一種干旱誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種干旱誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及DNA重組技術(shù)中一種調(diào)節(jié)基因表達的非編碼核酸。本發(fā)明提供的啟動子，該啟動子的核苷酸序列為SEQIDNO:1。本發(fā)明所述的啟動子能夠為植物生物反應(yīng)器的研發(fā)提供實驗和技術(shù)支撐。利用所述的干旱誘導(dǎo)型啟動子，以植物作為生物反應(yīng)器，表達疫苗、抗體及其他藥用蛋白等，可突破傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)范疇，延伸到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【專利說明】一種干旱誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及DNA重組技術(shù)中一種調(diào)節(jié)基因表達的非編碼 核酸。

【背景技術(shù)】
[0002] 在植物基因工程研究中，使外源目的基因在受體中表達，以提高作物對干旱、低 溫、鹽堿以及病蟲害等逆境脅迫的抗性，或提高作物品質(zhì)及改良作物農(nóng)藝性狀等，已成為目 前作物育種的一種重要手段。真核生物的基因表達調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后 調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控。其中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控受順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)作 用，是表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，有關(guān)啟動子的分離和研究成為國內(nèi)外研究的熱點之一。
[0003] 使用組成型啟動子驅(qū)使外源基因表達，不僅造成資源浪費，還直接影響植株的生 長發(fā)育及正常的生理代謝，而使用誘導(dǎo)型啟動子，不僅不會造成各種資源的浪費，又能增強 植物體對外界的抗性，減少對植物生長發(fā)育及其他代謝途徑的影響。因此，如何控制外源基 因定時定量地高效表達，是基因工程技術(shù)在作物遺傳改良方面有效應(yīng)用的關(guān)鍵所在。除了 尋找有效的目的基因之外，發(fā)現(xiàn)有效控制外源基因表達的啟動子成為基因工程改良中需要 解決的重要問題。啟動子根據(jù)其功能和作用方式大致分為組成型啟動子、組織特異性啟動 子和誘導(dǎo)型啟動子三種。組成型啟動子調(diào)控的基因表達不受外界環(huán)境條件的影響，幾乎在 所有植物不同組織中都能表達。典型的是花椰菜花葉病毒（cauli-flower mosaic virus, CaMV) 35S啟動子，被廣泛應(yīng)用于雙子葉植物轉(zhuǎn)基因工程（Benfey等，1990, Science 250， 959-966)。其它單子葉有玉米泛素 Ubiquitin 啟動子（Streatfield 等，2004, Transgenic Res 13,299-312)和水稻肌動蛋白（Actin)啟動子。該類啟動子活性較高，但由于其導(dǎo) 致外源基因在轉(zhuǎn)基因植物整個生長時期的不同部位表達，影響植物的生長發(fā)育和正常生 理代謝，有些產(chǎn)物可能造成毒害作用，不利于品質(zhì)和產(chǎn)量的提高，甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡。 Kasuga等利用誘導(dǎo)型rd29A啟動子代替CaMV35S啟動子轉(zhuǎn)化擬南芥，提高了轉(zhuǎn)基因擬 南芥的抗旱性，同時減少了組成型過表達造成的植株生長停滯或矮化現(xiàn)象的發(fā)生（Kasuga， 2004, Plant and Cell Physiology 45，346-350)。因此，為了更好地調(diào)控植物基因的表 達，組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子的研究和應(yīng)用越來越受到人們重視。
[0004] 組織特異型啟動子是調(diào)控目的基因只在特定器官或組織中表達。該類啟動子一般 存在一些與組織特異性相關(guān)的特異基序。Nitz等從擬南芥中分離得到編碼在根和下胚軸 中特異表達的黑芥子酶基因 PyklO啟動子序列，該啟動子能調(diào)控目的基因在轉(zhuǎn)基因擬南 芥根部高水平特異表達（Nitz等，2001，Plant Science, 161,337-346)。Bate等通過缺失 突變分析馬鈴薯花特異表達基因 LAT25的啟動子發(fā)現(xiàn)，調(diào)控花粉特異表達元件位于該基 因啟動子-492到-52區(qū)段（Bate等，1998, 37,859-869)。玉米葉片特異性PPCA1啟動子 (Gowik 等，2004, Plant Cell 16,1077-1090)、草莓果實特異性 GalUR 啟動子（Agius 等， 2005，J Exp Bot 56,37-46)等。對該類啟動子的深入研究有助于闡明植物生長發(fā)育和 生理代謝的基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價值。誘導(dǎo)型啟動子是指正常狀態(tài)下不表達或 低表達，受到某些物理或化學(xué)信號的刺激，可以大幅度地提高基因的表達水平一類啟動子。 根據(jù)誘導(dǎo)因素，誘導(dǎo)型啟動子可分為光誘導(dǎo)型啟動子、溫度誘導(dǎo)型啟動子、損傷誘導(dǎo)型啟動 子、激素誘導(dǎo)型啟動子和真菌誘導(dǎo)型啟動子等。其特點是：受到物理或化學(xué)因素的誘導(dǎo)；含 有多種功能元件，協(xié)同增強或降低啟動子的活性；部分誘導(dǎo)型啟動子同時具有組織特異性 啟動子的特點。其他誘導(dǎo)型啟動子如水稻質(zhì)膜CaATPase啟動子受干旱、寒冷、茉莉酸甲酯 以及脫落酸的誘導(dǎo)（Huda等，2013，PLoS One 8)。擬南芥RBCS-1A啟動子是光誘導(dǎo)型啟 動子，同時具有組織特異性（習(xí)雨琳等，2012，作物學(xué)報38，1561-1569);對于誘導(dǎo)型啟 動子，目的基因只有在接受誘導(dǎo)信號后才會表達，不僅不會造成各種資源的浪費，又能增強 植物體對外界的抗性，減少對植物生長發(fā)育及其他代謝途徑的影響。因此，研究和利用誘導(dǎo) 型啟動子，對于研究植物響應(yīng)各種脅迫的生理機理以及研究農(nóng)作物的抗逆基因工程都有重 要的意義，在基礎(chǔ)研究和植物生物技術(shù)方面也有著廣闊的應(yīng)用前景。然而到目前為止，能應(yīng) 用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動子仍然很少。因此，對于新的抗逆相關(guān)啟動子的克隆、順式 作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研 究仍然是今后啟動子研究的重點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能在干旱誘導(dǎo)時啟動目的基因表達的啟動子及其應(yīng)用。 本發(fā)明一方面提供了一種啟動子，該啟動子的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
[0006] 本發(fā)明還提供了含有上述啟動子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。
[0007] 所述的重組載體是在載體的多克隆位點處插入所述的啟動子后得到的重組質(zhì)粒。
[0008] 所述表達盒由所述的啟動子，該啟動子表達的目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成； 所述的啟動子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉(zhuǎn)錄終止序列連 接。
[0009] 本發(fā)明有一個方面是提供了所述的啟動子在啟動目的基因于植物表達中的應(yīng)用。 優(yōu)選是在干旱誘導(dǎo)時。
[0010] 本發(fā)明還有一個方面是提供了一種利用所述的啟動子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包 括如下步驟： 1) 構(gòu)建目的基因重組表達載體：將目的基因插入到含有所述啟動子的重組載體中，干 旱誘導(dǎo)使所述的啟動子啟動所述目的基因表達，得到目的基因重組表達載體； 2) 將步驟1)構(gòu)建的目的基因重組表達載體導(dǎo)入目的植物中，干旱誘導(dǎo)使所述的啟動子 啟動所述目的基因表達，得到表達所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
[0011] 本發(fā)明還有一個方面是提供了一種使植物在干旱誘導(dǎo)時表達目的基因的方法，其 是將目的基因插入到含有所述啟動子的重組載體中，并將該重組載體導(dǎo)入目的植物中，然 后干旱誘導(dǎo)目的基因在植物中進行表達。
[0012] 本發(fā)明所述的啟動子能夠為植物生物反應(yīng)器的研發(fā)提供實驗和技術(shù)支撐。利用所 述的干旱誘導(dǎo)型啟動子，以植物作為生物反應(yīng)器，表達疫苗、抗體及其他藥用蛋白等，可突 破傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)范疇，延伸到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1 :本發(fā)明啟動子/70^構(gòu)建PCR電泳圖。
[0014] 圖2 :本發(fā)明的啟動子/70^連接T載體質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖。
[0015] 圖3 :本發(fā)明的啟動子/70^連接PC0390⑶S酶切鑒定電泳圖。
[0016] 圖4 :干旱誘導(dǎo)條件下，啟動子/70^轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS基因組織化學(xué)染色。 [0017] 圖5 :干旱誘導(dǎo)條件下，啟動子與對照的⑶S活性比較。

【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的方法進行詳細(xì)的描述，但是以下描述的目的是示例性 的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0019] 實施例1 :本發(fā)明所述干旱誘導(dǎo)型啟動子/70^的分離 1. 1甜蕎基因組DNA的制備 將帶培養(yǎng)基質(zhì)的甜蕎苗在光照條件為8000LUX，溫度為25°C條件下生長3周。然后轉(zhuǎn) 入光照條件為8000LUX，接著采用北京艾德萊生物科技有限公司的新型植物基因組DNA快 速提取試劑盒（目錄號DN15)提取DNA。
[0020] 1. 2啟動子的克隆和序列分析 以上面提取的DNA為模板，用PCR方法擴增FeDREBl基因上游啟動子序列。其擴增引 物如下，其上游引物中引入Hind III酶切位點，下游引物中引入Bamh I酶切位點： 上游引物：5'_ CCCAAGCTTAAGGTTCTTTGCAAGTC -3' 下游引物：5'_ GCGGATCCGATCGATCCTGAATATAT -3' PCR反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1. 一種啟動子，其特征在于該啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。
2. 含有如權(quán)利要求1所述啟動子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或重組菌。
3. 如權(quán)利要求1所述的啟動子在啟動目的基因于植物表達中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的啟動子在干旱誘導(dǎo)時啟動目的基因于植物表達中的應(yīng)用。
5. 利用權(quán)利要求1所述的啟動子培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： 1) 構(gòu)建目的基因重組表達載體：將目的基因插入到含有所述啟動子的重組載體中，干 旱誘導(dǎo)使所述的啟動子啟動所述目的基因表達，得到目的基因重組表達載體； 2) 將步驟1)構(gòu)建的目的基因重組表達載體導(dǎo)入目的植物中，干旱誘導(dǎo)使所述的啟動子 啟動所述目的基因表達，得到表達所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
6. -種使植物在干旱誘導(dǎo)時表達目的基因的方法，其特征在于該方法是將目的基因插 入到含有如權(quán)利要求1所述啟動子的重組載體中，并將該重組載體導(dǎo)入目的植物中，然后 干旱誘導(dǎo)目的基因在植物中進行表達。
【文檔編號】A01H5/00GK104250647SQ201410442242
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】方正武, 劉志雄, 王彩麗, 李曉方 申請人:長江大學(xué)