玉郎傘的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織培養(yǎng)方法，尤其涉及一種玉郎傘的組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玉郎傘是廣西壯族的民間習(xí)用藥材，主要分布于廣西、廣東等地，具有補(bǔ)氣、補(bǔ)血、補(bǔ)虛潤(rùn)肺之功能，民間用于治療營(yíng)養(yǎng)不良、老年健忘、小兒智力低下，產(chǎn)后虛弱、腰腿痛、風(fēng)濕痛和慢性肝炎等疾病。服用后能強(qiáng)身健體、消除疲勞，提高免疫力及改善大腦記憶。
[0003]目前有關(guān)玉郎傘的繁殖、栽培等未見報(bào)道，民間多采用野生資源，近年來(lái)隨著市場(chǎng)需求的不斷增加，對(duì)野生資源的采集量逐漸增大，野生玉郎傘資源瀕臨枯竭。
[0004]植物組織培養(yǎng)用的外植體大部分取自田間及野外，表面上附著有大量的微生物，為了獲得無(wú)菌外植體，在外植體接種培養(yǎng)前必須進(jìn)行消毒處理，消毒要求殺滅外植體表面的微生物，同時(shí)保證對(duì)外植體的損傷盡可能小，盡量做到無(wú)損傷。外植體的消毒是植物組織培養(yǎng)中的首要環(huán)節(jié)，也是最重要的環(huán)節(jié)。現(xiàn)有的消毒處理，大多采用雙氧水、次氯酸鈉、抗生素和升汞等進(jìn)行消毒，存在著消毒效果差，消毒劑殘留，對(duì)外植體和人體傷害大，嚴(yán)重污染環(huán)境等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種外植體的消毒方法，其消毒效果好，對(duì)外植體，人體和環(huán)境均沒有傷害，也無(wú)試劑殘留。
[0006]本發(fā)明還有一個(gè)目的是通過(guò)玉郎傘的組織培養(yǎng)，提高玉郎傘的繁殖系數(shù)，以滿足市場(chǎng)需求及對(duì)野生資源進(jìn)行保護(hù)。
[0007]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種煉苗用的苗床，其具有透氣，防止基質(zhì)積水等作用，為試管苗提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。
[0008]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0009]一種玉郎傘的組織培養(yǎng)方法，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)、所述增殖培養(yǎng)、所述壯苗培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)均在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行。
[0010]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)之前還包括獲得無(wú)菌外植體的步驟，其中，所述獲得無(wú)菌外植體的步驟為:
[0011]步驟一、取側(cè)芽作為外植體，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的洗潔精水溶液浸泡5-10min，浸泡過(guò)程中用毛筆輕輕洗刷外植體表面污垢，取出外植體后用自來(lái)水沖洗15-30min，再用無(wú)菌水潤(rùn)洗一次，移至超凈工作臺(tái)；
[0012]步驟二、將所述步驟一中處理后的外植體在體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中浸泡30-50s后，取出外植體，并將外植體置于無(wú)菌水中，之后每隔l-2h向無(wú)菌水中通入流量為0.1-0.2m3/min的臭氧-空氣的混合氣體，每次通入6_10min，通入4_6次后，取出外植體，并用無(wú)菌水沖洗3-5次，最后用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面水分，得到無(wú)菌外植體。
[0013]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，所述臭氧-空氣的混合氣體中，所述臭氧的濃度為4-6mg/L。
[0014]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)中，將無(wú)菌外植體在溫度為24-26°C，光照強(qiáng)度為15001UX，及光照時(shí)間為10_12h/d的條件下培養(yǎng)30d，誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)，以得到無(wú)菌試管苗；
[0015]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)中的固體培養(yǎng)基包含:MS，30g.L—1蔗糖，1.5-2.5mg.L ^6-芐基腺嘌呤和5.0g.L—1瓊脂，并調(diào)節(jié)初始pH值為5.8。
[0016]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)之后進(jìn)行所述增殖培養(yǎng)，將經(jīng)過(guò)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的無(wú)菌試管苗在溫度為24-26 °C，光照強(qiáng)度為20001UX，及光照時(shí)間為10-12h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到大量不定芽；
[0017]所述增殖培養(yǎng)中的固體培養(yǎng)基包含:MS，30g.L—1蔗糖，0-0.5mg.L ^6-芐基腺嘌呤，0.5-1.5mg.L—1激動(dòng)素，0.1-0.5mg.L ―1吲哚乙酸和5.0g.L ―1瓊脂，并調(diào)節(jié)初始pH值為
5.8ο
[0018]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，在所述增殖培養(yǎng)之后進(jìn)行所述壯苗培養(yǎng)，將經(jīng)過(guò)所述增殖培養(yǎng)得到的不定芽在溫度為24-26?，光照強(qiáng)度為20001uX，及光照時(shí)間為10-12h/d的條件下培養(yǎng)21d，得到健壯植株；
[0019]所述壯苗培養(yǎng)中的固體培養(yǎng)基包含:MS，30g.L—1蔗糖，0.1-0.5mg.L 1-芐基腺嘌呤，0.3-0.5mg.L—1的吲哚乙酸和5.0g.L ―1瓊脂，并調(diào)節(jié)初始pH值為5.8。
[0020]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，在所述壯苗培養(yǎng)之后進(jìn)行所述生根培養(yǎng)，將經(jīng)過(guò)所述壯苗培養(yǎng)得到的健壯植株在溫度為24-26°C，光照強(qiáng)度為20001uX，及光照時(shí)間為10-12h/d的條件下培養(yǎng)21d，得到帶根苗，試管苗根長(zhǎng)為2-4cm ；
[0021]所述生根培養(yǎng)中的固體培養(yǎng)基包含:l/2MS，30g.L—1蔗糖，0.1-0.5mg.廠1卩引噪乙酸，0-1.0mg.L—1萘乙酸和5.0g.L ―1瓊脂，并調(diào)節(jié)初始pH值為5.8。
[0022]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，在所述生根培養(yǎng)之后還包括煉苗移栽的步驟，其中，所述煉苗移栽的步驟為:
[0023]步驟a、將經(jīng)過(guò)所述生根培養(yǎng)得到的帶根苗連同培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入大棚，在溫度為25-270C的條件下放置7天，然后打開瓶蓋，在培養(yǎng)瓶中加入自來(lái)水，使生根培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基全部位于水中，并繼續(xù)培養(yǎng)3-4天；
[0024]步驟b、設(shè)置底部橫截面為長(zhǎng)方形的凹字型水泥墩，使得所述水泥墩沿長(zhǎng)度方向的兩個(gè)高部的豎直高度均比低部高10-12cm，所述水泥墩沿長(zhǎng)度方向的兩側(cè)外部設(shè)置水溝，所述低部沿水泥墩寬度方向設(shè)有多個(gè)凹槽，所述多個(gè)凹槽由中間向兩側(cè)直徑逐漸增大，且呈對(duì)稱分布的圓臺(tái)狀；在所述低部上鋪設(shè)濾網(wǎng)，并在所述濾網(wǎng)上從下到上依次鋪設(shè)粗石塊層、細(xì)砂層，砂石層，以及塘泥、蛭石和椰糠的混合基質(zhì)層；
[0025]步驟C、洗凈所述步驟a中處理后的試管苗的根部的固體培養(yǎng)基，移栽到混合基質(zhì)層中，移栽后7-10天，在水泥墩上水平鋪設(shè)一層遮光率為60-70 %的遮陽(yáng)網(wǎng)，使遮陽(yáng)網(wǎng)剛好遮住混合基質(zhì)層，每天噴水I次，保持空氣濕度為85% -90%。
[0026]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，所述混合基質(zhì)中塘泥、蛭石和椰糠體積比為3:1:1。
[0027]優(yōu)選的是，所述的玉郎傘的組織培養(yǎng)方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)、所述增殖培養(yǎng)、所述壯苗培養(yǎng)和所述生根培養(yǎng)均在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，所述培養(yǎng)瓶的瓶口，瓶蓋及瓶口下l-2cm處的內(nèi)壁上均涂有光觸媒。
[0028]本發(fā)明至少包括以下有益效果:
[0029]第一、本發(fā)明利用組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，保留了原有品種的優(yōu)良性狀，且能有效且快速地增加玉郎傘的繁殖系數(shù)，不僅能滿足市場(chǎng)對(duì)玉郎傘藥材的需求，又有利于玉郎傘野生資源的保護(hù)。
[0030]第二、本發(fā)明對(duì)外植體消毒，先用乙醇浸泡，乙醇具有殺菌速度較快，對(duì)人體刺激性小，無(wú)毒，對(duì)外植體無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)；再用臭氧消毒，其具有殺菌徹底，無(wú)殘留，殺菌廣譜，可殺滅細(xì)菌繁殖體和芽孢、病毒、真菌等。另外，臭氧對(duì)霉菌也有極強(qiáng)的殺滅作用。臭氧由于穩(wěn)定性差，很快會(huì)自行分解為氧氣或單個(gè)氧原子，而單個(gè)氧原子能自行結(jié)合成氧分子，不存在任何有毒殘留物。臭氧為氣體，能迅速?gòu)浡剿?，滅菌無(wú)死角。而傳統(tǒng)的滅菌消毒方法，無(wú)論是紫外線，還是化學(xué)熏蒸法，都有不徹底、有死角、工作量大、有殘留污染或有異味等缺點(diǎn)，并有可能損害人體健康及污染環(huán)境等。
[0031]第三、煉苗用的生長(zhǎng)基質(zhì)應(yīng)當(dāng)多空隙，有良好的排水和通氣性能，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種煉苗用的苗床，該苗床具有防止積水，利于透氣等功能，遮陽(yáng)網(wǎng)由凹字型水泥墩的兩個(gè)高部支撐，與低部上的幼苗有一定間隙，這樣不會(huì)壓壞幼苗，且利于透氣，散熱，能防止噴水后高溫引起萎蔫及高濕引起爛苗。
[0032]第四、本發(fā)明在培養(yǎng)瓶的瓶口、瓶蓋及瓶口下l-2cm處的內(nèi)壁上均涂有光觸媒，光觸媒在光線作用下，產(chǎn)生強(qiáng)烈催化降解功能，能有效殺滅多種細(xì)菌，并能將細(xì)菌或真菌釋放出的毒素分解及無(wú)害化處理，能一定程度上防止培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，尤其是打開培養(yǎng)瓶，瓶蓋放置不當(dāng)造成污染等。
[0033]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研宄和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為本發(fā)明所述的水泥墩的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0036]實(shí)施例1
[0037]—種玉郎傘的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，包括:
[0038]步驟(I)、制作玉郎傘外植