘導(dǎo)系至少授10株；

組織培養(yǎng)的試驗流程：

培養(yǎng)基：

(1)篩選培養(yǎng)基：MS液體培養(yǎng)基+100uM ABA；

(2)加倍培養(yǎng)基：MS液體培養(yǎng)基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05％的秋水仙素；

(3)生長培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基；

操作方法：

(A)幼穗的消毒

分別在授粉后18d，20d取幼穗，剝?nèi)グ~，在75％乙醇中滅菌8min，0.1％HgCl₂消毒6min，無菌水沖洗3次；

(B)幼胚的剝?nèi)。?/p>

取幼胚，盾片朝下置于培養(yǎng)皿中用篩選培養(yǎng)基浸潤的無菌濾紙上，28℃，16h光照/8小時黑暗，培養(yǎng)24h；

(C)單倍體幼胚的加倍：

挑選出盾片無色素沉著的單倍體幼胚，盾片朝上接種到培養(yǎng)皿中用加倍培養(yǎng)基浸潤的無菌濾紙上，26℃黑暗培養(yǎng)24h；

(D)幼胚培養(yǎng)：

將幼胚轉(zhuǎn)移至生長培養(yǎng)瓶中，盾片向下，26℃暗培養(yǎng)1周，之后26℃光培養(yǎng)2-3周直至根發(fā)育完全；每瓶接種15個左右；

(E)移栽：

將小苗移栽至土壤基質(zhì)中，溫室內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)葉鞘顏色鑒別單倍體植株，直至成熟，嚴(yán)格自交，收獲種子；

(F)雙單倍體的PCR檢測：

采用CTAB小量法提取玉米幼苗葉片的總DNA；由于ZmARG基因為玉米內(nèi)源基因，根據(jù)啟動子Ubi序列和目的基因序列設(shè)計引物，引物ARG-F位于啟動子Ubi序列內(nèi)部，引物ARG-R位于目的基因序列內(nèi)部，產(chǎn)物大小為775bp；篩選標(biāo)記基因為抗除草劑草甘膦基因，產(chǎn)物大小為522bp；引物序列如下：

ARG-F:5’-CGCCCTTCTTTGGTGAT-3’

ARG-R:5’-CCCTGCCTTCATACGCT-3’

PCR反應(yīng)程序為，94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃8min，32個循環(huán)；1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物；

數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:

單倍體的誘導(dǎo)率＝單倍體幼胚數(shù)/接種幼胚數(shù)*100％；加倍率＝結(jié)實株數(shù)/再生苗數(shù)*100％；采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用統(tǒng)計分析軟件SPSS Statistics 17.0中獨立樣本T檢驗和方差分析程序進(jìn)一步分析。

進(jìn)一步，所述步驟(E)中的葉鞘顏色鑒別單倍體植株的葉鞘顏色為綠色葉鞘。所述步驟(E)中自交時，如果散粉困難，需要用針挑破花藥釋放花粉。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種快速創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因玉米雙單倍體純合后代的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明用玉米單倍體誘導(dǎo)系東誘1號為父本給轉(zhuǎn)基因玉米雜交種授粉，挑取單倍體幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)，利用秋水仙素給單倍體幼胚進(jìn)行染色體組加倍，進(jìn)而培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因雙單倍體玉米植株，并收獲轉(zhuǎn)基因雙單倍體種子。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因玉米回交轉(zhuǎn)育后代的快速純合，也可用于玉米雙單倍體群體的快速建立，進(jìn)行玉米重要性狀的遺傳分析。

附圖說明

圖1玉米再生植株中目標(biāo)基因ZmARG的PCR擴增結(jié)果圖。

圖中：M:Trans2K DNA Marker；P:陽性對照；W:空白對照；N:陰性對照；1-8:轉(zhuǎn)基因植株。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

一、玉米單倍體誘導(dǎo)系東誘1號的生物學(xué)特性調(diào)查

試驗材料：

玉米單倍體誘導(dǎo)系東農(nóng)誘1號，對照材料為誘導(dǎo)系L7和JY3，均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組選育，具有R-nj標(biāo)記。上述玉米材料公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組獲得。

試驗方法：

材料的種植：

試驗材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地，采用隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，3行區(qū)，行長5m，株距30cm，行寬70cm，每行17株。田間管理同普通玉米生產(chǎn)田。

田間調(diào)查項目和調(diào)查方法：

以全區(qū)80％達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)作為各時期的日期，但對于田間出苗不正常植株要剔除不計。調(diào)查指標(biāo)和調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)如下。

抽雄期：植株雄穗尖端露出頂葉3～5cm；

開花期：植株雄穗開始散粉；

抽絲期：植株雌穗的花絲從苞葉中伸出2cm左右；

播種到抽絲期的天數(shù)：是播種到抽絲期的天數(shù)；

播種到散粉期的天數(shù)：是播種到開花期的天數(shù)；

散粉持續(xù)時間：是從出現(xiàn)花粉到散粉結(jié)束的天數(shù)；

花粉量：植株散粉的多少；

株高：乳熟期在每小區(qū)隨機選5株分別測量植株頂端至地面高度；

穗位高：乳熟期在每小區(qū)隨機選5株分別測量從玉米基部(露出地面部分)到玉米最上部第一穗穗部底端(不計玉米的穂柄長度)的距離；

雄穗分枝數(shù)：每小區(qū)隨機選5株分別測量雄穗雄花序的所有分支的總數(shù)；

調(diào)查結(jié)果：

田間調(diào)查結(jié)果見表1?？梢娪衩讍伪扼w誘導(dǎo)系東農(nóng)高誘1號與其它兩個誘導(dǎo)系相比，優(yōu)勢十分突出，具有早熟、花粉量大、植株高度適宜、花期長等特點。適于進(jìn)行玉米單倍體群體的創(chuàng)制和玉米單倍體育種使用。

表1玉米單倍體誘導(dǎo)系東農(nóng)高誘1號的生物學(xué)性狀調(diào)查

二、玉米單倍體誘導(dǎo)系東誘1號的誘導(dǎo)效果分析

試驗材料：

玉米單倍體誘導(dǎo)系東誘1號，對照材料為誘導(dǎo)系L7和JY3，均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組選育，具有R-nj標(biāo)記。母本材料為玉米雜交種東農(nóng)254。上述玉米材料公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組獲得。

試驗方法：

材料的種植：

試驗材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地，采用隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，雙行區(qū)，行長5m，株距30cm，行寬70cm，每行17株。兩地田間管理標(biāo)準(zhǔn)一致，同普通玉米生產(chǎn)田。5米行長，株距30cm，行距70cm。雜交種一次播種，時間為2015年4月29日，誘導(dǎo)系分3期播種，時間分別為2015年4月29日，5月7日和5月11日。

授粉：

用誘導(dǎo)系給雜交種授粉，掛牌記錄授粉時間，每個誘導(dǎo)系至少授10株。

單倍體種子的獲得和誘導(dǎo)率的計算：

玉米果穗充分成熟后根據(jù)雜交籽粒胚乳顏色和胚顏色兩方面的表型進(jìn)行鑒別，用以區(qū)分二倍體和單倍體和雜交二倍體籽粒。紫頂紫胚子粒，白頂紫胚子粒，是正常雜交的二倍體；白頂白胚，是受花粉污染或有缺陷的子粒；紫頂白胚粒，為擬單倍體。

試驗結(jié)果：

試驗結(jié)果見表2。由表中可見，3個玉米誘導(dǎo)系共授粉了34株玉米植株，將收獲的果穗單穗脫粒后，根據(jù)籽粒胚和胚乳的顏色，挑選其中紫頂白胚乳的籽粒為單倍體籽粒。其中東誘1號單倍體誘導(dǎo)率最高達(dá)到11.7％，顯著高于其他兩個誘導(dǎo)系。

表2不同單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效果的比較

注：*表示在0.05水平上差異顯著

三、利用玉米單倍體誘導(dǎo)系創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因玉米純合后代株系

1、包括

試驗材料：玉米單倍體誘導(dǎo)系東誘1號、L7和JY3，為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組選育，具有R-nj標(biāo)記；用于創(chuàng)建單倍體的F1雜交種，其母本為轉(zhuǎn)玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系，父本為合344；上述常規(guī)玉米材料公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米課題組獲得；

試驗方法：

材料的種植：采用隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，雙行區(qū)，行長5m，株距30cm，行寬70cm，每行17株；兩地田間管理標(biāo)準(zhǔn)一致，同普通玉米生產(chǎn)田；5米行長，株距30cm，行距70cm；雜交種一次播種，時間為當(dāng)年4月29日，誘導(dǎo)系分3期播種，時間分別為當(dāng)年4月29日，5月7日和5月11日；

授粉：用誘導(dǎo)系給F1雜交種授粉，掛牌記錄授粉時間，每個誘導(dǎo)系至少授10株；

組織培養(yǎng)的試驗流程：

培養(yǎng)基：

(1)篩選培養(yǎng)基：MS液體培養(yǎng)基+100uM ABA；

(2)加倍培養(yǎng)基：MS液體培養(yǎng)基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05％的秋水仙素；

(3)生長培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基；

操作方法：

(A)幼穗的消毒

分別在授粉后18d，20d取幼穗，剝?nèi)グ~，在75％乙醇中滅菌8min，0.1％HgCl₂消毒6min，無菌水沖洗3次；

(B)幼胚的剝?nèi)。?/p>

取幼胚，盾片朝下置于培養(yǎng)皿中用篩選培養(yǎng)基浸潤的無菌濾紙上，28℃，16h光照/8小時黑暗，培養(yǎng)24h；

(C)單倍體幼胚的加倍：

挑選出盾片無色素沉著的單倍體幼胚，盾片朝上接種到培養(yǎng)皿中用加倍培養(yǎng)基浸潤的無菌濾紙上，26℃黑暗培養(yǎng)24h；

(D)幼胚培養(yǎng)：

將幼胚轉(zhuǎn)移至生長培養(yǎng)瓶中，盾片向下，26℃暗培養(yǎng)1周，之后26℃光培養(yǎng)2-3周直至根發(fā)育完全；每瓶接種15個左右；

(E)移栽：

將小苗移栽至土壤基質(zhì)中，溫室內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)葉鞘顏色鑒別單倍體植株，直至成熟，嚴(yán)格自交，收獲種子；

(F)雙單倍體的PCR檢測：

采用CTAB小量法提取玉米幼苗葉片的總DNA；由于ZmARG基因為玉米內(nèi)源基因，根據(jù)啟動子Ubi序列和目的基因序列設(shè)計引物，引物ARG-F位于啟動子Ubi序列內(nèi)部，引物ARG-R位于目的基因序列內(nèi)部，產(chǎn)物大小為775bp；篩選標(biāo)記基因為抗除草劑草甘膦基因，產(chǎn)物大小為522bp；引物序列如下：

ARG-F:5’-CGCCCTTCTTTGGTGAT-3’

ARG-R:5’-CCCTGCCTTCATACGCT-3’

PCR反應(yīng)程序為，94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃8min，32個循環(huán)；1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物；

數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:

單倍體的誘導(dǎo)率＝單倍體幼胚數(shù)/接種幼胚數(shù)*100％；加倍率＝結(jié)實株數(shù)/再生苗數(shù)*100％；采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用統(tǒng)計分析軟件SPSS Statistics 17.0中獨立樣本T檢驗和方差分析程序進(jìn)一步分析。

具體的，所述步驟(E)中的葉鞘顏色鑒別單倍體植株的葉鞘顏色為綠色葉鞘。所述步驟(E)中自交時，如果散粉困難，需要用針挑破花藥釋放花粉。

試驗結(jié)果：

雙單倍體誘導(dǎo)結(jié)果：

挑取轉(zhuǎn)基因F1代雜交種的幼胚，根據(jù)顏色挑選其中的單倍體幼胚加倍處理，通過組織培養(yǎng)方法獲得再生二倍體植株。結(jié)果見表3。

表3組織培養(yǎng)法不同單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的結(jié)果

目標(biāo)基因PCR檢測結(jié)果：

以上述獲得的轉(zhuǎn)ZmARG基因玉米后代再生苗為材料，用CTAB小量法提取葉片總DNA。以質(zhì)粒DNA為陽性對照，以ddH₂O為空白對照，以非轉(zhuǎn)基因玉米種子DNA為陰性對照，對目的基因ZmARG進(jìn)行PCR檢測。PCR結(jié)果顯示，191株再生苗中有160株擴增出775bp的ZmARG基因特異片段，其擴增條帶位置與質(zhì)粒DNA陽性對照相符，陰性對照和空白對照未擴增出條帶，見圖1，初步采用組織培養(yǎng)輔助單倍體誘導(dǎo)方法獲得轉(zhuǎn)ZmARG基因回交轉(zhuǎn)育后代。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。