一種防風愈傷組織超低溫保存技術的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種防風愈傷組織超低溫保存技術。
【背景技術】
[0002]培Saposhnikovia di vari ca ta)為傘形科藥用植物，其干燥根入藥，含有多種生物化學成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗病毒等作用。但由于人為盲目、過度采挖，以及其生境惡化，防風野生資源已近枯竭，現(xiàn)多采用人工栽培，而栽培品種又易受到環(huán)境條件影響，很多出現(xiàn)退化，質(zhì)量不高，建立其組織培養(yǎng)再生體系，將組織培養(yǎng)技術應用于防風工業(yè)化生產(chǎn)變得十分必要，但隨著愈傷組織繼代次數(shù)和培養(yǎng)條件的變化，后代易發(fā)生變異。為了避免連續(xù)繼代造成的愈傷組織變異，建立新的種質(zhì)資源保存方法，因此對防風愈傷組織進行超低溫冷凍保存及植株再生也是十分必要的。
[0003]目前關于防風的研究主要集中在植物資源、化學成分分析、生藥鑒定、藥理作用和臨床應用等方面，這些研究為以防風為基源制劑的臨床應用奠定了一定的基礎。隨著生物技術的發(fā)展，超低溫保存植物愈傷組織技術已日趨完善，愈傷組織用液氮超低溫保存后，其生理代謝、分化能力下降和基因特異性喪失等問題可得到控制，可以作為一種長期穩(wěn)定保存種質(zhì)資源和工業(yè)化，免去了不必要的人力、物力、財物浪費。以超低溫冷凍方法保存的愈傷組織可在其后很長時間里根據(jù)人們的需要將其取出并用于生產(chǎn)，從而有效地保護了珍稀植物的種質(zhì)資源。至今為止，尚未見有關防風愈傷組織超低溫保的報道，這嚴重制約了防風種質(zhì)資源的保存。因此，非常有必要建立防風離體超低溫保存技術體系，為科學研究提供了極大幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種防風愈傷組織超低溫保存技術，本發(fā)明經(jīng)過愈傷組織誘導、預培養(yǎng)、裝載、脫水、冷凍、洗滌、再培養(yǎng)及再生等過程實現(xiàn)了防風愈傷組織超低溫保存，從而實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種防風愈傷組織超低溫保存技術，包括以下的工藝步驟:
(I)外植體的處理:選取當年收飽滿的防風種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗10?30min后置于清水中浸泡8?12h,再轉(zhuǎn)入50?120mg/mL的赤霉素溶液中浸泡10?15h，然后在超凈工作臺中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，無菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，無菌水沖洗3?5次后用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0006](2)愈傷組織誘導:用無菌解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后的種子上割I?3刀造成傷口后接種到誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，接種后在25?28°C條件下進行全暗培養(yǎng)直至形成愈傷組織。
[0007](3)預培養(yǎng):將步驟(2)得到的3周齡的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至預培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)，接種后在I?5°c條件下培養(yǎng)I?5天后檢測細胞存活率。
[0008](4)裝載處理:將經(jīng)步驟(3)處理后存活的愈傷組織切成Icm3左右大小，放入1mL冷凍管后加40%?60%玻璃化保護劑PVS2在室溫下裝載處理10?40min。
[0009](5)脫水及冷凍:將經(jīng)步驟(4)處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)至預冷至2°C的100%的玻璃化保護劑PVS2中在I?5°C處理20?60min后將冷凍管投入液氮中冷凍處理。
[0010](6)化凍及洗滌:愈傷組織在液氮中保存24h后，取出冷凍管，在40°C水浴中化凍，化凍過程中不斷振蕩冷凍管，使管內(nèi)愈傷組織和保護劑受熱均勻。然后用含0.5?1.0mol/L的MS培養(yǎng)液在室溫下洗滌3?5次，每次lOmin。
[0011](7)再培養(yǎng):將經(jīng)化凍后的愈傷組織用無菌水沖洗5?8次后立即轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)10?20天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)。
[0012](8)芽誘導:將步驟(7)培養(yǎng)至15?20天的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進行不定芽誘導，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)2?5天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽。
[0013](9)生根培養(yǎng):當叢生芽長至2.5?3.5cm高時，將叢生苗切割成單苗接種至生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?4天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至長出根。
[0014](10)試管苗移栽:當小苗長出的新根系長達2?3.5cm,并且長出側(cè)根，苗聞5cm以上時，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質(zhì)中并定植于大田中。
[0015]上述步驟(2)所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+ I?5mg/L 2，4-D+ 0.5?2mg/L 6-BA+0.1 ?lmg/L KT+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為
5.4 ?5.8。
[0016]上述步驟(3)所述的預培養(yǎng)基為:MS+1.0?3.0mg/L 6-BA+1.0?3.0mg/LNAA+1.0% ?5.0%DMS0+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0017]上述步驟(4)所述的玻璃化保護劑PVS2為:30%甘油+15%乙二醇+15%DMS0+0.4mol/L 的蔗糖。
[0018]上述步驟(5)所述的繼代培養(yǎng)基為:MS+0.5?3.0mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0019]上述步驟(8)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.1?0.5mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0020]上述步驟(9)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.05?0.5mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/L NAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點是:以防風種子誘導得到的愈傷組織為材料建立了防風離體超低溫保存技術體系，從而有效地保護了防風優(yōu)良種質(zhì)資源。本發(fā)明經(jīng)過愈傷組織誘導、預培養(yǎng)、裝載、脫水、冷凍、洗滌、再培養(yǎng)及再生等過程實現(xiàn)了防風愈傷組織超低溫保存，可作為一種長期穩(wěn)定保存種質(zhì)資源的方法，降低保存經(jīng)濟成本，有效地保護了珍稀的種質(zhì)資源，為科學研究提供了極大幫助。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0023]實施例:
(I)外植體的處理:選取當年收飽滿的防風種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗1min后置于清水中浸泡8h,再轉(zhuǎn)入50mg/mL的赤霉素溶液中浸泡1h,然后在超凈工作臺中以75%乙醇溶液浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒5min,無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0024](2)愈傷組織誘導:用無菌解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后的種子上割I刀造成傷口后接種到誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，接種后在28°C條件下進行全暗培養(yǎng)直至形成愈傷組織。所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+ 4mg/L 2，4-D+ lmg/L 6-BA+ 0.5mg/L KT+3.5%蔗糖+0.5%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8。
[0025](3)預培養(yǎng):將步驟(2)得到的3周齡的長勢良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至預培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)，接種后在2°C條件下培養(yǎng)I天后檢測細胞存活率。所述的預培養(yǎng)基為