本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因作物的除草劑耐受性無損檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高光譜成像技術(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性的檢測方法。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的農(nóng)田雜草得到廣泛關(guān)注。研究表明，田間雜草影響農(nóng)作物的品質(zhì)，還會使作物的產(chǎn)量達到10％-100％不等的損失，嚴重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前，雜草的防除主要依靠噴施除草劑。草甘膦是上世紀70年代開發(fā)最為成功的一種除草劑。由于它殺草譜廣且具有極好的內(nèi)吸傳導(dǎo)性能，能有效防除多年生深根惡性雜草，且對人畜安全，易分解、不污染環(huán)境，已成為目前應(yīng)用最為廣泛的除草劑。但由于其是非選擇性除草劑，在防除雜草的同時殺死農(nóng)作物，這就限制了它的使用范圍和使用時間。因此培育出具有抗草甘膦特性的作物，能大大的提高除草效率降低生產(chǎn)成本。

自從comai等從鼠傷寒沙門氏菌中分離出抗草甘膦突變基因(aroa)以來，各國科研工作者對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物進行了廣泛的研究。目前，全球已經(jīng)成功研制多種抗草甘膦作物，其中玉米發(fā)展最為迅速。目前轉(zhuǎn)基因耐草甘膦玉米的檢測方法主要有生物測定法、生理生化法、核酸分析法、蛋白質(zhì)分析法等。但這些方法對樣本具有破壞性，耗費大量人力、物力，且時效性差，不利于推廣應(yīng)用。因此，急需一種快速無損檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性進行檢測，為轉(zhuǎn)基因耐草甘膦玉米的培育提供技術(shù)支持。

有研究表明噴施草甘膦后，植物體內(nèi)莽草酸含量升高，因此，莽草酸積累是植物經(jīng)草甘膦處理后最早出現(xiàn)的且相對敏感的生理指標。高光譜成像技術(shù)能夠及時探測外界脅迫對作物內(nèi)部生理的細微變化，簡單、快速、精確地預(yù)測玉米受到脅迫后莽草酸的含量，較好的反映玉米草甘膦的脅迫程度，對轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型進行評價，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于原有生物技術(shù)檢測的利弊現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種快速獲取轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，應(yīng)用高光譜成像技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性進行檢測，模型預(yù)測精度較高，為轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受快速檢測提供切實有效的檢測手段。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種快速獲取轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，包括：

s1:種植同等數(shù)量的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米，在玉米生長過程中，對一部分數(shù)量的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米噴施濃度為1080ga.e.ha^-1的草甘膦溶液作為實驗組，對剩余的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米噴施等量的水作為對照組；

s2：通過制定莽草酸標準曲線結(jié)合紫外分光光度法，獲得受草甘膦脅迫不同天數(shù)的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株冠層葉片的的莽草酸含量。

s3：應(yīng)用高光譜成像系統(tǒng)，獲取受草甘膦脅迫不同天數(shù)的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株冠層的高光譜數(shù)據(jù)，得到樣本在可見近紅外波段(380-1030nm)的吸光度。

s4：采用小波變換(wt)對高光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理，去除噪聲影響，同時剔除異常樣本。

s5：對經(jīng)過預(yù)處理的光譜數(shù)據(jù)進行特征波長選擇，采用連續(xù)投影算法(spa)進行特征波長選擇。

s6：通過spxy方法將實驗組和對照組內(nèi)的樣本分為建模集和預(yù)測集；

s7：以建模集內(nèi)樣本的特征波長的反射率值作為輸入變量，步驟s2中測量得到的莽草酸含量作為輸出變量，建立lssvm回歸分析模型；

y＝56967.52*λ1+41852.64*λ2-55015.29*λ3+2881.984*λ4+9109.073*λ5-95879.78*λ6+42727.5*λ7-18709.43*λ8+99941.35*λ9-132229.1*λ10+52584.88*λ11+107.4436*λ11+38980.16*λ13-1926.05*λ14+22470.85*λ15-773.9245*λ16+194.71162

其中，y為莽草酸含量，λ1～λ16分別為高光譜數(shù)據(jù)中對應(yīng)的玉米樣本的反射率計算所得的吸光度。

s8：將預(yù)測集內(nèi)樣本的特征波長對應(yīng)的吸光度輸入所述的lssvm回歸分析模型，得出預(yù)測集內(nèi)各樣本的莽草酸含量。

在步驟s1中，分別種植120盆轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)入cry1ab/cry2aj-g10evo基因)和非轉(zhuǎn)基因玉米，在玉米生長至3葉期時，將濃度為1,080ga.e.ha^-1的草甘膦溶液置于便攜式co2高壓噴霧器中，分別對80株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株進行噴施作為實驗組，噴施壓力為23lbpol^-2，噴施量為120lha^-1。在同等條件下，分別對40株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株噴施等量的水作為對照組。在噴施后的第2、4、6、8天各取40株株噴施草甘膦的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各20株)，20株噴施水的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各10株)進行實驗，共有實驗樣本240個。

在步驟s2中，采用紫外分光光度法結(jié)合建立莽草酸標準曲線的方法測定實驗樣本莽草酸含量，具體包括：

s2.1：獲取莽草酸提取物：每個樣本取0.1g葉片加入1.5ml的0.25mol/l的hcl提取液，在冰浴狀態(tài)下迅速碾磨，于12000r/min離心10min，收集離心上清液。

s2.2：測定莽草酸提取物的od值：取200μl的離心上清液加入微量滴定板上，加入2ml濃度為1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/l的naoh溶液，再加入1.2ml的0.1mol/l的甘氨酸，混勻后放置5min，在紫外分光光度計380nm下比色，記錄od值。

s2.3：測定莽草酸標準品的od值并繪制莽草酸標準品的濃度與od值的標準曲線：將sigma莽草酸標準品10mg溶于1.5ml的0.25mol/lhcl中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/lhcl至1.0ml，用上述②步驟測定莽草酸標準品od值，并繪制莽草酸標準品的濃度與od值的標準曲線。其中，od值為吸光度，實驗所測的od值是用gen5酶標儀(美國博騰儀器有限公司生產(chǎn))來測量的，通過莽草酸標準品的濃度與od值的標準曲線，可計算得到每個樣本的莽草酸含量。

在步驟s3中，采用實驗室高光譜成像系統(tǒng),獲取受草甘膦脅迫不同天數(shù)的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株冠層在可見近紅外波段(380-1030nm)的高光譜數(shù)據(jù)，物鏡高度為258mm，相機曝光時間為3s，平臺移動速度為19mm/s。

在步驟s4中，wt將信號分解成高頻的細節(jié)系數(shù)和低頻的近似系數(shù)部分，噪聲通常表現(xiàn)為高頻部分，對高頻部分進行閾值處理，即可有效的去除噪聲的影響。本發(fā)明采用的小波基函數(shù)為db3，分解層數(shù)為6。

在步驟s5中，spa能夠從光譜信息中充分尋找含有最低限度的冗余信息的變量組，有效的提取特征變量，提高建模速度和效率。具體算法如下。

記xk(0)為初始迭代向量，n為需要提取的變量個數(shù)，光譜矩陣為j列；

a：迭代開始前，任選光譜矩陣的1列j，把建模集的第j列賦值給xj，記為xk(0)(即k(0)＝j(luò))；

b：把未選入的列向量位置的集合記為s；

c：分別計算xj對剩下的列向量的投影：

pxj＝xj-(x^tjxk(n-1))xk(n-1)(x^tk(n-1)xk(n-1))^-1，j∈s，其中，x^t表示相應(yīng)列向量的轉(zhuǎn)置，xk表示除xj之外建模集中其他的列向量；

d：記k(n)＝arg(max(||pxj||)，j∈s；

e：令xj＝pxj，j∈s；

f：n＝n+1如果n＜n,回到b循環(huán)計算；

最后，提取出的變量為{xk(n)＝0……，n-1}。對應(yīng)于每一個k(0)和n，分別建立多元線性回歸分析(mlr)模型，得到建模集的交互驗證均方根(rmsecv)，由最小的rmsecv值對應(yīng)的k(0)和n就是最優(yōu)值，其提取的變量即為特征變量。

利用spa算法提取特征波長16個，分別為433.82nm，438.67nm，445.97nm，450.83nm，452.05nm，475.24nm489.93nm，507.12nm，523.14nm，545.38nm，570.2nm，593.88nm，673.08nm，703.54nm，723.93nm，801.01nm

在步驟s6中，應(yīng)用spxy方法選擇建模集144個，預(yù)測集72個。spxy方法在樣本劃分時，把所有的樣本都看作建模集候選樣本,依次從中挑選樣本進建模集。首先選擇歐氏距離最遠的兩個樣本進入建模集,在接下來的迭代過程中擁有最大最小距離的待選樣本被選入建模集,以此類推,以達到所要求的樣本數(shù)目。但其在樣品間距離計算時將x變量和y變量同時考慮在內(nèi),夠有效地覆蓋多維向量空間,從而改善所建模型的預(yù)測能力。其距離公式如下：

式中，p，q均為建模集中的候選樣本

在步驟s7中，對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株，基于全譜和特征波長建立lssvm回歸分析模型，結(jié)果如下表所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)操作簡單環(huán)保，避免了傳統(tǒng)莽草酸含量檢測所需化學(xué)試劑的使用及樣品制備的繁瑣過程，能快速有效地監(jiān)測草甘膦脅迫的轉(zhuǎn)基因玉米植株莽草酸含量，為反映玉米草甘膦的脅迫程度提供有效手段，具有良好的應(yīng)用前景；

(2)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，易于操作，可以實現(xiàn)作物表型的高通量檢測，基本實現(xiàn)自動化檢測。

附圖說明

圖1是本發(fā)明基于高光譜成像技術(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性表型檢測的技術(shù)路線圖。

圖2是本發(fā)明基于轉(zhuǎn)基因玉米植株莽草酸lssvm模型的回歸分析結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，進一步詳細描述。本具體實施方式是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，應(yīng)理解這些方式僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明以轉(zhuǎn)雙價基因(cry1ab/cry2aj-g10evo)的玉米為實施實例，其他的轉(zhuǎn)基因作物加工品的識別可參照該實施例的方法進行。如圖1所示，包括以下步驟：

1.制備實驗樣本。種植120盆轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)入cry1ab/cry2aj-g10evo基因)和非轉(zhuǎn)基因玉米，在玉米生長至3葉期時，將濃度為1,080ga.e.ha^-1的草甘膦溶液置于便攜式co2高壓噴霧器中，分別對80株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株進行噴施作為實驗組，噴施壓力為23lbpol^-2，噴施量為120lha^-1。在同等條件下，分別對40株轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植株噴施等量的水作為對照組。在噴施后的第2、4、6、8天各取40株株噴施草甘膦的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各20株)，20株噴施水的玉米植株(轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米各10株)進行實驗，共有實驗樣本240個。

2.采用紫外分光光度法結(jié)合制定莽草酸標準曲線的方法測定實驗樣本莽草酸含量。①獲取莽草酸提取物：每個樣本取0.1g葉片加入裝有1.5ml的0.25mol/l的hcl提取液的離心管中，在冰浴狀態(tài)下迅速碾磨，于12000r/min離心10min，收集離心上清液。②測定莽草酸提取物的od值：取200μl的離心上清液加入微量滴定板上，加入2ml濃度為1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/l的naoh溶液，再加入1.2ml的0.1mol/l的甘氨酸，混勻后放置5min，在紫外分光光度計380nm下比色，記錄od值。③測定莽草酸標準品的od值并繪制莽草酸標準品的濃度與od值的標準曲線：將sigma莽草酸標準品10mg溶于1.5ml的0.25mol/lhcl中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/lhcl至1.0ml，用上述②步驟測定莽草酸標準品od值，并繪制莽草酸標準品的濃度與od值的標準曲線。其中，od值為吸光度，實驗所測的od值是用gen5酶標儀(美國博騰儀器有限公司生產(chǎn))來測量的，通過莽草酸標準品的濃度與od值的標準曲線，可計算得到每個樣本的莽草酸含量。

3.應(yīng)用高光譜成像系統(tǒng)對受草甘膦脅迫不同天數(shù)的的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米樣本及實驗對照組進行光譜掃描，系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置為：物鏡高度258mm，相機曝光時間3s，平臺移動速度7mm/s。

4.采用小波變換(wt)預(yù)處理獲得的光譜數(shù)據(jù)，小波基函數(shù)為db3，分解層數(shù)為6。

小波變換是將信號分解成高頻的細節(jié)系數(shù)和低頻的近似系數(shù)部分，噪聲通常表現(xiàn)為高頻部分，對高頻部分進行閾值處理，即可有效的去除噪聲的影響。

5.剔除異常樣本24個，應(yīng)用spxy方法選擇建模集和預(yù)測集，建模集樣本144個，預(yù)測集樣本72個。

6.經(jīng)wt預(yù)處理后得到的全譜光譜數(shù)據(jù)作為輸入，建立玉米植株lssvm回歸分析模型。模型建模集和預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)達到了0.972和0.867。

7.基于連續(xù)投影算法(spa)進行特征波長選擇。spa能夠從光譜信息中充分尋找含有最低限度的冗余信息的變量組，有效的提取特征變量，提高建模速度和效率。利用spa算法獲取的特征波長分別為：433.82nm，438.67nm，445.97nm，450.83nm，452.05nm，475.24nm489.93nm，507.12nm，523.14nm，545.38nm，570.2nm，593.88nm，673.08nm，703.54nm，723.93nm，801.01nm

8.spa方法提取特征波長建立的lssvm模型

以spa方法提取的特征波長的反射率值作為lssvm模型的輸入變量，實際測量得到的莽草酸含量作為輸出變量，計算得到多元線性回歸方程。所述的線性回歸模型為：

y＝56967.52*λ1+41852.64*λ2-55015.29*λ3+2881.984*λ4+9109.073*λ5-95879.78*λ6+42727.5*λ7-18709.43*λ8+99941.35*λ9-132229.1*λ10+52584.88*λ11+107.4436*λ11+38980.16*λ13-1926.05*λ14+22470.85*λ15-773.9245*λ16+194.71162

方程中y為莽草酸含量；λ1～λ16分別為高光譜中對應(yīng)的玉米樣本的反射率計算所得的吸光度。

如圖2所示，利用本發(fā)明的線性回歸模型對受草甘膦脅迫不同天數(shù)的玉米植株莽草酸含量的lssvm模型預(yù)測值與真實化學(xué)方法測量值進行了預(yù)測，結(jié)果顯示建模集和預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)達到了0.891和0.784。獲得了較好的的預(yù)測精度。說明本發(fā)明的線性回歸模型能夠有效的檢測受草甘膦脅迫的玉米莽草酸含量，為轉(zhuǎn)基因玉米草甘膦耐受性的快速無損檢測提供技術(shù)和理論支持。本發(fā)明大大縮短了檢測的時間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測成本。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。