一種哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液及哲羅鮭精液的冷凍保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種魚類精液低溫冷凍保存液及哲羅鮭精液的冷凍保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]哲羅鮭屬鮭形目、鮭科、隸屬于哲羅鮭屬；瀕危等級(jí)為易危。由于哲羅鮭營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩，肉味鮮美，深受廣大消費(fèi)者青睞；因此，近年來(lái)市場(chǎng)對(duì)哲羅鮭的需求量不斷增加。盡管哲羅鮭的商業(yè)化養(yǎng)殖與育種事業(yè)得到了大力發(fā)展，但在進(jìn)行選育工作中種質(zhì)資源的保護(hù)卻一直被忽視，導(dǎo)致哲羅鮭雜交育種過(guò)程中近交種質(zhì)退化愈演愈烈，遺傳多樣性降低，品質(zhì)下降，生長(zhǎng)性能低下，大部分養(yǎng)殖品種對(duì)病害和環(huán)境脅迫的防御能力降低，病害頻發(fā)，因而給養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]自從上個(gè)世紀(jì)50年代，英國(guó)學(xué)者Blaxter首次成功對(duì)魚類精巢進(jìn)行冷凍以來(lái)，國(guó)外許多學(xué)者對(duì)魚類精子的長(zhǎng)期冷凍保存也進(jìn)行了相關(guān)研宄和探索，不但對(duì)魚類的生命進(jìn)程具有重要意義，而且對(duì)培育魚類新品種及其商業(yè)化養(yǎng)殖也將產(chǎn)生巨大的深遠(yuǎn)影響。
[0004]雖然，長(zhǎng)期冷凍技術(shù)在其他魚種有過(guò)成功案例，但是哲羅鮭的精子冷凍再解凍后存在活率低(30%左右)，存活精子的活力低、活動(dòng)率(運(yùn)動(dòng)比例不到20% )大幅下降的問(wèn)題，導(dǎo)致哲羅鮭的精子目前卻仍然無(wú)法通過(guò)長(zhǎng)期冷凍技術(shù)進(jìn)行保存。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有哲羅鮭精子長(zhǎng)期冷凍技術(shù)存在的活率低，存活精子的活力低、活動(dòng)率大幅下降的問(wèn)題，而提供的一種哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液及哲羅鮭精液的冷凍保存方法。
[0006]本發(fā)明哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中按摩爾比K+: Na+〈I: 16，哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中K+濃度為0.00480mol/L?0.00682mol/L。
[0007]哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由7.95?8.07g的NaCl、0.325?0.475g的KC1、0.12 ?0.15g 的 CaCl2、0.349 ?0.351g 的 NaHCO3> 0.059 ?0.061g 的 ΚΗ2Ρ04、0.30 ?0.38g的葡萄糖和100ml的蒸餾水組成。
[0008]采用上述哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液冷凍保存哲羅鮭精液按以下步驟進(jìn)行:
[0009]一、采集哲羅鮭新鮮精液；
[0010]二、向7.92ml哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩渦混勻器充分混合，然后置于4°C環(huán)境中平衡15分鐘，再放入新鮮哲羅鮭精液進(jìn)行混合，充分混勻后置于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷凍保存混合液；
[0011]三、將精液冷凍保存混合液用微量移液器分裝于麥管中，然后放置于4°C環(huán)境中備用；
[0012]四、將液氮導(dǎo)入帶蓋泡沫箱中，移入麥管中的精液冷凍保存混合液在距離液氮液面上方8cm處停留5?15min，然后在距液氮液面上方4cm處停留3?8min，再將麥管直接投入液氮中長(zhǎng)期保存；
[0013]五、解凍采用快速水浴解凍法；其中，步驟二中新鮮哲羅鮭精液的加入量為3ml。
[0014]哲羅鮭不同于其他海水魚類和溫水性魚類，哲羅鮭的精子只有在特定離子濃度的溶液中才能保持靜止不被激活(不做直線或漩渦運(yùn)動(dòng))，而且還要同時(shí)保持超低溫冷凍保存液中K+與Na +之間的特定比例關(guān)系方能夠?qū)崿F(xiàn)。
[0015]本發(fā)明哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液將K+濃度設(shè)計(jì)為0.00480mol/L?0.00682mol/L，保持哲羅鮭精子靜止不被激活；而且解凍后哲羅鮭精子的活動(dòng)力高，運(yùn)動(dòng)比例彡50%、存活率彡60%。
[0016]采用本發(fā)明的冷凍保存方法哲羅鮭精子可以保存3?15年，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。哲羅鮭精子冷凍保存3年解凍后哲羅鮭精子的活動(dòng)力高、運(yùn)動(dòng)比例多50%，存活率多60%。
[0017]本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，具有冷凍保存時(shí)間長(zhǎng)，解凍后精子質(zhì)量高的優(yōu)點(diǎn)。
[0018]通過(guò)對(duì)哲羅鮭精子冷凍保存解決了哲羅鮭繁殖期不同，各繁育群體之間無(wú)法配育種的問(wèn)題；尤其是遺傳距離較遠(yuǎn)的品系、種之間的雜交。哲羅鮭精子冷凍保存還使跨區(qū)域雜交繁育得而實(shí)現(xiàn)，降低了運(yùn)輸成本，也避免了運(yùn)輸過(guò)程中活體死亡造成的風(fēng)險(xiǎn)。
[0019]本發(fā)明哲羅鮭精子冷凍保技術(shù)對(duì)未來(lái)商業(yè)養(yǎng)殖種，避免自群繁育、近親交配或小群體繁殖具有重大意義。也能夠有效防止哲羅鮭基因丟失和遺傳嬗變所導(dǎo)致的種質(zhì)退化。
[0020]本發(fā)明對(duì)哲羅鮭的優(yōu)良品種的種質(zhì)保存、遺傳多樣性保護(hù)、遺傳育種、人工繁殖具有深遠(yuǎn)影響。使建哲羅鮭的冷凍精子庫(kù)，形成遺傳背景檔案變?yōu)榭赡??？梢愿玫貙?duì)應(yīng)突發(fā)疾病、自然災(zāi)害、或水域污染等對(duì)哲羅鮭物種造成的威脅。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0022]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中按摩爾比K+:Na+〈1: 16，哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中K+濃度為0.00480mol/L?0.00682mol/L。
[0023]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一的不同點(diǎn)是:哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由 ?.95 ?8.07g 的 NaCl、0.325 ?0.475g 的 KC1、0.12 ?0.15g 的 CaCl2、0.349 ?0.351g 的 NaHCO3>0.059 ?0.061g 的 ΚΗ2Ρ04、0.30 ?0.38g 的葡萄糖和 100ml 的蒸餾水組成。其它與實(shí)施方式一相同。
[0024]本實(shí)施方式中HCO3IP H2PCV具有弱電離作用，會(huì)形成弱堿效果，提高精子的受精能力；并且能夠增加哲羅鮭的精子活力。
[0025]葡萄糖不但能給精子提供外源能量，還能在精子外層形成保護(hù)膜，在冷凍狀態(tài)抑制堿性環(huán)境對(duì)哲羅鮭精子造成的能量損失，而在解凍后葡萄糖會(huì)迅速溶于水，解除對(duì)哲羅鮭精子的糖衣保護(hù)，使精子更好的在堿性環(huán)境發(fā)揮作用。因此，即使是在弱堿性的冷凍保存液中哲羅鮭精子頭部?jī)?nèi)的能量仍能夠在長(zhǎng)期低溫環(huán)境被保留下來(lái)，不被消耗掉。
[0026]葡萄糖不但解決了其他離子對(duì)哲羅鮭精子的損傷作用，還解決了降低了抗凍劑的毒性作用。
[0027]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一的不同點(diǎn)是:哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由 8.0lg 的 NaCK0.4g 的 KCl,0.14g 的 CaCl2、0.35g 的 NaHC03、0.06g 的 KH2PO4'0.34g的葡萄糖和1000ml的蒸餾水組成。其它與實(shí)施方式一相同。
[0028]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式哲羅鮭精液按以下步驟進(jìn)行冷凍保存:
[0029]一、采集哲羅鮭新鮮精液；
[0030]二、向7.92ml哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩渦混勻器充分混合，然后置于4°C環(huán)境中平衡15分鐘，再放入新鮮哲羅鮭精液進(jìn)行混合，充分混勻后置于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C環(huán)境中平衡I分鐘，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷凍保存混合液；
[0031]三、將精液冷凍保存混合液用微量移液器分裝于麥管中，然后放置于4°C環(huán)境中備用；
[0032]四、將液氮導(dǎo)入帶蓋泡沫箱中，移入麥管中的精液冷凍保存混合液在距離液氮液面上方8cm處停留5?15min，然后在距液氮液面上方4cm處停留3?8min，再將麥管直接投入液氮中長(zhǎng)期保存；
[0033]五、解凍采用快速水浴解凍法；其中，步驟二中新鮮哲羅鮭精液的加入量為3ml。
[0034]本實(shí)施方式中哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液由8.0lg的NaCl、0.4g的KC1、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHC03、0.06g的KH2P04、0.34g的葡萄糖和1000ml的蒸餾水組成。
[0035]本實(shí)施方式中丙三醇為抗凍劑。
[0036]本實(shí)施方式步驟一采集哲羅鮭新鮮精液:將體壯健康的哲羅鮭雄魚從水池?fù)瞥觯褂脻舛葹?ml/L的苯氧乙醇水溶液進(jìn)行麻醉；待哲羅鮭進(jìn)入麻醉狀態(tài)，將其體表和生殖孔反復(fù)用干燥的無(wú)菌紗布擦凈；之后從頭向尾方向反復(fù)強(qiáng)力按壓上腹部(約側(cè)線鱗上方)，成熟的精液少量流出，用2ml吸管或5ml注射器連續(xù)采集持續(xù)流出的精液，吸滿后不斷放入大口容器中，并4°C低溫暫存。通過(guò)人工擠壓腹部采集精液是最常用的方法，注意在采集時(shí)要防止水、血液、體表粘液、尿液和糞便等對(duì)精液的污染。
[0037]采集哲羅鮭新鮮精之后對(duì)精液質(zhì)量進(jìn)行鑒定:取適量精液，利用等溫的水或低滲鈉鹽溶液激活精子，鏡檢精子的活力狀況，成熟的精子激活后應(yīng)立即作快速的直線運(yùn)動(dòng)，或渦旋運(yùn)動(dòng)；活動(dòng)率在80%以上的精液方可進(jìn)行冷凍保存。
[0038]本實(shí)施方式通過(guò)哲羅鮭精液超低溫冷凍保存液與被保存的哲羅鮭精液形成混合物，并發(fā)生相互作用，在本實(shí)施方式特定的降溫過(guò)程中精液本身帶有的精漿成分會(huì)緩解遇到冷凍保存液而遭遇低滲吸水的可能，隨著精漿成分與冷凍保存液的不斷融合，使冷凍保存液中的離子發(fā)揮了穩(wěn)定滲透壓的作用，保護(hù)了精子并降低了抗凍劑毒性。
[0039]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】四的不同點(diǎn)是:步驟四中液氮液面距離箱口 12cm?15cm。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式四相同。
[0040]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】四或五的不同點(diǎn)是:步驟五快速水浴解凍法:將冷凍保存的麥管進(jìn)行水浴解凍，水浴水溫為25°C?30°C，解凍時(shí)間為15?18s，解凍過(guò)程中搖動(dòng)麥管。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式四或五相同。
[0041]實(shí)施例1
[0042]哲羅鮭精液按以下步驟進(jìn)行冷凍保存:
[0043]—、采集哲羅鮭新鮮精液，經(jīng)檢測(cè)精子活動(dòng)率為85.4% ;
[0044]二、向7.92ml哲羅鮭