專利名稱:缺水誘導(dǎo)型啟動子的制作方法
缺水誘導(dǎo)型啟動子
聯(lián)合研究協(xié)議
在功能基因組學(xué)和表征用于改進植物的植物基因的領(lǐng)域內(nèi)，作為在下
述聯(lián)合研究協(xié)議的范圍內(nèi)進行活動的結(jié)果，由Mendel Biotechnology, Inc. 和Monsanto Corporation完成或代表它們完成本發(fā)明，所述聯(lián)合研究協(xié)議 在進行本發(fā)明的日期或之前生效。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及植物基因組學(xué)，更特定地涉及在植物對缺水(water deficit) 的應(yīng)答期間介導(dǎo)基因表達的缺水誘導(dǎo)型啟動子。
發(fā)明背景
在自然環(huán)境中，植物通常在不利條件下生長，包括缺水條件例如干 旱——通常表征為長期缺水的一種嚴(yán)重的低水可用性(availability)形式。缺 水或脫水(water deprivation)可延遲生長和發(fā)育，降低生產(chǎn)力，并且在極端 情況下引起植物死亡。低的水可用性是全世界作物產(chǎn)量降低的一個主要因 素。低的水可用性引起的植物問題包括細(xì)胞水撤出(withdrawal^ |起的機械 脅迫。干旱還可導(dǎo)致植物對多種疾病更加易感(Simpson， ed. (1981) "The Value of Physiological Knowledge of Water Stress in Plants", in Water Stress on Plants, Pmeger, NY, pp. 235-265)。
包括例如轉(zhuǎn)錄因子(TFs)在內(nèi)的大量多肽已經(jīng)顯示能提高植物物種對缺 水條件的耐性(例如見公開號no. WO2004076638)。然而，被過表達時 賦予作物物種缺水耐性的多種蛋白質(zhì)的用途的重要限制可包括與這些多肽 的組成型過表達相關(guān)的不良副作用?？赡艿亩嘈?pleiotropic effects)是常 見的，例如小尺寸、延遲的生長、提高的疾病敏感度和發(fā)育與開花時間的 0變更。已經(jīng)提出賦予缺水耐性的基因使總體適合度(fitness)和發(fā)育遭受損失。為了克服這些限制開始進行本研究，從而發(fā)現(xiàn)和評價應(yīng)答缺水條件的 大部分啟動子序列的效用。這些啟動子序列可被用于在干旱階段或其它缺 水條件期間調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達，并因此可被用于誘導(dǎo)下述多肽的過表達，所 述多肽在需要時能夠賦予提高的缺水耐性，但是沒有可與其組成型過表達 相關(guān)的不利的發(fā)育或形態(tài)影響。開發(fā)了使用這些啟動子序列調(diào)節(jié)多肽的大 量轉(zhuǎn)基因植物，并分析了所述植物對缺水條件的耐性。許多這些啟動子序 列可被用于生產(chǎn)有商業(yè)價值的植物和作物，以及制造和使用它們的方法。
因此本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法和組合物，其中與組成型 過表達轉(zhuǎn)錄因子的植物相比，相同轉(zhuǎn)錄因子的缺水誘導(dǎo)型過表達賦予了增 強的缺水耐性，并對產(chǎn)量、外觀、品質(zhì)或適合度具有降低影響或沒有影 響。本發(fā)明的其它方面和實施方案在下文描述，并且可從作為整體的本公 開內(nèi)容的教導(dǎo)中得出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及可用于轉(zhuǎn)化植物的啟動子序列。啟動子序列能夠應(yīng)答缺水 條件，并且可用于驅(qū)動編碼下述多肽的多核苷酸序列的表達，所述多肽能
夠賦予提高的對缺水的耐性，所述缺水包括干旱、干燥(desiccation)、脫水 或相關(guān)的高滲脅迫(例如冷凍或高鹽濃度)。因此，多肽可以以缺水誘導(dǎo) 型的方式被表達。
本發(fā)明還提供了包含缺水誘導(dǎo)型啟動子的經(jīng)分離的核酸，所述缺水誘 導(dǎo)型啟動子包含SEQIDNOs: 1 -9提供的任何啟動子序列。本發(fā)明的缺水 誘導(dǎo)型啟動子可包括其功能性部分，前提是功能性部分也具有缺水誘導(dǎo)型 啟動子的功能。啟動子的功能性部分可具有SEQIDNOs: 1 -9的核酸序列 的約50、 100、 125、 150、 175、 200、 225、 250、 275、 300、 325、 350、 375、 400、 425、 447、 450、 460、 475、 500、 525、 550、 575、 600、 605、 625、 650、 675、 700、 725、 750、 766、 775、 776、 780、 800、 825、 850、 875、 900、 907、 928或936個連續(xù)核苷酸，以及這些尺寸內(nèi)所 有長度的連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明還涉及表達載體，所述表達載體可包含本發(fā)明的啟動子序列。
7缺水誘導(dǎo)型啟動子可包含SEQ ID NOs: 1到9中的任何或其功能性部分， 前提條件是所述功能性部分還具有缺水誘導(dǎo)型啟動子功能。啟動子包含具 有RNA聚合酶結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄起始結(jié)構(gòu)域。啟動子相對于編碼下述多肽 的編碼序列而言位于5'，并且與所述編碼序列可操作連接，所述多肽賦予 植物提高的對缺水條件的耐性。作為SEQ ID NOs: 10到54 (其中每個包 含SEQ ID NOs: 1-9中任何的啟動子，以及編碼下述多肽的核酸序列，所 述多肽賦予提高的對缺水的耐性)提供的表達載體中許多已被引入植物 中，并且所述植物不僅顯示具有比對照植物更強的缺水耐性，而且經(jīng)轉(zhuǎn)化 的植物通常具有野生型或接近野生型的形態(tài)和發(fā)育(有助于改進的缺水耐 性的許多多肽在被組成型過表達時也可以引起不想要的形態(tài)和/或發(fā)育性 狀)。
本發(fā)明包括包含本發(fā)明的缺水誘導(dǎo)型啟動子的宿主植物細(xì)胞，所述本 發(fā)明的缺水誘導(dǎo)型啟動子包含SEQ ID NOs: 1到9中任何或其功能性部 分，其中所述功能性部分具有啟動子功能。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的缺水誘導(dǎo)型啟動子的轉(zhuǎn)基因植物，和本發(fā) 明的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子，所述本發(fā)明的缺水誘導(dǎo)型啟動子包含 SEQ ID NOs: 1到9中任何或其功能性部分，其中所述功能性部分具有啟 動子功能。
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)下述轉(zhuǎn)基因植物的方法或用于提高植物對缺水 耐性的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有比對照植物更強的對缺水條件的耐性。 所述方法步驟包括產(chǎn)生包含SEQ ID NOs: 1到9中任何啟動子序列或其功 能性部分的表達載體，其中所述功能性部分具有啟動子功能。啟動子序列 與編碼下述多肽的核苷酸序列可操作連接，所述多肽在植物中提高缺水耐 性，并且在缺水條件下所述啟動子序列驅(qū)動編碼所述多肽的核苷酸序列表 達。然后用表達載體轉(zhuǎn)化靶植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中 過表達多肽時(例如在缺水時間段中)，經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物會比對照植物具有 更強的對缺水條件的耐性。通過該方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物可與以下雜交， 以產(chǎn)生包含表達載體的轉(zhuǎn)基因種子其自身，來自與轉(zhuǎn)基因植物相同株系 的植物，非轉(zhuǎn)基因植物，野生型植物，或來自不同轉(zhuǎn)基因株系植物的另一轉(zhuǎn)基因植物。
序列表和附圖簡述
序列表提供了本發(fā)明的示范性多核苷酸和多肽序列。與序列的用途相 關(guān)的性狀包括在實施例中。
CD-ROM拷貝1和拷貝2和序列表的CRF拷貝是只讀存儲器——計 算機可讀的光盤。各自含有一份ASCII文本格式的序列表拷貝。序列表稱 作"MBI0079P.ST25.txt"，這些CD-ROMs中每份含有的序列表電子文件在 2007年2月7日創(chuàng)建，并且大小為127千字節(jié)。序列表在CD-ROM盤上 的拷貝通過引用整體并入本文。

圖1顯示了對有花植物目之間種系發(fā)生關(guān)系的保守性評估(從SoWs etal. (1997)^4"". M^owz'84: l-49修飾而來)。具有單個子葉的 這些植物(單子葉植物)是嵌套在至少兩種主要的雙子葉植物譜系內(nèi)的單 源進化枝(monophyletic clade);雙子葉植物被進一步分為薔薇類(rosids) 和菊類(asterids)。擬南芥04ra6/t/o/w/力是被戈!j分在Brassicales目中的一 種薔薇類真雙子葉植物(eudicot);水稻是單子葉植物Poales目的一員。 圖1從Daly et al. (2001)尸/a"/尸A"z'o/. 127: 1328-1333改編而來。
圖2顯示種系發(fā)生的樹狀圖，該圖展示了高等植物分類群的種系發(fā)生 關(guān)系，包括含有番茄和擬南芥的進化枝，從Ku et al. (2000) iVoc. A^/. ^c^/. 5W. USA 97: 9121-912; and Chase et al. (1993) ^肌M&纖W淑GW. 80: 528-580改編而來。
圖3顯示在粘土罐實驗中誘導(dǎo)對應(yīng)于九種干旱-啟動子的擬南芥天然基 因。該實驗使用受干旱脅迫的或充分澆水的pMEN65 (空載體)野生型對 照植物。對植物進行干旱脅迫至萎蔫點(對粘土罐實驗而言典型的是通常 應(yīng)對其進行再澆水的點)，并針對x-軸上所列每個基因使用基因特異引物 進行RT-PCR。循環(huán)計數(shù)閾值是下述實時PCR循環(huán)數(shù)，在所述循環(huán)數(shù)下可 高于背景檢測感興趣的RNA轉(zhuǎn)錄本。用18SRNA標(biāo)準(zhǔn)化。間隔紋的柱代 表充分澆水的植物的平均循環(huán)閾值。實心柱表示受干旱脅迫的植物的平均 循環(huán)閾值。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于修飾植物表型的多核苷酸和多肽，尤其是與相對于對 照植物(例如遺傳上未改變的植物或非轉(zhuǎn)基因植物例如相同物種的野生型 植物,或包含空表達載體的轉(zhuǎn)基因植物株系)而言提高的缺水(例如干 燥、脫水或干旱)耐性相關(guān)的啟動子序列。在本公開文本通篇中，涉及和/ 或明確地并入多種信息來源。信息來源包括科學(xué)期刊文章、專利文件、教 科書和萬維網(wǎng)頁地址。盡管這些信息來源的參考清楚地表明它們可被本領(lǐng) 域技術(shù)人員使用，但是本文所列的各個和每個信息來源明確地以其整體并 入，無論是否標(biāo)注了 "通過引用并入"的特定敘述。各個和每個信息來源 的內(nèi)容和教導(dǎo)可以被依賴并用于制作和使用本發(fā)明的實施方案。
在本文中和本發(fā)明附帶的權(quán)利要求
中所使用時，單數(shù)形式"一個"
("a", "an")和"一種"("the")包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清楚地指出其它方 式。因此，例如關(guān)于"宿主細(xì)胞"包括多種這類宿主細(xì)胞，關(guān)于"脅迫" 表示一種或多種脅迫以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，依此類推。 定義
"核酸分子"是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。其可以是基因 組或合成來源的、雙鏈或單鏈的DNA或RNA，并且與碳水化合物、脂 質(zhì)、蛋白質(zhì)或其它材料組合以進行具體的活動例如轉(zhuǎn)化，或形成有用的組 合物例如肽核酸(PNA)。
"多核苷酸"是核酸分子，其包含多個聚合的核苷酸，例如至少約15 個連續(xù)的聚合的核苷酸。多核苷酸可以是核酸、寡核苷酸、核苷酸或其任 何片段。在許多情況下，多核苷酸包括編碼多肽(或蛋白質(zhì))或其結(jié)構(gòu)域 或片段的核苷酸序列。另外，多核苷酸可包含啟動子、內(nèi)含子、增強子 區(qū)、多聚腺苷酸化位點、反義起始位點、5'或3'非翻譯區(qū)、報告子基因、 可選擇標(biāo)記物等等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA。多核苷 酸任選地包含經(jīng)修飾的堿基或經(jīng)修飾的主鏈。多核苷酸可以是例如基因組 DNA或RNA、轉(zhuǎn)錄本(例如mRNA) 、 cDNA、 PCR產(chǎn)物、經(jīng)克隆的 DNA、合成的DNA或RNA等等。多核苷酸可與碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或其它材料組合以進行具體的活動例如轉(zhuǎn)化，或形成有用的組合物例如
肽核酸(PNA)。多核苷酸可包含有義或反義方向的序列。"寡核苷酸"基 本與術(shù)語擴增引物(amplimer)、弓l物、寡聚物、元件、靶標(biāo)和探針等同， 并優(yōu)選地是單鏈的。
"重組的多核苷酸"是不處于其天然狀態(tài)的多核苷酸，例如包含天然 不存在的核苷酸序列的多核苷酸，或不處于其天然存在的前后序列(context) 中的多核苷酸，例如從典型地天然與之接近的核苷酸序列中分離，或與典 型地天然與之不接近的核苷酸序列相鄰(或相連)。例如，所述序列可被 克隆進載體中，或以其它方式與一個或多個另外的核酸重組。
"經(jīng)分離的多核苷酸"是天然存在或重組的多核苷酸，其存在于其典 型地天然存在的細(xì)胞之外，經(jīng)過純化或未經(jīng)純化。任選地，對經(jīng)分離的多 核苷酸進行一個或多個富集或純化步驟，例如細(xì)胞裂解、提取、離心、沉 淀等等。
"基因"或"基因序列"是指基因的部分或完整的編碼序列、其互補 體，及其5'或3'非反義區(qū)。基因還是遺傳的功能單位，并且在物理方面是 沿著涉及生產(chǎn)多肽鏈的DNA分子(例如RNA，在RNA病毒的情況下) 的具體核苷酸區(qū)段或序列。可對后者進行隨后的加工，例如化學(xué)修飾或折 疊，以獲得功能性蛋白質(zhì)或多肽?；蚩梢允墙?jīng)分離的、經(jīng)部分分離的、 或存在于生物的基因組中。例如，轉(zhuǎn)錄因子基因編碼轉(zhuǎn)錄因子多肽，其可 以是功能性的，或需要被加工從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄啟動物的功能。
在實踐中，可通過順式-反式測試來定義基因，所述測試是測定兩個突 變是否發(fā)生在相同基因中和可用于測定遺傳活性單位界限的遺傳測試
(Rieger et al. (1976) Glossary of Genetics and Cytogenetics: Classical and Molecular, 4th ed.， Springer Verlag， Berlin)?；蛲ǔ０ㄔ诰幋a區(qū)之前
("前導(dǎo)序列(leaders)";上游)和之后("尾區(qū)(trailers)";下游)的區(qū) 域?；蛞部砂ú迦氲?、非編碼的序列，稱作"內(nèi)含子"，位于稱作
"外顯子"的個體編碼區(qū)段之間。大部分基因具有相關(guān)的啟動子區(qū)，其為 轉(zhuǎn)錄起始密碼子5'的調(diào)節(jié)序列(存在不具有可辨認(rèn)的啟動子的一些基 因)。基因的功能也可通過增強子、操縱子和其它調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)。
ii"啟動子"或"啟動子區(qū)"是指DNA區(qū)段上的RNA聚合酶結(jié)合位 點，其相對于處于啟動子調(diào)節(jié)控制下的編碼序列而言通常存在于上游或 5'。啟動子通常會包含被轉(zhuǎn)錄因子識別的應(yīng)答元件。轉(zhuǎn)錄因子與啟動子序 列結(jié)合，募集RNA聚合酶，所述RNA聚合酶從編碼區(qū)合成RNA。啟動 子序列中的異化性解釋了轉(zhuǎn)錄起始的不同效率，并因此解釋了不同基因差 異的相對表達水平。
"啟動子功能"包括通過提供RNA聚合酶和/或其它因子例如轉(zhuǎn)錄因 子的識別位點，來調(diào)節(jié)位于啟動子控制下的編碼序列的表達，所述因子均 是在轉(zhuǎn)錄起點起始轉(zhuǎn)錄所必需的。"啟動子功能"也可包括由啟動子序列 確定的基因編碼序列被轉(zhuǎn)錄的程度。
啟動子或啟動子區(qū)可包括本發(fā)明序列表中存在的啟動子的變異，所述 變異可通過與其它調(diào)節(jié)序列連接、隨機誘變、受控制的誘變和/或通過添加 或重復(fù)增強子序列衍生而來。本發(fā)明序列表中公開的啟動子及其具有生物 功能的等同物或變體被包含在表達載體中并引入宿主植物中時，可驅(qū)動可 操作連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄。啟動子例如序列表中存在的那些(即SEQ ID NOs: 1-9)可被用于產(chǎn)生含有必需啟動子元件的具有相似功能的啟動 子。本發(fā)明的功能性啟動子也可包括SEQIDNO: 1-9中任何的功能性部 分，前題條件是功能性部分也具有缺水誘導(dǎo)型啟動子功能。
"多肽"是這樣的氨基酸序列，其包含多個連續(xù)的聚合的氨基酸殘 基，例如至少約15個連續(xù)的聚合的氨基酸殘基。在本申請中涉及的許多 情況下，多肽包含的聚合的氨基酸殘基序列是轉(zhuǎn)錄因子或其結(jié)構(gòu)域或部分 或片段。另外，多肽可包含(i)定位結(jié)構(gòu)域；(ii)活化結(jié)構(gòu)域；(iii)阻遏結(jié) 構(gòu)域；(iv)寡聚化結(jié)構(gòu)域；(v) DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域；等等。多肽任選地包含經(jīng) 修飾的氨基酸殘基、不由密碼子編碼的天然存在的氨基酸殘基、非天然存 在的氨基酸殘基。
"蛋白質(zhì)"是指氨基酸序列、寡肽、肽、多肽或其部分，無論是天然 存在的或合成的。
"重組的多肽"是重組多核苷酸的翻譯產(chǎn)生的多肽。"合成的多肽" 是使用本領(lǐng)域公知的方法，通過分離的氨基酸殘基的連續(xù)聚合產(chǎn)生的多肽。"經(jīng)分離的多肽"無論是天然存在或是重組的多肽，在細(xì)胞中(或細(xì) 胞外)都比其天然狀態(tài)在野生型細(xì)胞中更加富集，例如富集多于約5%，
富集多于約10%，或富集多于約20%、或多于約50%、或更多，即或者可 標(biāo)注為相對于標(biāo)準(zhǔn)化為100%的野生型，富集至105%、 110%、 120%、 150%或更多。這樣的富集不是野生型植物天然應(yīng)答的結(jié)果。或者，或另 外，經(jīng)分離的多肽從其天然結(jié)合的其它細(xì)胞組分中分離，例如通過本文的 多種蛋白質(zhì)純化方法中任何來實現(xiàn)。
"同源性"是指參照序列與新測序的克隆插入物或其編碼的氨基酸序 列的至少一個片段之間的序列相似性。
"同一性"或"相似性"是指兩條多核苷酸序列或兩條多肽序列之間 的序列相似性，同一性是更加嚴(yán)格的比較。短語"百分比同一性"和"同 一性％"是指在兩條或更多條多核苷酸序列或兩條或更多條多肽序列的比 較中發(fā)現(xiàn)的序列相似性的百分比。"序列相似性"是指兩條或更多條多核 苷酸序列之間堿基對序列的百分比相似性(通過任何合適的方法測定)。 兩條或更多條序列可來自0-100%相似的任何地方，或者是其間的任何整 數(shù)值?？赏ㄟ^比較每條序列中的位置測定同一性或相似性，所述位置可以 為了比較的目的排列。當(dāng)被比較的序列中的一個位置被相同的核苷酸堿基 或氨基酸占據(jù)時，所述分子在這個位置上是相同的。多核苷酸序列之間的 相似性或同一性程度是多核苷酸序列共享的位置上相同、匹配或相應(yīng)核苷 酸數(shù)量的函數(shù)。多肽序列的同一性程度是多肽序列共享的相應(yīng)位置上相同 氨基酸數(shù)量的函數(shù)。多肽序列的同源性或相似性程度是多肽序列共享的相 應(yīng)位置上氨基酸數(shù)量的函數(shù)。
"互補"是指嘌呤和嘧啶之間通過堿基配對的天然氫鍵合。例如，序 列A-C-G-T (5' -> 3')與其互補體A-C-G-T (5' -> 3')或A-C-G-U (5' -> 3')形成 氫鍵。如果兩條單鏈的分子中只有一些核苷酸鍵合，則被認(rèn)為是部分互 補，或如果所有核苷酸鍵合則被認(rèn)為是"完全互補(completely complementary)"。核苷酸鏈之間的互補性程度影響雜交和擴增反應(yīng)的效 率和強度。"全部互補(Fully complementary)"是指下述情況，其中鍵合在 每個堿基對及其在一對序列中的互補體之間發(fā)生，并且兩條序列具有相同物和旁 系同源物"的章節(jié)中定義。簡言之，直系同源物和旁系同源物是具有類似 序列和功能的進化上相關(guān)的基因。直系同源物是不同物種中通過物種形成 事件衍生的結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因。旁系同源物是單一物種中通過重復(fù)事件衍生 的結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因。術(shù)語"等同物(equivalog)"描述了從其最后一個共同祖先開始關(guān)于功 能保守的一組同源蛋白質(zhì)的成員。相關(guān)蛋白質(zhì)被歸入等同物家族中，或者 歸入具有其它分級確定的同源性類型的蛋白質(zhì)家族中。該定義在基因組研 究協(xié)會(TIGR)萬維網(wǎng)(www)網(wǎng)頁"tigr.org"上在100 pE m_2 s")下并澆水14 天。然后停止?jié)菜⒐拮釉谖埳戏胖?-10天的時間段。在該時間段 后，指定從0-6的視覺定量的"干旱分?jǐn)?shù)"來記錄視覺干旱脅迫癥狀的程 度。"6"分對應(yīng)于無視覺癥狀，而"0"分對應(yīng)于極度萎蔫并且葉具有 "易碎的"結(jié)構(gòu)。在干旱時間段結(jié)束時，將罐子再澆水并在5-6天后評 分；計數(shù)每個罐子中存活的植物數(shù)量，并計算罐子中存活的總植物的比 例。
結(jié)果的分析。典型地，將6個或更多個轉(zhuǎn)基因株系的罐子與6個或更 多個適當(dāng)?shù)膶φ罩参锉容^。針對轉(zhuǎn)基因株系和野生型罐子二者計算平均干 旱評分和平均植物存活比例(存活率)。在每種情況下，計算表示兩個均 值之間差異顯著性的,值。然后在結(jié)果表中展示具體項目每次種植的每個 轉(zhuǎn)基因株系的結(jié)果。
p-值的計算。用對數(shù)回歸分析存活率，從而說明隨機變量是0和1之
間比例的事實。報道的/7-值是以回歸對數(shù)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，與對照相比
實驗比例的顯著性。
用實驗和對照組之間的非參數(shù)檢驗分析干旱評分，所述干旱評分是沒 有真實數(shù)字含義的有序因數(shù)(ordered factor)。用Mann-Whitney秩和檢驗
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(rank-sum test)計算,值。如果實驗株系以p < 0.11的水平比對照表現(xiàn)更好 或更差，則標(biāo)注為顯著。
實施例VII用于處于干旱誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)控制下的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)
基因植物的缺水耐性
通常，對該實施例中所述的缺水實驗而言，測試三個過表達物 (overexpressors)的株系，并且在它們被測定為統(tǒng)計學(xué)顯著(p < O.ll)時展示 結(jié)果。在一組典型的實驗中，選擇在外觀上為野生型的株系用于土壤干旱 實驗，例外在下文中標(biāo)準(zhǔn)。
G481 (SEOIDNOs:多核苷酸55和多核苷酸56)
G481是CAAT家族轉(zhuǎn)錄因子序列，其顯示在組成型表達時賦予提高 的干旱耐性。然而，G481的組成型過表達可伴隨著不受歡迎的形態(tài)或物 理特征(例如晚開花)。相信調(diào)節(jié)G481表達的干旱誘導(dǎo)型啟動子可在植 物中提供干旱耐性，以及正常的形態(tài)和發(fā)育。
每種啟動子-G481組合的株系通常顯示為野生型，盡管一些株系顯示 開花時間的改變，可能表明G481的低水平背景表達。
通常，在缺水實驗中許多干旱誘導(dǎo)型啟動子-G481組合不比對照表現(xiàn) 更好或更差。然而，測試的五種構(gòu)建體(prAT5G15240、 prG1947 、 prAT5G66780、 prAT3G46230和prAT2G37870)的一些株系顯示在兩個植 物日期的至少一天中比對照更加耐受缺水，如下文所述。
prAT5G15240::G481過表達物的一個株系在實驗的兩輪之一中與對照 相比更好地從缺水處理中恢復(fù)。在RT-PCR實驗中未顯示G481轉(zhuǎn)基因的 明顯誘導(dǎo)。
prG1947::G481過表達物的一個株系在實驗的兩輪之一中更加耐受缺 水處理。在RT-PCR實驗中觀察到G481轉(zhuǎn)基因的干旱誘導(dǎo)。
prAT3G46230::G481過表達物的一個株系在實驗的兩輪之一中與對照 相比更好地從缺水處理中恢復(fù)。在RT-PCR實驗中觀察到G481轉(zhuǎn)基因的 非常溫和的干旱誘導(dǎo)。
prAT5G66780::G481過表達物的一個株系在兩輪之一中在統(tǒng)計學(xué)上更耐受缺水處理，并且該株系的一次單獨的種植與對照相比更好地從缺水處
理中恢復(fù)。在RT-PCR實驗中觀察到G481轉(zhuǎn)基因的干旱誘導(dǎo)。
在單獨的種植日期中，prAT2G37870::G481過表達物的兩個株系與對 照相比在干旱實驗中展示統(tǒng)計學(xué)上更好的表現(xiàn)。對第一個株系而言，來自 種植日期之一的植物比對照更加耐受缺水并且比對照更好地恢復(fù)。對第二 株系而言，兩個單獨實驗中的植物比對照更加耐受缺水和/或比對照更好地 從處理中恢復(fù)。通過RT-PCR未檢查到G481轉(zhuǎn)基因的干旱誘導(dǎo)。 G1073 (SEOIDNOs:多核苷酸57和多核苷酸58) G1073是AT-鉤(AT-hook)家族轉(zhuǎn)錄因子，并且顯示組成型過表達時賦 予提高的干旱耐性。然而，G1073的組成型過表達可伴隨著不受歡迎的形 態(tài)或物理特征，例如較大的尺寸(其在一些情況下可能是缺點)。相信調(diào) 節(jié)G1073表達的干旱誘導(dǎo)型啟動子可在植物中提供干旱耐性，以及正常的 形態(tài)和發(fā)育。
針對不同的啟動子-G1073組合在粘土罐干旱實驗中測試的T2株系通 常顯示為野生型。然而，在Tl世代中，對一些構(gòu)建體而言觀察到開花時 間和尺寸的中度改變，可能表明G1073的低水平背景表達。
通常，許多干旱誘導(dǎo)型啟動子-G1073組合在缺水實驗中不比對照表現(xiàn) 得更好或更差。然而，五種構(gòu)建體的大量個體株系顯示在兩個植物日期的 至少一天中比對照表現(xiàn)更好(prAT5G15240、 prAT5G66780、 prG1947、 prAT3G17520和prAT5G52300)。
prAT5G15240::G1073過表達物的一個株系在兩輪實驗之一中更好地從 缺水處理中恢復(fù)。在RT-PCR實驗中未觀察到G1073轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)。
prAT5G66780::G1073過表達物的一個株系在兩輪實驗之一中更好地從 缺水處理中恢復(fù)。通過RT-PCR證實了干旱處理對G1073轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)。
prG1947::G1073過表達物的一個株系在缺水耐性中比對照表現(xiàn)更好， 并且在兩輪實驗之一中比對照更好地從處理中恢復(fù)。通過RT-PCR證實了 干旱處理對G1073轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)。
prAT3G17520::G1073過表達物的一個株系在兩次獨立的實驗中比對照 更好地從缺水中恢復(fù)。證實了干旱處理對G1073轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)。prAT5G52300::G1073過表達物的一個株系在兩輪實驗之一中比對照更 好地從缺水中恢復(fù)。證實了干旱處理對G1073轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)。
G1274 (SEOIDNOs:多核苷酸59和多核苷酸60)
G1274是WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子的一個成員，并且顯示組成型表達時 賦予提高的干旱耐性。然而，G1274的組成型過表達可伴隨著不受歡迎的 形態(tài)或物理特征，例如對尺寸的影響(既觀察到小植物也觀察到大植物， 其在一些情況下均可能是不利的)。相信調(diào)節(jié)G1274表達的干旱誘導(dǎo)型啟 動子可在植物中提供干旱耐性，以及正常的形態(tài)和發(fā)育。
總之，除了開花時間的一些不一致的變化外，干旱誘導(dǎo)型啟動子-G1274株系未顯示與野生型形態(tài)的任何一致的差異。除了 prAT5G15240之 外，所有其它啟動子被證實為生產(chǎn)干旱誘導(dǎo)的G1274轉(zhuǎn)錄本，如通過RT-PCR所測量的。
通常，許多用處于干旱誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)控制下的G1274轉(zhuǎn)化的株系 在干旱實驗中不比對照表現(xiàn)更好或甚至更差。然而，測試的三種構(gòu)建體 (prAT5G66780、 prAT3G17520和prAT4G09600)的一些個體株系在兩個 植物日期之一中在缺水實驗中顯示比對照更好的表現(xiàn)，如下文所述。.
prAT5G66780::G1274過表達物的一個株系在兩輪實驗之一中比對照更 好地從缺水處理中恢復(fù)。通過RT-PCR證實了干旱處理對G1274轉(zhuǎn)基因的 誘導(dǎo)。
在兩輪缺水實驗之一中，過表達物的prAT3G17520::G1274株系之一 比對照更好地從缺水中恢復(fù)。通過RT-PCR證實了干旱處理對G1274轉(zhuǎn)基 因的誘導(dǎo)。
在兩輪實驗之一中，prAT4G09600::G1274過表達物的一個株系比對照 更好地從缺水處理中恢復(fù)。通過RT-PCR證實了干旱處理對G1274轉(zhuǎn)基因 的誘導(dǎo)。
G1792 (SEOIDNOs:多核苷酸61和多核苷酸62)
G1792是AP2家族轉(zhuǎn)錄因子的一個成員，并且顯示在組成型表達時賦 予提高的干旱耐性。然而，G1792的組成型過表達可伴隨著不受歡迎的形 態(tài)或物理特征，例如小的尺寸和降低的生育力。相信調(diào)節(jié)G1792表達的干
28旱誘導(dǎo)型啟動子可在植物中提供干旱耐性與更正常的形態(tài)和發(fā)育。
每種啟動子-G1792組合的株系通常顯示為野生型，盡管每種啟動子 的小部分Tl植物顯示深綠色和/或晚開花的表型，表明這些株系中G1792 的滲漏表達。
直接與G1792融合的五種不同干旱誘導(dǎo)型啟動子的株系經(jīng)過了兩輪土 壤干旱粘土罐實驗。這些干旱誘導(dǎo)型啟動子組合未產(chǎn)生使用G1792的顯著 結(jié)果，并且很多株系在該缺水實驗中與對照表現(xiàn)相同或比對照更差。然 而，五種構(gòu)建體之一的一個株系在兩個植物日期之一中顯示比對照更好的 表現(xiàn)，如下文所述。
在兩輪實驗之一中，prAT4G09600::G1792過表達物的一個株系比對照 更好地從缺水處理中恢復(fù)。在RT-PCR實驗中觀察到G1792轉(zhuǎn)基因的干旱 誘導(dǎo)。
G47 (SEO ID NOs:多核苷酸63和多核苷酸64)
G47是AP2家族轉(zhuǎn)錄因子的一個成員，并且顯示在組成型過表達時賦 予提高的干旱耐性。然而，G47的組成型過表達可伴隨著不受歡迎的形態(tài) 或物理特征，例如小尺寸和降低的生育力。相信調(diào)節(jié)G47表達的干旱誘導(dǎo) 型啟動子可在植物中提供干旱耐性，以及更正常的形態(tài)和發(fā)育。
兩種測試的啟動子-G47組合prAT5G66780和prG1947，在植物中導(dǎo) 致稍微推遲的發(fā)育，可能表明G47在這些株系中的滲漏表達。
直接與G47融合的五種不同干旱誘導(dǎo)型啟動子的株系經(jīng)過了兩輪土壤 干旱粘土罐實驗。五個構(gòu)建體中四個(包括prAT5G 15240、 prAT3G17520、 prAT4G09600和prG1947)的大量個體株系在至少兩個植 物日期之一中顯示比對照更好的表現(xiàn)，如下文所述。
在兩輪實驗之一中與對照植物相比，prAT5G15240::G47過表達物的一 個株系更好地從缺水處理中恢復(fù)，另一株系視覺上更加耐受缺水處理并且 更好地從缺水處理中恢復(fù)。
在兩輪實驗之一中，prAT3G17520::G47過表達物的一個株系比對照更 好地從缺水處理中恢復(fù)。通過RT-PCR證實了干旱處理對G47轉(zhuǎn)基因的誘 導(dǎo)。在兩輪實驗之一中，prAT4G09600::G47過表達物的一個株系比對照更 好地從缺水處理中恢復(fù)。與對照植物相比，第二株系視覺上更加耐受缺水 (在一輪實驗中觀察)，并且更好地從處理中恢復(fù)(在兩輪實驗中觀 察)。通過RT-PCR證實了干旱處理對G47轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)。
在兩輪實驗之一中，prG1947::G47過表達物的一個株系比對照更好地 從缺水處理中恢復(fù)。在兩輪實驗之一中與對照植物相比，第二株系視覺上 更耐受缺水并且更好地從處理中恢復(fù)。在前面這些株系中通過RT-PCR證 實了干旱處理對G47轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)，但是未在后面的株系中證實誘導(dǎo)。
實施例VIII調(diào)節(jié)編碼RNA種類的多核苷酸的表達，所述RNA種類在非
蛋白質(zhì)水平上起作用 除了缺水誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)編碼多肽的多核苷酸表達的用途以外，這 些啟動子還可被用于調(diào)節(jié)下述多核苷酸的表達，所述多核苷酸編碼非編碼 RNA種類(即在非蛋白質(zhì)水平上作用的RNA種類)例如微小RNA、微小 RNA前體，或用于調(diào)節(jié)被設(shè)計為通過RNA干擾(RNAi)發(fā)揮作用的序列的 表達。例如，脅迫應(yīng)答中涉及大量微小RNA(miRNA)種類，并且這些分子 顯示涉及植物生長和發(fā)育的許多方面的控制(Bartel and Bartel (2003) 尸/^Wo/. 132: 709—717; Aukerman and Sakai (2003).尸/朋f 0〃 15:， 2730-2741; Bartel (2004) Ce〃 116: 281—297; Juarez et al. (2004)油f匿428: 84-88; Bowman (2004)說oe^a^ 26: 938-942; Sunkar and Zhu (2004) P/朋f Ce// 16: 2001-2019)。
應(yīng)當(dāng)注意，對具體的高度相關(guān)的植物轉(zhuǎn)錄因子家族而言， 一個或多個 家族成員的過表達產(chǎn)生下述表型，所述表型可與通過降低一個或多個家族 成員的表達(例如，通過突變或擊倒(knockdown)途徑例如反義或RNA干 擾)所獲得的表型相比較。例如，CBF家族蛋白質(zhì)的過表達已被廣泛地證 明賦予對干旱和低溫脅迫的耐性(例如Jaglo et al. (2001)尸/a" 尸/yw'o/. 127: 910-917)。然而，Novilloetal. (2004)iVoc.iVa".v4c^. [/&4 101:， 3985-3990顯示CBF2基因中帶有破裂的純合突變體擬南芥植物也顯示增強 的冷凍耐性。這類結(jié)果可通過編碼不同轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因之間的較差調(diào)節(jié)來解釋。在Novillo et al, (2004)上文的研究中，CBF2顯示為CBF7 和CSK5基因的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子?？杀容^的機制可能說明了下述事實我 們使用某些NF-Y家族基因觀察到來自過表達和擊倒兩種途徑的脅迫耐 性。
我們己使用35S啟動子顯示，miRNA169前體(SEQ ID NOs: 71、 72、 73或74)的過表達會產(chǎn)生對脫水和滲透壓的耐性，但是這通常伴隨 著發(fā)育改變，例如開花時間的變更或減小的尺寸，所述miRNA169耙向 NF-YA (HAP2類轉(zhuǎn)錄因子基因；Bartel and Bartel， Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mo/. Ce// 14: 787-799)。因此，期望使用干旱誘導(dǎo)型啟動 子表達miRNA169產(chǎn)生缺水耐性而不對發(fā)育具有不想要的影響。我們從多 核苷酸(P21305, SEQ ID NO: 66)的過表達中獲得相同的結(jié)果，所述多核苷 酸被設(shè)計為實現(xiàn)對非-LECl-樣NF-YB蛋白質(zhì)的RNA干擾；RNAi構(gòu)建體 P21305 (帶有KanR)耙向G481進化枝(該進化枝由密切和進化上與 G481相關(guān)的序列組成，所述G481為編碼多肽SEQ ID NO: 56的SEQ ID NO: 55)。其含有兩個片段，每個片段包含來自G2345的G481進化枝序 列SEQ ID NO: 67 (從起始密碼子起的堿基對185-315;該片段由SEQ ID NO:69表示)和G485 SEQ ID NO: 68 (從起始密碼子起堿基對61-170，該 片段由SEQ ID NO: 70表示)。突變了大量堿基，從而提高與其它進化枝 成員的百分比同源性。在下文所列兩條序列片段中顯示為大寫字母的堿基 指出為了提高與其它進化枝成員的百分比同源性而在克隆引物中引入的點 突變的位置。
G2345片段(堿基185-315) ， SEQ ID NO: 69
aggaatgTgtctctgaAttcatcagcttcgtcaccagcgaggctagtgataagtgccaaagagagaaAa ggaagaccatcaatggagatgatttgctttgggctatggccactttaggattCgaAgattac
G485片段(堿基61-170) ， SEQ ID NO: 70
gagcaagataggtttctAccgatcgctaacgttagcaggatcatgaagaaagcacttcctgcgaacgcaa aaatctctaaGgatgcTaaagaAacggttcaagagtgtgt預(yù)期片段如下形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)35S::sense—fragment(G2345-G485)::pdkintron::antisense—fragment(G2345-G485)。過表達P21305的轉(zhuǎn)基
因擬南芥株系顯示提高的對缺水和熱脅迫的耐性，但是顯示發(fā)育異常和開 花時間的改變。因此預(yù)期使用干旱誘導(dǎo)型啟動子表達這類多核苷酸產(chǎn)生脅 迫耐性，而不對發(fā)育和/或形態(tài)造成不想要的影響。
實施例IX轉(zhuǎn)化雙子葉植物以產(chǎn)生提高的缺水脅迫耐性 當(dāng)置于本發(fā)明的缺水誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)節(jié)控制下時，過表達下述轉(zhuǎn)錄 因子多肽的作物物種(包括番茄和大豆植物)可產(chǎn)生具有提高的缺水耐性 的植物，所述轉(zhuǎn)錄因子多肽賦予對缺水的提高的耐性，所述缺水例如脫 水、干燥、干旱或其它高滲脅迫例如高鹽或高糖濃度。這些觀察結(jié)果表 明，在脅迫條件下這些基因在過表達時會導(dǎo)致與未轉(zhuǎn)化的植物相比改進的 品質(zhì)和更大的產(chǎn)量，這可在生長期中任何時間在田間以甚至低的、難以覺 察的程度發(fā)生。
因此，為了調(diào)節(jié)水應(yīng)答序列和針對改進產(chǎn)量和/或品質(zhì)的目的修飾植物 性狀的目的，可將被重組進例如本發(fā)明的表達載體之一或另一合適的表達 載體中的序列表中所列的啟動子序列轉(zhuǎn)化進植物中。可通過本領(lǐng)域公知的 手段例如直接DNA轉(zhuǎn)移或根瘤土壤桿菌(Jgra6a"en'Mm ^me/ac&ra)介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化，將克隆載體引入多種植物中。
目前使用大部分雙子葉植物生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物是常規(guī)的(見Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press; Gelvin et al. (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers; Herrera-Estrella et al. (1983) TV^we 303: 209; Bevan (1984) TVwc/ezc 爿d^s 12: 8711-8721; and Klee (1985) ^o/rec/mo/ogy 3: 637-642)。分 析性狀的方法是本領(lǐng)域常規(guī)的，例子在上文中公開。
用于轉(zhuǎn)化番茄和大豆植物的多種方案先前已經(jīng)描述，并且是本領(lǐng)域公 矢口的。Gruber et al. (1993) in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, p. 89-119禾口 Glick and Thompson ((1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press" Boca Raton， FL)描述了可被用于細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和隨后再生的若干種表達載體和培養(yǎng)方法。用于大
豆轉(zhuǎn)化的方法由Miki et al. (1993)描述于Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, p. 67-88, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton中；和美國專利No. 5，563，055， (Townsend and Thomas), issued Oct. 8， 1996中。
存在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案的大量備選方案，目的是將外源基因轉(zhuǎn)移 進大豆或番茄中的其它方法。 一個這種方法是微粒(microprojectile)介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化，其中用生物射彈設(shè)備將微粒顆粒表面上的DNA驅(qū)動至植物組織內(nèi) (見例如Sanford et al. (1987)rec/mo/. 5:27-37; Christou et al. (1992) 尸/a"A丄2: 275-281; Sanford (1993) M^AoA f"2;ymo/. 217: 483-509; Klein et al. (1987) A/^wm 327: 70-73; 1991年5月14日提交的美國專利No. 5,015,580 (Christou et al);和1994年1月21日提交的美國專利No. 5,322,783 (Tomes et al.))。
或者使用一下方法將外來DNA和表達載體引入植物中聲裂法(見 例如Zhang etal. (1991)說o/Tec/mo/ogy 9: 996-997);使用CaC12沉淀、聚 乙烯醇或聚-L-鳥氨酸將DNA直接攝入原生質(zhì)體(Hain et al. (1985) Mo/. G饑 G認(rèn)f. 199: 161-168; Draper et al. (1982)尸te Ce〃 23: 451-458);月旨
質(zhì)體或質(zhì)體融合(見例如Deshayes et al. (1985) ￡MSO丄4: 2731-2737; Christou et al. (1987)尸度.扁.5W.園84: 3962-3966);和原生質(zhì) 體和整個細(xì)胞和組織的電穿孔(見例如Donn et al.(1990) in Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38: 53; D'Halluin et al. (1992)尸/"w Ce〃 4: 1495-1505;和Spencer et al. (1994) 尸taMo/.編.24: 51-61)。
在植物或植物細(xì)胞被轉(zhuǎn)化(并且后者被再生為植物)后，可將被轉(zhuǎn)化
的植物與以下雜交其自身或來自相同株系的植物、未轉(zhuǎn)化的植物或野生 型植物、或來自不同轉(zhuǎn)基因株系植物的另一經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物。雜交提供了產(chǎn) 生新的并且通常是穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因變種的益處?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的傳統(tǒng)的 回交技術(shù)，將被引入番茄或大豆株系中的基因及其賦予的性狀轉(zhuǎn)移至植物
的不同株系中?？墒褂肒oornneef et al (1986)在Tomato Biotechnology: AlanR. Liss, Inc., 169-178中和美國專利6,613,962中的方案進行番茄植物的轉(zhuǎn) 化，后一方法在本文中簡述。在含有Petunia雜種懸浮細(xì)胞詞養(yǎng)層的培養(yǎng) 皿中將八天齡的子葉外植體預(yù)培養(yǎng)24小時，所述雜種懸浮細(xì)胞涂布在含 2% (w/v)蔗糖和0.8%瓊脂的MS培養(yǎng)基上，所述MS培養(yǎng)基補充有10 pM a-萘乙酸和4.4 ^M6-芐氨基嘌呤。然后用經(jīng)稀釋的下述根瘤土壤桿菌的過 夜培養(yǎng)物將外植體感染5-10分鐘，在無菌濾紙上吸干并在原始的詞養(yǎng)層平 板上共同培養(yǎng)48小時，所述根瘤土壤桿菌含有包含本發(fā)明多核苷酸的表 達載體。培養(yǎng)條件如上所述。用pH5.7的含2。/。(w/v/)蔗糖的液體MS培養(yǎng) 基將根瘤土壤桿菌的過夜培養(yǎng)物稀釋至0.8的OD600。
共同培養(yǎng)后，將子葉外植體轉(zhuǎn)移至帶有含MS培養(yǎng)基的選擇性培養(yǎng)基 的培養(yǎng)皿中，并在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，所述選擇性培養(yǎng)基具有4.56 pM 玉米素、67.3 萬古霉素、418.9 頭孢噻肟和171.6 硫酸卡那霉 素。每三周將外植體傳代培養(yǎng)到新鮮的培養(yǎng)基上。將形成的枝條從下面的 愈傷組織上切下，并轉(zhuǎn)移至含有無玉米素的選擇性培養(yǎng)基的玻璃瓶中，以 形成根。含硫酸卡那霉素的培養(yǎng)基中根的形成是成功轉(zhuǎn)化的陽性指征。
可使用例如本文簡述的美國專利5,563,055 (Townsend et al., issued October 8， 1996)中存在的方法進行大豆植物的轉(zhuǎn)化。在該方法中，通過暴 露于玻璃鐘罩中散發(fā)的氯氣，對大豆種子進行表面消毒。通過平鋪在不含 植物生長調(diào)節(jié)劑的用1/10濃度瓊脂固化的培養(yǎng)基上并在28'C以16小時的 日長培養(yǎng)，使種子萌發(fā)。三或四天后，可制備種子用于共同培養(yǎng)。去除種 皮并在子葉下3-4 mm處去除延長的胚根。
將帶有含本發(fā)明多核苷酸的表達載體的根瘤土壤桿菌的過夜培養(yǎng)物培
養(yǎng)至對數(shù)期，合并并通過離心濃縮。分批進行接種，從而用新重懸的土壤 桿菌沉淀物處理每個平板的種子。將沉淀物重懸于20ml接種培養(yǎng)基中。 將接種物倒入含有制備好的種子的培養(yǎng)皿中，并用手術(shù)刀片浸漬子葉節(jié)。 30分鐘后將外植體轉(zhuǎn)移至經(jīng)固化的相同培養(yǎng)基的平板上。將外植體近軸端 向上包埋，與培養(yǎng)基表面對齊，并在白色熒光下于22。C下培養(yǎng)三天。然后 根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法再生這些植物，例如在三天后通過將外植體移動至 液體反選擇培養(yǎng)基中來實現(xiàn)(見美國專利5,563,055)。然后可將外植體挑取、包埋并在經(jīng)固化的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在選擇 培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月后，經(jīng)轉(zhuǎn)化的組織呈現(xiàn)為漂白的、較不健康的組織背 景上再生組織的綠色扇區(qū)。將具有綠色扇區(qū)的外植體轉(zhuǎn)移至延長培養(yǎng)基 上。在該培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，每兩周轉(zhuǎn)移至新鮮的平板上。當(dāng)枝條長度為
0.5 cm時，可將它們在底部切下并置于生根培養(yǎng)基中。
實施例X轉(zhuǎn)化單子葉植物以產(chǎn)生提高的缺水脅迫耐性 谷物植物和其它草類(例如但不限于玉米、小麥、水稻、高粱、大 麥、Miscanthns和柳枝稷)可用本發(fā)明的啟動子序列轉(zhuǎn)化，并誘導(dǎo)型地表 達例如賦予提高的缺水耐性的轉(zhuǎn)錄因子，所述啟動子序列例如序列表中所 列的、被克隆進載體例如pGA643中的、和含有卡那霉素抗性標(biāo)記物的啟 動子序列。表達載體可以是序列表中存在的表達載體，或者可類似地使用 整合本發(fā)明啟動子序列的任何其它合適的表達載體。例如可修飾 pMEN020，用賦予膦絲菌素抗性的吸水鏈霉菌OSV^ptow;;cM /^groscc^cw力 的BAR基因代替NptII編碼區(qū)。通過使用沉默密碼子改變的定點郵編，去 除Bar基因的Kpnl和BglII位點。
可通過本領(lǐng)域公知的手段，包括直接DNA轉(zhuǎn)移或根瘤土壤桿菌介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)化，將克隆載體引入多種谷物植物中。后一途徑可以通過多種手段完 成，包括例如美國專利No. 5,591,616的手段，其中通過將去分化的組織與 含有克隆載體的土壤桿菌接觸，轉(zhuǎn)化單子葉植物愈傷組織。
將樣品組織在含有克隆載體的土壤桿菌3x10-9細(xì)胞懸浮液中浸漬3-10 分鐘。在固體培養(yǎng)基上于25'C下黑暗中，將愈傷組織材料培養(yǎng)若干天。將 在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中。每2-3周繼續(xù)轉(zhuǎn)移(2 或3次)直至產(chǎn)生枝條。然后每2-3周將枝條轉(zhuǎn)移至枝條延長培養(yǎng)基中。 將外觀健康的枝條轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，并在發(fā)育出根后將植物置于潮濕 的盆栽土壤中。
然后使用來自5Prime-3Prime Inc. (Boulder, CO)的ELISA NPTII試劑 盒，通過ELISA針對NPTII基因/卡那霉素抗性的存在分析經(jīng)轉(zhuǎn)化的植 物。
35還常規(guī)使用其它方法生產(chǎn)大部分谷物作物(Vasil (1994)戶/a"ZMo/. Ao/. 25: 925-937)例如玉米、小麥、水稻、高粱(Cassas et al. (1993) iVoc. A^/. jca《^X4 90: 11212-11216)和大麥(Wan and Lemeaux (1994)尸/a^ 尸/^w'o/. 104: 37-48)的轉(zhuǎn)基因植物。DNA轉(zhuǎn)移方法例如微粒方法可被用于 玉米(Fromm et al. (1990) Ao/rec/mo/. 8: 833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) 尸te Ce// 2: 603-618; Ishida (1990))腺,所ofec/mo/. 14:745-750)、小麥 (Vasil et al. (1992)所o/Tec/mo/. 10:667-674; Vasil et al. (1993) ^o/Tec/mo/. 11:1553-1558; Weeks et al. (1993) Pte 102:1077-1084和水稻
(Christou (1991)說o/Tec/mo/. 9:957畫962; Hiei et al. (1994)尸/a"/丄6:271-282; Aldemita and Hodges (1996)尸/朋to 199: 612-617; and Hiei et al. (1997) ^fo/.歷o/. 35:205-218)。對大部分谷物植物而言，衍生自不成熟盾片組織的 胚胎發(fā)生細(xì)胞是用于轉(zhuǎn)化的優(yōu)選的細(xì)胞靶標(biāo)(Hiei et al. (1997)上文；Vasil (1994)上文)。為了使用微粒轟擊轉(zhuǎn)化衍生自不成熟盾片組織的玉米胚胎 發(fā)生細(xì)胞，A188XB73基因型是優(yōu)選的基因型(Fromm et al. (1990)上文； Gordon-Kamm etal.(1990)上文)。微粒轟擊后，在膦絲菌素上選擇組織， 以鑒定轉(zhuǎn)基因的胚胎發(fā)生細(xì)胞(Gordon-Kamm etal.(1990)上文)。通過標(biāo) 準(zhǔn)的玉米再生技術(shù)(Fromm et al. (1990)上文；Gordon-Kamm et al. (1990)上 文)再生轉(zhuǎn)基因植物。Somleva et al. (2002) Crap 5W. 42: 2080-2087也報道 了柳枝稷的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
實施例XI轉(zhuǎn)錄因子表達和缺水脅迫耐性的分析 再生的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的Northern印跡分析、RT-PCR或微陣列分析可被 用于顯示能夠誘導(dǎo)與對照植物相比提高的缺水脅迫耐性的本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因 子多肽和相關(guān)基因的表達。
為了驗證賦予提高的缺水耐性的能力，可通過脅迫例如脫水、干旱、 干燥或相關(guān)的高滲脅迫耐性例如鹽或甘露醇來攻擊成熟的植物或這些植物 的幼苗后代，所述成熟的植物在本發(fā)明的缺水誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)節(jié)控制下 過表達轉(zhuǎn)錄因子。或者，可在高滲脅迫條件下攻擊這些植物，所述高滲脅 迫條件也可以測量改變的糖感受(sensing)，例如高糖(例如蔗糖)條件。通過比較對照植物(例如野生型或親本株系未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，或用空載體 轉(zhuǎn)化的植物或缺乏轉(zhuǎn)錄因子的植物)和經(jīng)類似處理的轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因 植物可顯示對具體缺水脅迫具有更強的耐性。
在雙子葉植物之后轉(zhuǎn)化了單子葉植物或植物細(xì)胞(并將后者再生為植 物)，它們顯示在脅迫條件下相對于對照植物而言具有更大的尺寸或更強 的對缺水相關(guān)脅迫的耐性，或產(chǎn)生更大的產(chǎn)量或更好的品質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)化的單 子葉植物可與以下雜交其自身或來自相同株系的植物、未經(jīng)轉(zhuǎn)化的或野 生型單子葉植物、或來自不同轉(zhuǎn)基因株系植物的另一經(jīng)轉(zhuǎn)化的單子葉植 物。
這些實驗會證明本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子多肽可被鑒定，并顯示在雙子葉植 物或單子葉植物中賦予更強的對缺水相關(guān)脅迫的耐性、更大的產(chǎn)量、或更 好的品質(zhì)，包括對多于一種缺水相關(guān)脅迫的耐性。
實施例XII對非擬南芥物種賦予顯著改進的序列 已經(jīng)分析了本發(fā)明啟動子序列的功能并可對其進一步表征，并且可將 所述序列整合進作物植物中?？墒褂帽景l(fā)明的調(diào)節(jié)元件，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子序 列或下述任何其它序列的異位過表達，所述任何其它序列可賦予提高的對 缺水相關(guān)脅迫(例如對干旱、干燥、脫水和/或其它高滲脅迫)的耐性。除 了這些序列以外，期望來自例如具有相似序列的其它物種的新發(fā)現(xiàn)的多核 苷酸序列可與序列表中存在的多核苷酸序列密切相關(guān)，并且被轉(zhuǎn)化進不同 物種植物(包括雙子葉植物和單子葉植物)大量變種的任何中時，也能夠 以與序列表中存在的序列相似的方式賦予改進的缺水耐性。衍生自單子葉 植物的多核苷酸和多肽序列(例如水稻序列)可被用于轉(zhuǎn)化單子葉植物和 雙子葉植物，衍生自雙子葉植物的多核苷酸和多肽(例如擬南芥和大豆基 因)可被用于轉(zhuǎn)化任一種，盡管在基因被轉(zhuǎn)化進與序列來源相同種類的植 物中時這些序列中的一些會更好地發(fā)揮作用。
上文實施例中所列結(jié)果表明，賦予改進的缺水耐性的蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄 因子在本發(fā)明啟動子序列的調(diào)節(jié)控制下被過表達時可實現(xiàn)該作用，而不對 植物形態(tài)和/或發(fā)育具有顯著的不利影響?？蛇x擇展示有用性狀的這些株系用于進一步研究或商業(yè)開發(fā)。
可用含有轉(zhuǎn)錄因子多核苷酸的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單子葉植物(包括水稻、玉 米、小麥、黑麥、高粱、大麥及其它)。轉(zhuǎn)錄因子基因序列可包括衍生自 單子葉植物或雙子葉植物的序列，例如本文中所列的那些。這些轉(zhuǎn)錄因子 基因可被克隆進含有卡那霉素抗性標(biāo)記物的表達載體中，然后在本發(fā)明啟 動子序列的調(diào)節(jié)控制下以誘導(dǎo)型方式被表達。
可通過例如先前的實施例中所述的手段，包括直接DNA轉(zhuǎn)移或根瘤 土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將克隆載體引入單子葉植物中。后一途徑可通過多 種手段完成，包括例如美國專利No. 5,591,616中的手段，其中通過將去分 化的組織與含有克隆載體的土壤桿菌接觸來轉(zhuǎn)化單子葉植物愈傷組織。
將樣品組織在含有克隆載體的土壤桿菌3x10-9細(xì)胞懸浮液中浸漬3-10 分鐘。在固體培養(yǎng)基上25。C下黑暗中，將愈傷組織材料培養(yǎng)數(shù)天。將在該 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中。每2-3周繼續(xù)轉(zhuǎn)移(2或3 次)直至產(chǎn)生枝條。然后每2-3周將枝條轉(zhuǎn)移至枝條延長培養(yǎng)基上。將外 觀健康的枝條轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，并在發(fā)育出根后將植物置于潮濕的盆 栽土壤中。
然后使用來自5Prime-3Prime Inc. (Boulder， CO)的ELISA NPTII試劑 盒，通過ELISA針對NPTII基因/卡那霉素抗性的存在分析經(jīng)轉(zhuǎn)化的植 物。
再生的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的Northern印跡分析、RT-PCR或微陣列分析可被 用于顯示經(jīng)轉(zhuǎn)錄的植物中本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子多肽的表達，所述轉(zhuǎn)錄因子多 肽能夠賦予提高的缺水相關(guān)脅迫的耐性或提高的產(chǎn)量或品質(zhì)。
為了驗證賦予提高的缺水相關(guān)脅迫耐性的能力，可使用本文所述方法 攻擊表達單子葉植物衍生的等同物(equivalog)基因的成熟植物或這些植物 的幼苗后代。通過比較對照植物或轉(zhuǎn)基因植物，后者顯示與經(jīng)相似處理的 對照植物相比更加耐受一種或多種缺水相關(guān)的脅迫例如干旱、脫水、干燥 或其它高滲脅迫。作為測定缺水相關(guān)耐性的第一步的例子，可對轉(zhuǎn)基因植 物的種子進行萌發(fā)實現(xiàn)以測量蔗糖感受。例如，將包括但不限于大豆和苜 蓿的無菌雙子葉植物播種在含有維生素與9.4%蔗糖的80。/。MS培養(yǎng)基上；對照培養(yǎng)基缺乏蔗糖。然后將所有實驗平板于22'C下24小時光照(120-130 )iEin/m2/s)下在培養(yǎng)箱中孵育。然后在種植3天后進行萌發(fā)和幼苗活力的 評價。可發(fā)現(xiàn)在存在糖濃度時，過表達下述蛋白質(zhì)的植物通過具有比對照 植物更好的萌發(fā)、更長的胚根、和更多的子葉伸展而顯示對高蔗糖更加耐 受，所述蛋白質(zhì)賦予提高的缺水耐性，其中所述蛋白質(zhì)位于本發(fā)明的啟動 子的調(diào)節(jié)控制下。預(yù)期密切相關(guān)和結(jié)構(gòu)相似的啟動子序列也可賦予改變的 糖感受或提高的高滲脅迫耐性。
也可對過表達下述蛋白質(zhì)的植物進行基于土壤的干旱實驗，從而鑒定 比對照植物更加耐受脫水的株系，所述蛋白質(zhì)賦予提高的對缺水的耐性， 其中所述蛋白質(zhì)處于本發(fā)明的啟動子序列的調(diào)節(jié)控制下。例如，可進行溫 室內(nèi)的干旱實驗。將預(yù)先萌發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物(遺傳了外源轉(zhuǎn)錄因子DNA 構(gòu)建體的雜合轉(zhuǎn)基因植物的后代)和野生型植物(遺傳了外源轉(zhuǎn)錄因子 DNA構(gòu)建體的雜合轉(zhuǎn)基因植物的后代)的幼苗種植在土壤中。在一周內(nèi)對 植物充分澆水，然后允許其干燥4天。根據(jù)匹配的高度選擇等量的轉(zhuǎn)基因 和野生型植物。然后通過測量植物高度并對"濕"罐重新開始每天澆水開 始干旱實驗。通過將平均"干"罐重量(例如約400 g)維持充分低于 "濕"罐重量(例如約500 g或更多)產(chǎn)生"干"罐；必須時向"干"罐 中添加水，從而將"干"罐維持在"干"罐重量的均值附近。將轉(zhuǎn)基因植 物和對照的高度測量9天，之后對"干"的扁平罐重新開始完全澆水3 天，之后再次測量高度。如上所述對恢復(fù)的植物施以第二輪干旱。用本發(fā) 明序列轉(zhuǎn)化的大量植物株系會比對照植物顯著地更大和更綠、更少萎蔫或 干燥，尤其是在一段缺水周期后再澆水并隨后孵育一段時間的情況下。與 組成型過表達下述蛋白質(zhì)的植物不同，在本文所述缺水誘導(dǎo)型啟動子的調(diào) 節(jié)控制下過表達這些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物在形態(tài)和發(fā)育上會與對照植物類 似，所述蛋白質(zhì)賦予提高的對缺水的耐性，所述對照植物例如為野生型或 用"空"載體轉(zhuǎn)化的植物。
預(yù)期相同的方法可適用于鑒定其它有用和有價值的啟動子序列，并且 所述序列可衍生自不同范圍的物種。
權(quán)利要求
1.包含下述缺水誘導(dǎo)型啟動子的表達載體，所述缺水誘導(dǎo)型啟動子包含SEQ ID NOs1到9中的任何或其功能性部分，其中所述功能性部分具有啟動子功能。
2. 權(quán)利要求
1的表達載體，其中所述表達載體包含SEQ ID NOs: 10到 54中的任何。
3. 權(quán)利要求
1的表達載體，其中所述表達載體包含相對于編碼下述多 肽的編碼序列而言位于5'并與所述編碼序列可操作連接的RNA聚合酶結(jié) 合位點，所述多肽賦予提高的對缺水條件的耐性。
4. 權(quán)利要求
1的表達載體，其中所述缺水誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)編碼下述 多肽的多核苷酸的表達，所述多肽賦予提高的對缺水條件的耐性。
5. 權(quán)利要求
4的表達載體，其中所述多肽是轉(zhuǎn)錄因子。
6. 權(quán)利要求
5的表達載體，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由SEQ ID NOs: 56、 58、 60、 62和64組成的組。
7. 包含下述缺水誘導(dǎo)型啟動子的宿主植物細(xì)胞，所述缺水誘導(dǎo)型啟動 子包含SEQ ID NOs: 1到9中的任何或其功能性部分，其中所述功能性部 分具有啟動子功能。
8. 權(quán)利要求
7的宿主植物細(xì)胞，其中所述表達載體包含SEQ ID NOs: 10到54中的任何。
9. 權(quán)利要求
7的宿主植物細(xì)胞，其中所述表達載體包含相對于編碼下 述多肽的編碼序列而言位于5'并與所述編碼序列可操作連接的RNA聚合 酶結(jié)合位點，所述多肽賦予提高的對缺水條件的耐性。
10. 權(quán)利要求
7的宿主植物細(xì)胞，其中所述缺水誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)編 碼下述多肽的多核苷酸的表達，所述多肽賦予提高的對缺水條件的耐性。
11. 權(quán)利要求
10的宿主植物細(xì)胞，其中所述多肽是轉(zhuǎn)錄因子。
12. 權(quán)利要求
11的宿主植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由SEQ ID NOs: 56、 58、 60、 62和64組成的組。
13. 包含含有下述缺水誘導(dǎo)型啟動子的表達載體的轉(zhuǎn)基因植物，所述缺水誘導(dǎo)型啟動子包含SEQ ID NOs: 1到9中的任何或其功能性部分，其 中所述功能性部分具有啟動子功能。
14. 權(quán)利要求
13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述表達載體包含下述重組多核 苷酸，所述重組多核苷酸包含相對于編碼下述多肽的編碼序列而言位于5' 并與所述編碼序列可操作連接的RNA聚合酶結(jié)合位點，所述多肽賦予提 高的對缺水條件的耐性。
15. 權(quán)利要求
13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述表達載體包含調(diào)節(jié)編碼下述 多肽的多核苷酸表達的缺水誘導(dǎo)型啟動子，所述多肽賦予提高的對缺水條 件的耐性。
16. 權(quán)利要求
15的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述多肽是轉(zhuǎn)錄因子。
17. 權(quán)利要求
16的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由SEQ ID NOs: 56、 58、 60、 62和64組成的組。
18. 權(quán)利要求
13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述表達載體包含SEQ ID NOs: 8到26中的任何。
19. 權(quán)利要求
13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物具有比對照植物 更高的對缺水條件的耐性。
20. 由權(quán)利要求
13的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。
21. 用于生產(chǎn)具有比對照植物更高的缺水條件耐性的轉(zhuǎn)基因植物的方 法，所述方法步驟包括-(a) 產(chǎn)生包含以下的表達載體-(i) 包含SEQ ID NOs: 1-9中的任何或其功能性部分的啟動子序列，其 中所述功能性部分具有啟動子功能；和(ii) 編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽提高轉(zhuǎn)基因植物的缺水耐性；其中所述啟動子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列可操作連接，并且 在缺水條件期間，所述啟動子序列驅(qū)動編碼所述多肽的核苷酸序列的表 達；和(b) 用所述表達載體轉(zhuǎn)化靶植物，產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物； 其中在所述轉(zhuǎn)基因植物中過表達所述多肽時，所述轉(zhuǎn)基因植物具有比對照植物更高的對缺水條件的耐性。
22. 權(quán)利要求
21的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含SEQ ID NOs: 10-54中的任何。
23. 權(quán)利要求
21的方法，其中所述啟動子序列包含相對于編碼下述多 肽的編碼序列而言位于5'并與所述編碼序列可操作連接的RNA聚合酶結(jié) 合位點，所述多肽調(diào)節(jié)植物對缺水的耐性。
24. 權(quán)利要求
21的方法，其中所述多肽是轉(zhuǎn)錄因子。
25. 權(quán)利要求
24的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由SEQIDNOs: 56、 58、 60、 62和64組成的組。
26. 權(quán)利要求
21的方法，其中所述方法步驟還包括(c)將所述轉(zhuǎn)基因植物與其自身、與所述轉(zhuǎn)基因植物來自相同株系的 植物、非轉(zhuǎn)基因植物、野生型植物或來自不同轉(zhuǎn)基因株系植物的另一轉(zhuǎn)基 因植物雜交，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。
27. 相對于對照植物對缺水條件的耐性而言提高植物對缺水條件耐性 的方法，所述方法步驟包括(a) 產(chǎn)生包含以下的表達載體(i) 包含SEQ ID NOs: 1-9中的任何或其功能性部分的啟動子序列，其 中所述功能性部分具有啟動子功能；和(ii) 編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽提高轉(zhuǎn)基因植物的缺水耐性；其中所述啟動子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列可操作連接，并且 在缺水條件下，所述啟動子序列驅(qū)動編碼所述多肽的核苷酸序列的表達； 和(b) 用所述表達載體轉(zhuǎn)化靶植物，產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物； 其中在所述轉(zhuǎn)基因植物中過表達所述多肽時，所述轉(zhuǎn)基因植物具有比對照植物更高的對缺水條件的耐性。
28. 包含下述缺水誘導(dǎo)型啟動子的表達載體，所述缺水誘導(dǎo)型啟動子 包含SEQ ID NOs: 1到9中的任何或其功能性部分，其中所述功能性部分 具有啟動子功能；其中所述缺水誘導(dǎo)型啟動子控制在植物中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA種 類的表達；其中所述非編碼RNA種類對轉(zhuǎn)錄的所述調(diào)節(jié)導(dǎo)致所述植物比對照植 物更加耐受缺水；且所述植物與對照植物在形態(tài)上相似和/或在發(fā)育上相似。
29. 權(quán)利要求
28的表達載體，其中所述非編碼的RNA種類是干擾 RNA (RNAi)或微小RNA (miRNA)。
30. 包含權(quán)利要求
28的表達載體的轉(zhuǎn)基因植物。
專利摘要
本發(fā)明鑒定了可用于生產(chǎn)下述轉(zhuǎn)基因植物的缺水誘導(dǎo)型啟動子序列，所述轉(zhuǎn)基因植物比對照植物更加耐受缺水和相關(guān)的高滲脅迫，但是外觀仍然是野生型或接近野生型。任何這些缺水誘導(dǎo)型啟動子可被整合進包含下述多核苷酸的表達載體中，所述多核苷酸由一個這類啟動子調(diào)節(jié)并且編碼下述多肽，所述多肽在其形態(tài)和發(fā)育與對照植物相似的植物中異位表達時提高缺水耐性。
文檔編號A01H1/00GKCN101652059SQ200880011485
公開日2010年2月17日 申請日期2008年2月7日
發(fā)明者奧利弗·J·拉特科力菲, 彼得·P·里皮第, 漢斯·E·豪爾坦, 羅德里克·W·庫米摩托 申請人:孟德爾生物技術(shù)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan