一種堅強芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物農(nóng)藥與微生物肥料領(lǐng)域，具體設(shè)及一種含芽抱萌發(fā)劑的堅強芽抱 桿菌可濕性粉劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國每年使用大量的化學(xué)農(nóng)藥制劑與化肥，極易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)，生物富集，不 僅污染生態(tài)環(huán)境，還影響人類的健康。而生物農(nóng)藥副作用小，對人無害，是一種具有廣闊前 景的綠色農(nóng)藥，日益成為全球農(nóng)藥發(fā)展的一種趨勢。
[0003] 芽胞桿菌是目前生物農(nóng)藥中研究最多的一種微生物，它具有廣譜抗菌活性和極強 的抗逆能力，其營養(yǎng)細胞能在真菌性病原菌絲體表面繁衍定殖，有效抑制病菌生長，因此， 在控制病害發(fā)生、促進植株生長，提高作物產(chǎn)量等方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 堅強芽抱桿菌（Bacillus firmus)是1933年化edemannn AWerner首次發(fā)現(xiàn)并命名 的，堅強芽抱桿菌是一種營腐生生活的革蘭氏陽性細菌，在±壤、水體、植物表面和其它自 然環(huán)境中廣泛存在，易于獲取，內(nèi)生芽抱，抗逆能力強，繁殖速度快、營養(yǎng)要求簡單、對農(nóng)作 物和環(huán)境安全，可W產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，對許多真菌W及線蟲均有較強的抑制作用。
[0005] 目前國內(nèi)，外關(guān)于堅強芽抱桿菌作為生防菌的報道不少。Bayer化opscience利用 堅強芽抱桿菌1-1582作為生物農(nóng)藥已先后在美國和歐盟登記，登記名為PONCHO/VOTiVO,用 于防治玉米，大豆害蟲和植物線蟲，可直接殺死線蟲細胞，具有極好的防治效果。國內(nèi)朱天 輝教授利用綠粘靑霉與堅強芽抱桿菌，預(yù)先接種生防菌協(xié)同控制赤枯病取得一定效果，鹿 秀云利用堅強芽抱桿菌XJT-7防治黃瓜白粉病，防治效果達到79%;劉幸紅等利用堅強芽抱 桿菌對核桃炭痘病進行防治，其防效可達到85%W上。目前，國內(nèi)已有關(guān)生產(chǎn)堅強芽抱桿菌 類產(chǎn)品的相關(guān)技術(shù)，如:廖先清等在專利號：2014104369551中公開了一種堅強芽抱桿菌活 菌制劑的制備工藝;牛贍光等在專利號2009102564652中公開了一株堅強芽抱桿菌及其在 核桃炭痘病，黃瓜灰霉病，玉米小斑病，棉花枯萎病等多種植物病害上的防治上的應(yīng)用。
[0006] 雖然W芽抱桿菌為主制備的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品不少，但總體說來，還存在包括研究 開發(fā)與生產(chǎn)脫節(jié)，制劑化困難，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差、生產(chǎn)工藝落后，產(chǎn)品一致性不高，生產(chǎn)企 業(yè)規(guī)模小，應(yīng)用推廣難度大的問題，除些之外，目前芽抱桿菌W可濕性粉劑為主，運種劑型 雖然便于儲存和運輸，但在生產(chǎn)應(yīng)用中存在很多制約因子。如施用的可濕性粉劑中大部份 W芽抱作為衡量產(chǎn)品中有效成分的惟一標(biāo)準(zhǔn)，若芽抱不能及時萌發(fā)，施用效果則不佳，如王 倩利用枯草芽抱桿菌TR21防治己西蕉枯萎病時，前期試驗利用TR21菌株NB發(fā)酵液灌根和葉 蔽接種都能有效防治枯萎病，但是利用芽抱制備可濕性粉劑的灌根與葉蔽效果卻不理想， 顯示了去掉發(fā)酵液后的純芽抱可能因為萌發(fā)困難而使防效下降。但還未有具體的有關(guān)堅強 芽抱桿菌的可濕性粉劑的制備方法公開。也未有在可濕性粉劑中加入芽抱萌發(fā)劑的研究的 報道。
[0007] 另外，由于不同的芽抱桿菌與濕潤劑，分散劑等助劑的相容性，載體對各類芽抱桿 菌吸附性各不相同，將現(xiàn)有的芽抱桿菌可濕性粉劑的配方或制備工藝無法直接用于制備含 芽抱萌發(fā)劑的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑;可濕性粉劑中有效菌的吸附量，存活率，對有害菌 的防治效果及可濕性粉劑量的穩(wěn)定性差異較大，其整個可濕性粉劑的制備方法必須全盤考 慮各載體吸附能力，對堅強芽抱桿菌的干燥過程中保護作用，濕潤劑，分散劑對可濕性粉劑 的懸浮率，濕潤時間的影響，并且對芽抱萌發(fā)劑進行全面的篩選才能夠得到濕潤時間短，懸 浮率高，芽抱保存時間久，使用后芽抱能快速萌發(fā)的，防效好的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種加入芽抱萌 發(fā)劑的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑及其制備方法，其制備的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑芽抱含 量為不低于100億CFU/克，懸浮率不低于80%，潤濕時間不高于70S，細度粉碎過400目篩，水 份含量不高于5%，制備方法穩(wěn)定，施入大田后芽抱萌發(fā)速度與萌發(fā)率遠遠超過普通可濕性 粉劑。
[0009] 為了達到上述目的，一種堅強芽抱桿菌可濕性粉劑由下列重量分組成：堅強芽抱 桿菌發(fā)酵液40-70份;填料：白炭黑20-30份;潤濕劑= Morwet EFW 1-4份;分散劑= Morwet D-425 0.2-1份;芽抱萌發(fā)劑:果糖0.2-1份，鄉(xiāng)氨酸0.1-0.5份，賴氨酸0.2-1份;紫外保護劑： 卵憐脂1-2份，簇甲基纖維素0.2-1份;干燥保護劑:麥芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，我們采用的一種堅強芽抱桿菌可濕性粉劑的其制備方法，由 W下幾步驟組成： 一、 堅強芽抱桿菌發(fā)酵液的制備 取出菌種保藏管，用LB固體培養(yǎng)基劃平板進行復(fù)蘇，37°C培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單 個菌落接種至50毫升LB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中37°C震蕩培養(yǎng)24小時。種子采用5%的接種量， 接種至化大S角瓶中的芽抱桿菌液體培養(yǎng)基，裝液量為化，37°C震蕩培養(yǎng)16-28小時，檢測 其菌液濃度，菌液含量超過60億/毫升，即可作為堅強芽抱桿菌種子液。將堅強芽抱桿菌種 子液接種至1000 L的發(fā)酵罐中，裝液量為60化的發(fā)酵培養(yǎng)基，通氣量為前16小時為每分鐘液 氣比為1:0.6，其后通氣量為1:1;開攬拌，轉(zhuǎn)速為16化/min，培養(yǎng)溫度前24小時為37°C，其 后，每4小時將溫度提高1°C，培養(yǎng)28-36小時，檢測其芽抱含量超過100億CFU/ml，即可結(jié)束 發(fā)酵，作為堅強芽抱桿菌發(fā)酵液； 其中，所述LB培養(yǎng)基：蛋白腺5g，牛肉膏3g，氯化鋼5g，水1000 mL，pH7.2，固體培養(yǎng)基中 加入瓊脂2%。其中，所述芽抱桿菌液體培養(yǎng)基:葡萄糖lOg/L，可溶性淀粉8 g/L，豆巧粉15 g/L，魚粉5 g/L，硫酸儀0.5 g/L，硫酸儘0.5 g/L，憐酸二氨鐘0.5 g/L，憐酸氨二鐘0.5 g/ 1，抑7.2; 其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖lOg/L，玉米粉20 g/L，豆巧粉75 g/L，魚粉5 g/L，硫 酸儀0.5 g/L，硫酸儘0.5 g/L，憐酸二氨鐘0.5 g/L，憐酸氨二鐘0.5 g/L，pH7.2; 各培養(yǎng)基滅菌的條件為:0.10-0.15MPa，121°C滅菌30分鐘； 二、 將堅強芽抱桿菌發(fā)酵液40-70份;填料：白炭黑20-30份;紫外保護劑:卵憐脂1-2份， 簇甲基纖維素0.2-1份;干燥保護劑:麥芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份，混勻后噴霧干燥，得到 堅強芽抱桿菌粉劑； S、將潤濕劑:Morwet EFW 1-4份；分散劑:Morwet D-425 0.2-1份；芽抱萌發(fā)劑：果糖 0.2-1份，鄉(xiāng)氨酸0.1-0.5份，賴氨酸0.2-1份混勻得到堅強芽抱桿菌的助劑； 四、將步驟二與步驟=所得到的堅強芽抱桿菌粉劑與助劑混勻并過通過氣流粉碎機粉 碎過400目篩，檢測其芽抱含量不低于100億cfu/g，懸浮率不低于80%，潤濕時間不高于70s， 水份含量不高于5%，真空包裝，即可得到堅強芽抱桿菌可濕性粉劑。
[0011] 其中，所述的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑的最佳重量份組成為:堅強芽抱桿菌發(fā)酵 液60份;填料：白炭黑25份;潤濕劑:Morwet EFW 3份;分散劑:Morwet D-425 0.8份;芽抱萌 發(fā)劑:果糖0.6份，鄉(xiāng)氨酸0.3份，賴氨酸0.6份;紫外保護劑:卵憐脂1.2份，簇甲基纖維素0.6 份;干燥保護劑:麥芽糖3份，甘露醇0.8份。
[0012] 自然界中芽抱萌發(fā)受外源營養(yǎng)物質(zhì)的影響，運類營養(yǎng)物質(zhì)被稱之為"萌發(fā)劑"，通 常情況下，芽抱和促進萌發(fā)的芽抱萌發(fā)劑混合后數(shù)秒鐘之內(nèi)，萌發(fā)劑快速跨過芽抱衣和皮 層到達芽抱內(nèi)膜的表面，與位于芽抱內(nèi)膜上的受體蛋白相互作用，激發(fā)