一種利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物種苗生產(chǎn)方法，具體涉及一種利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方 法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 藏紅花（Crocus sativus L.)別名番紅花、西紅花，是一種鸞尾科番紅花屬的多年 生花丼，也是一種常見(jiàn)的香料。是西南亞原生種，最早由希臘人人工栽培。主要分布在歐 洲、地中海及中亞等地，明朝時(shí)傳入中國(guó)，《本草綱目》將它列入藥物之類，中國(guó)浙江等地有 種植。是一種名貴的中藥材，具有強(qiáng)大的生理活性，其柱頭在亞洲和歐洲作為藥用，有鎮(zhèn)靜、 祛痰、解痙作用，用于胃病、調(diào)經(jīng)、麻瘆、發(fā)熱、黃膽、肝脾腫大等的治療。
[0003] 由于藏紅花不能進(jìn)行有性生殖，只能通過(guò)球莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，且栽培條件下其球 莖退化現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致種質(zhì)資源嚴(yán)重缺乏。我國(guó)自引種以來(lái)，栽培藏紅花產(chǎn)量一直較低，遠(yuǎn) 遠(yuǎn)不能滿足人們的需要。近年來(lái)組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在藏紅花種苗的生產(chǎn)上，為藏紅花種球 短缺與退化提供了一種解決方法，但是植株組織培養(yǎng)是一個(gè)勞動(dòng)密集型產(chǎn)業(yè)，生產(chǎn)成本居 高不下，種苗的生產(chǎn)也只停留在實(shí)驗(yàn)階段。
[0004] 本發(fā)明利用淺層培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藏紅花微球莖，由于采用液體培養(yǎng)模式，更易實(shí)現(xiàn) 產(chǎn)業(yè)化和自動(dòng)化，將是解決藏紅花種球短缺的一個(gè)有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生長(zhǎng)周期短、移栽存活率高、成本低、操作簡(jiǎn) 單且適宜大規(guī)模生產(chǎn)的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：該利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微 球莖方法，包括以下步驟：
[0007] (1)培養(yǎng)容器滅菌：將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)容器中，并在高溫高壓濕熱消毒滅菌后待 用；
[0008] (2)外植體的獲得及滅菌處理：將藏紅花球莖放入含有消毒液的水中培養(yǎng)待其長(zhǎng) 出葉片，取下葉片，清水沖洗20~40分鐘；在超凈臺(tái)中將上述藏紅花葉片進(jìn)行表面消毒滅 菌處理；
[0009] (3)淺層培養(yǎng)的外植體的制備：將步驟（2)中已消毒滅菌的葉片在無(wú)菌環(huán)境下切 成0. 5~1.0 cm的小段，并接種到已滅菌的誘導(dǎo)藏紅花愈傷組織的固體培養(yǎng)基中，獲得藏紅 花愈傷組織；所述藏紅花愈傷組織即為淺層培養(yǎng)的外植體；
[0010] (4)淺層培養(yǎng)：
[0011] ㈧叢生芽誘導(dǎo)：將步驟⑶中獲得的愈傷組織切成〇. 1~〇. 3cm3小塊接種到液 體淺層叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為15~25d ;
[0012] (B)微球莖形成：叢生芽誘導(dǎo)結(jié)束后，不移動(dòng)組培苗及培養(yǎng)基，直接向組培瓶中添 加誘導(dǎo)微球莖形成的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為30~45d ;即獲得藏紅花叢生微球莖。
[0013] 采用上述技術(shù)方案，首先將滅菌后的藏紅花葉片進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，在植物組織 培養(yǎng)過(guò)程中，愈傷組織的培養(yǎng)是至關(guān)重要的步驟；愈傷組織的培養(yǎng)是無(wú)性繁殖且可以在短 時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)繁，從而為后續(xù)淺層培養(yǎng)提供材料；將淺層培養(yǎng)過(guò)程分為叢生芽誘導(dǎo)步驟和 微球莖形成步驟兩個(gè)過(guò)程，且兩個(gè)步驟之間不移動(dòng)組培苗及培養(yǎng)基，直接在叢生芽誘導(dǎo)步 驟的組培瓶中添加促進(jìn)微球莖形成的培養(yǎng)基，由于所采用的液體培養(yǎng)基均為淺層培養(yǎng)，營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)更易被吸收、利用充分，培養(yǎng)體生長(zhǎng)速度快，從而快速獲得大量用于生產(chǎn)的藏紅花叢 生微球莖；該方法解決了更換組培瓶及培養(yǎng)基時(shí)對(duì)叢生芽造成的傷害，提高了叢生芽接種 至微球莖形成培養(yǎng)基時(shí)的存活率，提高了微球莖的增殖率。
[0014] 通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將淺層培養(yǎng)過(guò)程分為叢生芽誘導(dǎo)步驟和微球莖形成步驟 兩個(gè)過(guò)程，且兩個(gè)步驟之間不移動(dòng)組培苗及培養(yǎng)基，直接在叢生芽誘導(dǎo)步驟的組培瓶中添 加促進(jìn)微球莖形成的培養(yǎng)基的操作過(guò)程更為簡(jiǎn)單方便，且極大的降低了操作過(guò)程中的污染 率；從而提高了叢生芽的存活率；同時(shí)由于所采用的液體培養(yǎng)基均為淺層培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 更易被吸收、利用充分，培養(yǎng)體生長(zhǎng)速度快。
[0015] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟（2)中的滅菌處理的具體步驟為：首先在 75%無(wú)水乙醇中浸泡15~30s，再用無(wú)菌水清洗2~4次，然后放入摩爾濃度為0. 1 %的升 汞中浸泡3~5min，再用無(wú)菌水清洗5~8次。滅菌的處理對(duì)后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程非常關(guān)鍵，直 接影響后續(xù)培養(yǎng)的誘導(dǎo)率、增殖率以及生根率，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該滅菌方法對(duì)本發(fā)明后 續(xù)的培養(yǎng)最好。
[0016] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟（3)中的誘導(dǎo)藏紅花愈傷組織的固體培養(yǎng)基 的配方為：MS+0. 5 ~I. 5mg/L 6-BA+0. 05 ~0· 2mg/L NAA+ 藏紅花汁液 0· 1 ~0· 3g/L+ 蔗 糖25g/L+瓊脂5. 5g/L，pH為5. 6~6. 0,培養(yǎng)時(shí)間為25~30d。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的 組成直接關(guān)系到愈傷組織的誘導(dǎo)率以及愈傷組織的質(zhì)量，為了提高藏紅花外植體的愈傷組 織的誘導(dǎo)率，本發(fā)明對(duì)藏紅花外植體愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，如pH影響愈傷組 織對(duì)NO3-和NH4+的吸收利用，pH高有利于愈傷組織對(duì)NH4+的吸收利用，pH低則可以提高其 對(duì)NCT的利用；通過(guò)大量的篩選試驗(yàn)最終確定，采用上述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行藏紅 花外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好。
[0017] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟（4)中的（A)步驟中的液體培養(yǎng)基的配方為： MS+1. 5 ~2. 5mg/L 6-BA+0. 05 ~0· 15mg/L NAA+藏紅花汁液 0· 1 ~0· 3g/L+蔗糖 20g/L+AC 0. 1~0. 3g/L，pH為5. 6~6. 0,將配制好的液體培養(yǎng)基倒入組培瓶中，液面高度為0. 2~ 0. 5cm，滅菌后使用。在該液面高度下進(jìn)行淺層培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易被吸收、利用充分，培養(yǎng) 體生長(zhǎng)速度快，更有利于叢生芽的生長(zhǎng)；此外如果液面高度過(guò)高，培養(yǎng)體完全浸泡在液體中 易產(chǎn)生玻璃化；如果液面高度過(guò)低，營(yíng)養(yǎng)不足影響培養(yǎng)體生長(zhǎng)。
[0018] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟（4)中的（B)步驟中的液體培養(yǎng)基的配方為： 1/2MS+0. 1 ~0· 5mg/L ΙΒΑ+0. 05 ~0· 2mg/L NAA+ 藏紅花汁液 0· 1 ~0· 3g/L+ 蔗糖 30g/L， pH為5. 6~6. 0,將配制好的液體培養(yǎng)基滅菌后倒入組培瓶中，液面高度為0. 5~I. 0cm。 此處，如果液面高度過(guò)高，培養(yǎng)體完全浸泡在液體中易產(chǎn)生玻璃化；如果液面高度過(guò)低，營(yíng) 養(yǎng)不足影響培養(yǎng)體生長(zhǎng)。
[0019] 通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在步驟（3)和步驟（4)的培養(yǎng)基中，藏紅花汁液適宜添加 量為0. 1~0. 3g/L，當(dāng)培養(yǎng)基中藏紅花汁液添加量低于0. lg/L時(shí)，獲得的藏紅花微球莖和 普通培養(yǎng)獲得的微球莖長(zhǎng)勢(shì)并沒(méi)有顯著差異，微球莖的直徑、株高等小于添加量在0. 1~ 0. 3g/L時(shí)獲得的微球莖，且差異顯著；當(dāng)藏紅花汁液添加量高于0. 3g/L時(shí)，隨著添加量的 增加微球莖并沒(méi)有顯著地變化。藏紅花汁液中含有藏紅花生長(zhǎng)過(guò)程中所不可缺少而又無(wú)法 人工合成的微量元素，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明，添加藏紅花汁液的培養(yǎng)液比普通培養(yǎng)液培養(yǎng) 獲得的藏紅花組培苗更健壯。以普通培養(yǎng)液為對(duì)照，培養(yǎng)80天后比較藏紅花組培苗長(zhǎng)勢(shì)情 況如下表：
[0020]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 培養(yǎng)容器滅菌：將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)容器中，并在高溫高壓濕熱消毒滅菌后待用； (2) 外植體的獲得及滅菌處理：將藏紅花球莖放入含有消毒液的水中培養(yǎng)待其長(zhǎng)出葉 片，取下葉片，清水沖洗20~40分鐘；在超凈臺(tái)中將上述藏紅花葉片進(jìn)行表面消毒滅菌處 理； (3) 淺層培養(yǎng)的外植體的制備：將步驟（2)中已消毒滅菌的葉片在無(wú)菌環(huán)境下切成 0. 5~1.0 cm的小段，并接種到已滅菌的誘導(dǎo)藏紅花愈傷組織的固體培養(yǎng)基中，獲得藏紅花 愈傷組織；所述藏紅花愈傷組織即為淺層培養(yǎng)的外植體； (4) 淺層培養(yǎng)： (A) 叢生芽誘導(dǎo)：將步驟（3)中獲得的愈傷組織切成0. 1~0. 3cm3小塊接種到液體淺 層叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為15~25d ; (B) 微球莖形成：叢生芽誘導(dǎo)結(jié)束后，不移動(dòng)組培苗及培養(yǎng)基，直接向組培瓶中添加誘 導(dǎo)微球莖形成的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為30~45d ;即獲得藏紅花叢生微球莖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在于，所述步 驟（2)中的滅菌處理的具體步驟為：首先在75%無(wú)水乙醇中浸泡15~30s，再用無(wú)菌水清 洗2~4次，然后放入摩爾濃度為0. 1 %的升采中浸泡3~5min，再用無(wú)菌水清洗5~8次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在于，所述步 驟⑶中的誘導(dǎo)藏紅花愈傷組織的固體培養(yǎng)基的配方為：MS+0. 5~I. 5mg/L 6-BA+0. 05~ 0? 2mg/L NAA+ 藏紅花汁液 0? 1 ~0? 3g/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 5. 5g/L，pH 為 5. 6 ~6. 0,培養(yǎng) 時(shí)間為25~30d。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在于，所述步 驟（4)中的（A)步驟中的液體培養(yǎng)基的配方為：MS+1. 5~2. 5mg/L 6-BA+0. 05~0? 15mg/ L NAA+藏紅花汁液0? 1~0? 3g/L+蔗糖20g/L+AC 0? 1~0? 3g/L，pH為5. 6~6. 0,將配制 好的液體培養(yǎng)基倒入組培瓶中，液面高度為〇. 2~0. 5cm，滅菌后使用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在于，所述步 驟（4)中的（B)步驟中的液體培養(yǎng)基的配方為：l/2MS+0. 1~0. 5mg/L IBA+0. 05~0. 2mg/ L NAA+藏紅花汁液0. 1~0. 3g/L+蔗糖30g/L，pH為5. 6~6. 0,將配制好的液體培養(yǎng)基滅 菌后倒入組培瓶中，液面高度為0. 5~I. 0cm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在于，所述步 驟（3)中的誘導(dǎo)藏紅花愈傷組織培養(yǎng)的環(huán)境為：暗培養(yǎng)30~40d，溫度為19~22°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在于，所述步 驟（4)中的（A)步驟中叢生芽生長(zhǎng)的培養(yǎng)環(huán)境為：首先進(jìn)行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)時(shí)間為10~ 15d ;然后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照周期14h/d，光照強(qiáng)度1800~2000LX，培養(yǎng)時(shí)間為5~IOd ; 所述培養(yǎng)環(huán)境溫度為19~22°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在于，所述 步驟（4)中的（B)步驟中微球莖產(chǎn)生的培養(yǎng)環(huán)境為：光照周期14h/d，光照強(qiáng)度2000~ 2500LX，溫度 18 ~2(TC。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖方法，其特征在 于，所述藏紅花汁液的制備方法是鮮物研磨或榨汁。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用淺層培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花微球莖的方法，該方法包括(1)培養(yǎng)容器滅菌；(2)外植體的獲得及滅菌處理；(3)淺層培養(yǎng)的外植體的制備；(4)淺層培養(yǎng)；(A)叢生芽誘導(dǎo)；(B)微球莖形成；淺層培養(yǎng)階段又分叢生芽誘導(dǎo)和微球莖形成兩個(gè)過(guò)程。由于淺層培養(yǎng)采用的液體培養(yǎng)模式，培養(yǎng)體更易吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，所以種苗生長(zhǎng)快，縮短了微球莖生產(chǎn)時(shí)間；同時(shí)淺層培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，成本低，更容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；凸I(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104855289
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510263701
【發(fā)明人】周志疆, 陳明亮, 張麗麗, 韓婷
【申請(qǐng)人】江蘇豐收大地種業(yè)發(fā)展有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年5月21日