一種測(cè)定茄子種子生活力的四唑染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于種子發(fā)芽能力的測(cè)定領(lǐng)域，特別涉及一種測(cè)定茄子種子生活力的四唑 染色方法，該染色方法將茄子種子于TTC染色液中進(jìn)行染色處理。
【背景技術(shù)】
[0002] 種子的生活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是種用價(jià)值的主要組成部分，它與種子田 間出苗率密切相關(guān)，是反映種子生命過(guò)程中十分重要的特性之一。種子生活力測(cè)定也是快 速鑒定種子發(fā)芽能力的一種間接方法，準(zhǔn)確的生活力測(cè)定方法能夠真實(shí)反映種子的發(fā)芽能 力和最大發(fā)芽潛力，尤其對(duì)一些休眠期長(zhǎng)的種子更為適用。由于采用常規(guī)的發(fā)芽試驗(yàn)來(lái)測(cè) 定發(fā)芽力需要的時(shí)間較長(zhǎng)，而種子壽命長(zhǎng)短各異，為了確定種子是否能用于播種及確定播 種量，有必要進(jìn)行種子生活力的高效測(cè)定。因此，研宄不同種子生活力適宜的測(cè)定方法就 具有重要意義（史周華和張雪飛，2009)。種子生活力測(cè)定是國(guó)內(nèi)外農(nóng)作物生產(chǎn)上非常重 視和關(guān)注的內(nèi)容之一。種子生活力的快速測(cè)定法主要有四唑（2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑； 2, 3, 5-Triphenyl tetrazolium chloride, TTC)染色法，溴麝香草酷蘭（BTB)法和紫外焚光 法等，其中以TTC染色法應(yīng)用最廣。其原理為有生活力的種子胚細(xì)胞含有脫氫酶，具有脫氫 還原作用，被種子所吸收的無(wú)色TTC接受了活種子呼吸過(guò)程中脫氫酶產(chǎn)生的氫，而變成還 原態(tài)的紅色穩(wěn)定不擴(kuò)散物質(zhì)，即不溶于水的三苯基甲腙（TTF)，而無(wú)生活力的種子則無(wú)此反 應(yīng)，故無(wú)染色出現(xiàn)，由此可按胚組織的染色情況區(qū)分有生活力的種子和無(wú)生活力的種子。
[0003] TTC測(cè)定于1942年由德國(guó)Socaled Hoheneim學(xué)校的H. Lakon教授發(fā)明，第二 次世界大戰(zhàn)期間傳入美國(guó)。隨著世界TTC測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（ISTA)于 1950年成立TTC測(cè)定技術(shù)委員會(huì)，致力于世界TTC測(cè)定技術(shù)的發(fā)展。1953年愛爾蘭都伯 林ISTA世界大會(huì)第一次把TTC測(cè)定列入《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（International Rules for Seed Testing)，并且不斷擴(kuò)大適用種子種類和適用范圍。1996年《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》 (International Rules for Seed Testing)已列入農(nóng)業(yè)、園藝和林木的部分種子種類和應(yīng) 用范圍內(nèi)各類種子的鑒定標(biāo)準(zhǔn)（閆富英，2005)，但迄今為止工作比較集中于木本植物及麥 類、豆類、玉米、棉花等大田農(nóng)業(yè)種子。針對(duì)蔬菜，除番茄屬作物外，其他蔬菜種子尚未列入 《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（International Rules for Seed Testing)。TTC測(cè)定技術(shù)在我國(guó)農(nóng) 林生產(chǎn)上尚未普遍應(yīng)用，相關(guān)研宄和報(bào)道極為匱乏。我國(guó)的《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》和《國(guó) 際種子檢驗(yàn)規(guī)程》中均未對(duì)茄子種子的TTC染色進(jìn)行詳細(xì)描述。綜合現(xiàn)有的各種有關(guān)資 料，農(nóng)作物種子生活力相關(guān)研宄較多，但也只是局限于水稻（盛海平等，2000)，小麥（王輝， 1999)，玉米（王麗紅，2012)等糧食作物。蔬菜種子生活力測(cè)定方法的研宄極少，僅在番茄 (虞華麗等，2007)、苦瓜（曾正明等，2001)、冬瓜（黃亞軍等，1996)等方面有報(bào)道。由于四 唑染色法測(cè)定茄子種子生活力的試驗(yàn)前人涉及較少，目前為止茄子種子生活力的具體鑒定 標(biāo)準(zhǔn)和茄子種子四唑染色圖譜尚未見報(bào)道。
[0004] 前子（Solanum melongena L.)起源于東南亞的印度、緬甸及鄰近的熱帶地區(qū)， 古稱酪酥、昆侖瓜等。它產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)，結(jié)果期長(zhǎng)，在全世界都有分布，以亞洲面積最 大（楊建國(guó)等，2013)。我國(guó)是世界上最大的茄子生產(chǎn)國(guó)（申愛民，2007)，茄子栽培面積達(dá) 73. 67萬(wàn)hm2,占世界總面積的49. 16% (徐長(zhǎng)城等，2009)。茄子種植區(qū)域廣，種子用量大， 但是休眠現(xiàn)象比較普遍（馬崇堅(jiān)，2005)。
[0005] 因此，目前的科研和實(shí)踐中，如何研宄出一種快速測(cè)定茄子種子的生活力的染色 方法，確定茄子種子的最大發(fā)芽潛力，評(píng)定種子質(zhì)量，為種子生產(chǎn)和銷售提供參考根據(jù)，成 為當(dāng)前休眠茄子種急需解決的主要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種測(cè)定茄子種子生活力的四唑染色方法，將茄子種子于TTC染色液 中進(jìn)行染色處理。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 該染色方法將茄子種子于TTC染色液中進(jìn)行染色處理；
[0009] 進(jìn)一步地，所述TTC染色液中，四唑的百分濃度0. 1% -1.5%，優(yōu)選為0.2 %或 1% ；
[0010] 進(jìn)一步地，所述TTC染色液中還包括緩沖液；
[0011] 所述緩沖液包括：
[0012] 溶液I :濃度為5-15g/L，優(yōu)選為9. 078g/L的磷酸二氫鉀溶液；
[0013] 溶液II :濃度為5-15g/L，優(yōu)選為9. 472g/L的磷酸氫二鈉溶液，或濃度為5-15g/ L，優(yōu)選為11. 876g/L二水合磷酸氫二鉀溶液；
[0014] 所述溶液I與溶液II的體積比為1 : (1-4)，優(yōu)選為I :1. 5 ;
[0015] 進(jìn)一步地，該染色方法包括以下步驟：
[0016] 浸種步驟：將茄子種子進(jìn)行浸泡處理，得到浸泡后的種子；
[0017] 染色步驟：將所述浸泡后的種子去皮處理后，再進(jìn)行染色處理，得到染色后的種 子；
[0018] 進(jìn)一步地，所述浸種步驟中，所述浸泡處理的時(shí)間為3-20小時(shí)，優(yōu)選為4小時(shí)或18 小時(shí)，溫度為15-40°C，優(yōu)選為20°C或30°C ;
[0019] 進(jìn)一步地，所述染色步驟中，所述去皮處理的速度為50-85分鐘/100粒種子，優(yōu)選 54分鐘/100粒種子或57分鐘/100粒種子；進(jìn)一步地，所述染色步驟中，所述染色處理的 時(shí)間為15-40小時(shí)，優(yōu)選為18小時(shí)或36小時(shí)，溫度為25-40°C，優(yōu)選為30°C或35°C ;
[0020] 進(jìn)一步地，所述染色步驟中，所述染色處理在避光條件下進(jìn)行。
[0021] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0022] 1、本發(fā)明以早熟京茄1號(hào)種子為材料，采用TTC法測(cè)定茄子種子生活力的適宜方 法，快速預(yù)測(cè)茄子種子最大發(fā)芽潛力，探索茄子種子生活力四唑測(cè)定值與發(fā)芽率之間的數(shù) 量關(guān)系，以驗(yàn)證評(píng)價(jià)TTC法用于早熟京茄1號(hào)種子生活力預(yù)測(cè)的可行性，為茄子種子生產(chǎn)和 銷售提供參考依據(jù)。
[0023] 2、本發(fā)明中，茄子的種子由人工去除種皮后再染色，并選用了適宜的染色條件，有 利于加強(qiáng)茄子種子的染色效果。目前關(guān)于TTC法測(cè)定種子的生活力的研宄中，在染色前的 準(zhǔn)備階段，《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（International Rules for Seed Testing)中規(guī)范了前科 番茄屬的番茄種子需要在將種子縱切為兩半，觀察切面染色情況；而茄子種子較小，種皮表 面光滑，不易切開。本發(fā)明中，種子經(jīng)快速地人工剝皮染色之后，縱切較易操作，有利于在體 視顯微鏡下觀察種子的切面染色效果，以區(qū)分種子胚各部分的著色效果，辨別種子的生活 力。
[0024] 3、本發(fā)明中，選用了適宜的染色條件，如浸種溫度、浸種時(shí)間、染色液濃度、染色溫 度、染色時(shí)間等，這些參數(shù)協(xié)同作用，共同提高了染色效果。不同作物活種子中的脫氫酶含 量不同，活性不同，因而需要的染色條件也不同。由于TTC測(cè)定法的原理是：利用種子所吸 收的無(wú)色TTC，接受了有生活力的種子呼吸過(guò)程中胚細(xì)胞里含有的脫氫酶產(chǎn)生的氫，而變成 還原態(tài)的紅色穩(wěn)定不溶于水的三苯基甲腙（TTF);因此，可以按胚組織的染色情況區(qū)分有 生活力的種子和無(wú)生活力的種子。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為試驗(yàn)例中處理組合2的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0026] 圖2為試驗(yàn)例中處理組合3的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0027] 圖3為試驗(yàn)例中處理組合5的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0028] 圖4為試驗(yàn)例中處理組合6的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0029] 圖5為試驗(yàn)例中處理組合8的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0030] 圖6為試驗(yàn)例中處理組合9的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0031] 圖7為試驗(yàn)例中處理組合11的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0032] 圖8為試驗(yàn)例中處理組合12的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0033] 圖9為試驗(yàn)例中處理組合14的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效果 的照片。
[0034] 圖10為試驗(yàn)例中處理組合15的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效 果的照片。
[0035] 圖11為試驗(yàn)例中處理組合17的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效 果的照片。
[0036] 圖12為試驗(yàn)例中處理組合18的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效 果的照片。
[0037] 圖13為試驗(yàn)例中處理組合20的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效 果的照片。
[0038] 圖14為試驗(yàn)例中處理組合21的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效 果的照片。
[0039] 圖15為試驗(yàn)例中處理組合23的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效 果的照片。
[0040] 圖16為試驗(yàn)例中處理組合24的種子染色后縱切，在體式顯微鏡下切面的染色效 果的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 一種測(cè)定茄子種子生活力的四唑染色方法，包括以下步驟：
[0042] (I)TTC染色液配制：
[0043] ①磷酸緩沖液的配制：
[0044] 溶液I :稱取5-15g(示例性地，可以為5g、8g、10g、12g、15g等中任意或任意兩者 之間的范圍，優(yōu)選為9. 078g)的ΚΗ2Ρ04(磷酸二氫鉀）溶解于1000 mL蒸餾水中；
[0045] 溶液II :稱取5_15g(示例性地，可以為5g、8g、10g、12g、15g等中任意或任意兩 者之間的范圍，優(yōu)選為9. 472g)的Na2HPO4