專利名稱:利用蜈蚣草孢子進(jìn)行快速組培繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)和種質(zhì)保存方法，更具體地涉及利用蜈蚣草孢子進(jìn)行組織培養(yǎng)和種苗繁殖的方法。
背景技術(shù)：
在國內(nèi)外，砷污染都是一個非常普遍、非常嚴(yán)重的環(huán)境問題。陳同斌等人發(fā)現(xiàn)蜈蚣草(Pteris vittata L.，鳳尾蕨屬)對砷毒具有極強(qiáng)的耐性，可以從砷污染土壤中大量富集砷，并將其積累在地上部，從而可以利用其修復(fù)和治理受砷污染的土壤(中國發(fā)明專利公開號CN1397390A，陳同斌等人，《科學(xué)通報(bào)》，2002年47卷第3期207～210頁)。此外，蜈蚣草還可以作為花卉作物，用于生產(chǎn)鮮切花。
蜈蚣草孢子很小，對外界的抵抗力不強(qiáng)，因而在大田條件下用孢子育苗很難成功。如果靠其地下莖進(jìn)行繁殖，不僅繁殖系數(shù)低，而且費(fèi)時、費(fèi)力，也同樣不能滿足實(shí)際需求。因此，在蜈蚣草的大規(guī)模實(shí)際中，需要解決大量種苗的問題。雖然尹懷約(《四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)》，1991年，第12卷20-22頁)報(bào)道過有關(guān)蜈蚣草的組培方法，但是我們采用其報(bào)道的方法進(jìn)行過多次試驗(yàn)，但是始終沒有成功。采用蜈蚣草地下莖雖然也可以進(jìn)行組培，但是從野外將活體植物攜帶回來時，如果途中的時間太長則可能會導(dǎo)致蜈蚣草的死亡，而且攜帶的地下莖數(shù)量也很有限。與地下莖不同，蜈蚣草的孢子非常小，攜帶非常方便，而且也很容易保存，在野外取樣的途中經(jīng)過長時間的放置也不會死亡。因此，對于大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用而言是一種最好的組培方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用蜈蚣草孢子進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)，在基本培養(yǎng)基中加入適宜的激素來誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，并產(chǎn)生孢子體植株，然后通過孢子體植株進(jìn)行組培繁殖，從而迅速得到大量組培苗。這種大規(guī)?？焖俜敝撤N苗的方法，不僅為利用蜈蚣草修復(fù)砷污染環(huán)境和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)切花提供足夠的苗源，而且可以保證所提供的種苗對砷的富集能力最強(qiáng)、生物量最大或株型最好。
本發(fā)明的目的在于針對上述問題，提供一種利用蜈蚣草孢子進(jìn)行快速繁殖和種質(zhì)保存的方法。本發(fā)明的方法不受自然條件、地區(qū)差異或氣候的限制，繁殖系數(shù)高、速度快，有利于優(yōu)良種質(zhì)資源的長期保存。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，其實(shí)現(xiàn)過程包括孢子的消毒、培養(yǎng)和外植體的采集，愈傷組織的誘導(dǎo)，繼代培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，溫室練苗和定植。
(1)孢子的消毒、培養(yǎng)和外植體的采集
從蜈蚣草成熟孢子葉，孢子囊群呈棕色，自上到下取葉片頂端第4片至第30片羽葉的孢子。用70％乙醇消毒0.5～2分鐘，再用0.1％HgCl2溶液消毒1～4分鐘，用無菌水沖洗6遍。將孢子播種到1/2Knop(培養(yǎng)基傳統(tǒng)配方，以發(fā)明人Knop名字命名，商購自北京化學(xué)試劑公司)+0.5％CaCO3+1％蔗糖培養(yǎng)基質(zhì)上，用封口膜封好后置于溫度為25℃、光照強(qiáng)度為1000lux的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天光照時間為16小時。培養(yǎng)40～70天后，則孢子萌發(fā)成為原葉體，在原葉體上可以形成雌雄配子體，雌雄配子融合形成合子，然后由合子長成所需的無菌孢子體植株(外植體)。
(2)愈傷組織的誘導(dǎo)
將孢子萌發(fā)后長成的無菌孢子體植株(外植體)轉(zhuǎn)接到MS(培養(yǎng)基傳統(tǒng)配方，以1962年兩個發(fā)明人名字共同命名，商購自北京化學(xué)試劑公司)+KT(6-糠氨基嘌呤，商購自北京化學(xué)試劑公司)4.6-26.6μmol/L+NAA(a奈乙酸，商購自北京化學(xué)試劑公司)0.1-10μmol/L培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)1個月，可誘導(dǎo)孢子體植株產(chǎn)生愈傷組織，并且在這些綠色球狀愈傷組織的頂端可以長出孢子體葉片。
(3)孢子體植株的繼代培養(yǎng)
將誘導(dǎo)出來的未長根的外植體(孢子體植株)轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基(MS+KT 2.3-23.0μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖)上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每個繼代周期約需25～30天。
(4)孢子體植株的生根
將誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)的孢子體植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS+KT 0.5-2.3μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％瓊脂+1％蔗糖)上進(jìn)行生根培養(yǎng)。20～30天后，孢子體植株陸續(xù)長出根。
(5)組培苗的練苗和定植
將經(jīng)過生根培養(yǎng)基培養(yǎng)長根后的蜈蚣草植株在移栽到大田之前需要進(jìn)行練苗和苗圃育苗。育苗前要在溫室中練苗約7天時間，并注意防止環(huán)境的突然改變而造成幼苗的死亡。練苗的溫度25℃左右，苗床用薄膜覆蓋，使空氣相對濕度保持在70％以上。待幼苗長大后即可移栽到大田中。



圖1是蜈蚣草孢子葉取樣位置示意圖及孢子照片。
具體實(shí)施方式
下面列舉實(shí)施例說明本發(fā)明的可行性以及效果，但是并不局限于此。
實(shí)施例1
從蜈蚣草(產(chǎn)地湖南郴州)成熟孢子葉，孢子囊群呈棕色，自上到下取葉片頂端第6片至第41片羽葉的孢子，孢子形成原葉體的百分比超過90％。取樣位置示意圖及孢子照片見圖1。
將成熟孢子用70％乙醇消毒1.5分鐘，再用0.1％HgCl2溶液消毒3分鐘，用無菌水沖洗6遍，孢子微生物污染率低于10％。將孢子播種到1/2Knop+0.5％CaCO3+1％蔗糖培養(yǎng)基上，置于溫度為25℃、光照強(qiáng)度為1000lux的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天光照時間為16小時，培養(yǎng)60天后，則孢子萌發(fā)成為原葉體并長成所需的無菌孢子體植株，原葉體產(chǎn)生孢子體植株的比例可達(dá)56％。其它配方培養(yǎng)基的孢子植株產(chǎn)生率均不及此配方，具體見表1。
表1不同基質(zhì)配方的孢子植株產(chǎn)生率
將孢子萌發(fā)后長成的孢子體植株轉(zhuǎn)接到MS+KT 4.6μmol/L+NAA0.1μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖；MS+KT 10μmol/L+NAA 5μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖；MS+KT 26.6μmol/L+NAA 10μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖三個配方的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1個月，均可誘導(dǎo)產(chǎn)生出愈傷組織(表2)，并且在這些綠色球狀愈傷組織的頂端長出孢子體葉片，第二種配方每株最多分化出26個新的孢子體植株。在MS+6-BA(6-芐氨基嘌呤，北京化學(xué)試劑公司)4.4-26.6μmol/L+NAA 0.0-2.7μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)僅誘導(dǎo)產(chǎn)生綠色球狀愈傷組織，但不能分化出孢子體葉片和形成植株。
表2不同基質(zhì)配方的誘導(dǎo)效果
將誘導(dǎo)出來的未長根的孢子體植株轉(zhuǎn)移到MS+KT 2.3μmol/L+NAA2.7μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖；MS+KT 10μmol/L+NAA 4μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖；MS+KT 23.0μmol/L+NAA 5.4μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖三種繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每個繼代周期約25天。經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)后，每個孢子體植株平均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生約95～100個的新孢子體植株。
表3不同基質(zhì)配方的繼代培養(yǎng)
將誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)的孢子體植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基選用1/2MS+KT 0.5μmol/L+NAA 2.7μmol/L+0.7％瓊脂+1％蔗糖；1/2MS+KT 1μmol/L+NAA 4μmol/L+0.7％瓊脂+1％蔗糖；1/2MS+KT 2.3μmol/L+NAA5.4μmol/L+0.7％瓊脂+1％蔗糖三種，25天后，孢子體植株(n＝33)開始長根，誘導(dǎo)長根的百分率為76％～100％，隨著KT含量的增加，長根率逐漸下降。在Knop+NAA 2.7μmol/L+0.7％瓊脂；Knop+NAA 3.5μmol/L+0.7％瓊脂；Knop+NAA 4.5μmol/L+0.7％瓊脂或者M(jìn)S微量元素+NAA2.7μmol/L+0.7％瓊脂；MS微量元素+NAA 4μmol/L+0.7％瓊脂；MS微量元素+NAA 5.4μmol/L+0.7％瓊脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)長根的百分率為76％～85％。
表4不同基質(zhì)配方的生根率
經(jīng)過生根培養(yǎng)基培養(yǎng)長根后的蜈蚣草幼苗在溫室中練苗7天時間。練苗的溫度25℃左右，苗床用薄膜覆蓋，空氣相對濕度保持在70％以上。待幼苗長大后即可移栽。
將幼苗移栽到含砷507mg/kg的土壤中，種植100天后，蜈蚣草的地上部含砷量高達(dá)3570mg/kg。這證明，經(jīng)過組培后的蜈蚣草對砷仍具有很強(qiáng)的超富集功能。
實(shí)施例2
操作同實(shí)施例1，在步驟2中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+KT 4.6μmol/L+NAA 0.1μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖。在步驟4中使用的生根培養(yǎng)基為1/2MS+KT 0.5μmol/L+NAA 2.7μmol/L+0.7％瓊脂+1％蔗糖。接種蜈蚣草孢子10個，經(jīng)過1次繼代培養(yǎng)后，獲得孢子體植株79株，平均每個孢子形成7.9個孢子體植株。
實(shí)施例3
取實(shí)施例1中所繁育的組培苗，經(jīng)過200多天保存后這批苗仍保持旺盛的活力。通過轉(zhuǎn)接、增殖等系列培植，練苗后可以順利移栽到大田中并存活。移栽到含砷507mg/kg的土壤中栽培100天后，其地上部砷的含量可高達(dá)3800mg/kg。孢子產(chǎn)地蜈蚣草植株中砷含量變化范圍為3000-5000mg/kg。這證實(shí)，長期保存過程中蜈蚣草對砷的富集能力沒有退化。這意味著在應(yīng)用蜈蚣草進(jìn)行修復(fù)大面積砷污染土壤時，本發(fā)明可以用于提供足夠的蜈蚣草苗源。另外，本發(fā)明的方法不受自然條件、地區(qū)差異或氣候的限制，繁殖系數(shù)高、速度快，可以用于長期保存蜈蚣草優(yōu)良種質(zhì)資源。
權(quán)利要求
1.一種利用蜈蚣草孢子進(jìn)行組織培養(yǎng)和繁殖種苗的方法，包括選用通過孢子培養(yǎng)而成的蜈蚣草孢子體植株作為外植體，在基本培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)出芽，其特征是孢子經(jīng)過消毒和培養(yǎng)形成孢子體植株后，還需進(jìn)一步經(jīng)過愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、誘導(dǎo)生根、練苗和育苗過程，最終形成組培苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是選用蜈蚣草成熟孢子葉，孢子囊群呈棕色，自上到下取葉片頂端第6片至第41片羽葉的孢子。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征是選用由蜈蚣草孢子經(jīng)過消毒和無菌培養(yǎng)所得到的孢子體植株作為外植體。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是蜈蚣草孢子的消毒和培養(yǎng)過程為用70％乙醇消毒0.5～2分鐘，再用0.1％HgCl2溶液消毒1～4分鐘，用無菌水沖洗6遍，將孢子播種到1/2Knop+0.5％CaCO3+1％蔗糖培養(yǎng)基上或1/2MS+0.5％CaCO3+1％蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是誘導(dǎo)培養(yǎng)基選用MS+KT(6-糠氨基嘌呤)4.6-26.6μmol/L+NAA(a奈乙酸)0.1-10μmol/L；繼代培養(yǎng)基選用MS+KT 2.3-23.0μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖；生根培養(yǎng)基選用1/2 MS+KT 0.5-2.3μmol/L+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％瓊脂+1％蔗糖，或者Knop+NAA 2.7-4.5μmol/L+0.7％瓊脂，或者M(jìn)S微量元素+NAA 2.7-5.4μmol/L+0.7％瓊脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是蜈蚣草組培苗在移栽前要在溫室中練苗7天時間，練苗的溫度25℃左右，苗床用薄膜覆蓋，使空氣相對濕度保持在70％以上。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)的方法，更具體地涉及利用蜈蚣草(Pteris vittata L.)孢子進(jìn)行組織培養(yǎng)和種苗繁殖的方法。該方法是利用蜈蚣草成熟孢子在MS+KT(6－糠氨基嘌呤)4.6－26.6μmol/L+NAA(a奈乙酸)0.1－10μmol/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出芽，繼代培養(yǎng)基采用MS+KT 2.3－23.0μmol/L+NAA 2.7－5.4μmol/L+0.7％瓊脂+3％蔗糖培養(yǎng)基，選用1/2MS+KT 0.5－2.3μmol/L+NAA 2.7－5.4μmol/L+0.7％瓊脂+1％蔗糖，或者Knop+NAA2.7－4.5μmol/L+0.7誘導(dǎo)生根，再進(jìn)行練苗和育苗過程，最終形成組培苗。經(jīng)過組培后的蜈蚣草對砷的富集能力沒有退化，因此，在應(yīng)用蜈蚣草修復(fù)大面積砷污染土壤時，本發(fā)明可以用于提供足夠的種苗。
文檔編號A01H4/00GKCN1954667SQ200510086732
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月27日
發(fā)明者陳同斌, 莫良玉, 廖曉勇, 雷梅, 黃澤春 申請人:中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan