一種誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域，具體地說涉及西洋參不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 西洋參（Panax quinquefolium)系五加科人參屬多年生草本植物，生長于北美原 始森林中的古老植物，具有"活化石"之稱，是一種名貴藥材，藥用和經(jīng)濟(jì)價值高。我國自20 世紀(jì)80年代大面積引種西洋參成功以來，已發(fā)展成為繼美國、加拿大后世界第三大西洋參 生產(chǎn)國和世界第一大消費(fèi)國。西洋參味苦，性涼，入心、肺、腎經(jīng)，以補(bǔ)益為主，可滋陰降火、 益氣生津。服用方法分為煮、燉、蒸食、切片含化、研成細(xì)粉沖服等。西洋參中含有皂甙、多 糖、黃酮類、揮發(fā)油、微量元素等豐富的生理活性物質(zhì)，對人體具有補(bǔ)益作用，在免疫調(diào)節(jié)、 抗癌、抗衰老等方面有獨(dú)特效果，因此常用于保健品或"補(bǔ)品"而受到青睞。
[0003] 無論野生或人工栽培的西洋參，因自身生理特性，生長緩慢，大多在4至6年才能 收獲入藥（主要藥效成分是"西洋參皂甙")，且西洋參種子資源稀少，價格昂貴。因此，開展 西洋參細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，工廠化方法生產(chǎn)人參皂甙，具有十分巨大的意義和市場前景。西洋參 細(xì)胞培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的西洋參器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、 種子等）、組織、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體等外植體，在人工控制的培養(yǎng)基上，給予適宜的環(huán)境條 件，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽，或長成完整的植株。本發(fā)明主要側(cè)重于誘導(dǎo)西洋參不同外 植體（葉片、莖段、主根、須根、種胚），獲得疏松、活躍的愈傷組織，為西洋參細(xì)胞培養(yǎng)、實現(xiàn) 工廠化生產(chǎn)生理活性物質(zhì)一一皂甙提供前期材料準(zhǔn)備和理論依據(jù)，對實際應(yīng)用具有指導(dǎo)意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法，包含原料消毒步驟和愈傷組織誘導(dǎo) 培養(yǎng)步驟，其中消毒是用0. 1-0. 3%取(：12與75%酒精組合進(jìn)行消毒，其中愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)是將消毒后的原料接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0005] 西洋參不同外植體的消毒條件與消毒效果有直接關(guān)系，控制0. 1%取(：12與75% 酒精處理的消毒時間。本方法中通過控制不同外植體的不同的消毒時間，確保外植體的存 活率及降低污染率，為愈傷組織的誘導(dǎo)提供條件。
[0006] 在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，其中所述的原料為葉片、莖、主根、須根、種 胚。
[0007] 本發(fā)明中原料獲得與選擇：（1)在西洋參種植地取2年生西洋參完整植株，保持材 料的低溫、新鮮帶回實驗室，部分植株立即進(jìn)行預(yù)處理，另一部分植株移植在花盆中，置于 樹蔭下，保持濕潤和新鮮，使其正常生長，作為外植體采集源；（2)取經(jīng)過后熟處理，并且已 經(jīng)"開口的西洋參種子"，取回實驗室，5°C冷藏。使用時除去種皮，取出飽滿籽粒，用清水反 復(fù)清洗，并將部分種子接種于帶有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中，每皿20- 30顆，恒溫（23- 28°C ) 條件下暗箱培養(yǎng)，以獲得"新鮮、無菌西洋參苗"，另一部分種子經(jīng)升汞、酒精消毒后清水沖 洗，接種于MS培養(yǎng)基，以獲得"無菌苗"。
[0008] 在本發(fā)明另一個【具體實施方式】中，所述的誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法，其 中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+2. 5-3. 5mg/L2, 4-D+0. 5-0. 8mg/L 6-BA 或者 MS+2. 0-3. Omg/L 2, 4-D+6. 0-9. Omg/L GA3或者 MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+3. 0-4. 5mg/LGA3。
[0009] 在本發(fā)明另一個【具體實施方式】中，所述的誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法，其中，對于 葉片、莖段、主根、須根，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2. 5-3. 5mg/L2, 4-D+0. 5-0. 8mg/L6-BA;對于種 胚，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2. 0-3.Omg/L2, 4-D+6. 0-9.Omg/LGA3;對于西洋參無菌苗培養(yǎng)為， MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+3. 0-4. 5mg/LGA3;其中，西洋參無菌苗為西洋參種仁經(jīng)升汞、酒精消 毒后接種于MS培養(yǎng)基，獲得的無菌苗。
[0010] 本發(fā)明培養(yǎng)基激素水平的確定：通過L16(45)正交試驗確定2, 4-D、KT、6-BA、NAA、 IBA五種常用激素對西洋參不同外植體（葉片、莖段、主根、須根）誘導(dǎo)愈傷組織的影響，通 過控制2, 4-D與GA3濃度，確定西洋參種胚所需的誘導(dǎo)激素配方。
[0011] 在本發(fā)明另一個【具體實施方式】中，所述的誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法， 其中消毒條件為，根：75 %酒精10s-15s+30min 0? 1-0. 3 % HgCl2;葉片：75 %酒精 8s-12s+15min0. 1-0. 3% HgCl2;莖段：75% 酒精 10s-15s+25min 0? 1-0. 3% HgCl 2;種坯： 75%酒精 15s-20s+30min 0? 1-0. 3% HgCl2。
[0012] 在本發(fā)明另一個【具體實施方式】中，所述的誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法，還包括原 料預(yù)處理步驟，選取完整植株及種胚，清水沖洗，并用0. 1-0. 3 %的洗衣粉溶液漂洗，再流 水沖洗l-3h，移至無菌室，備用消毒。
[0013] 在本發(fā)明另一個【具體實施方式】中，所述的誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法，還包括消 毒后，原料切分步驟，其中葉片沿葉脈剪成I.OcmXI.Ocm左右的塊狀片段；莖段材料，選擇 粗壯部分，用剪刀等器具剪除去與消毒液直接接觸的部位，然后剪成I.Ocm左右的片段；主 根材料，切成薄片，厚度在〇.1-〇.2mm;種子材料，經(jīng)預(yù)處理開口的種子可直接接種。
[0014] 在本發(fā)明另一個【具體實施方式】中，所述的誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方法，培養(yǎng)溫度 為23-28± I°C，pH=4. 6-6. 5(滅菌前），暗培養(yǎng)。本發(fā)明中，實驗采用500mL三角瓶，每瓶 接種8-12個段片材料，每種外植體接種5-10瓶。
[0015] 綜上，本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn)：一種誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的方 法。步驟如下：
[0016] 原料選擇一預(yù)處理一消毒一接種一培養(yǎng)。
[0017] 本發(fā)明還涉及一種用于誘導(dǎo)西洋參愈傷組織的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于含有 MS+2. 5-3. 5mg/L 2, 4-D+0. 5-0. 8mg/L 6-BA 或者 MS+2. 0-3. Omg/L 2, 4-D+6. 0-9. Omg/L GA3 或者 MS+2. 0-3. 0mg/L 2, 4-D+3. 0-4. 5mg/L GA3。
[0018] 優(yōu)選地，對于葉片、莖段、主根、須根，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2. 5-3. 5mg/ L2, 4-D+O. 5-0. 8mg/L6-BA;對于種胚，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+6. 0-9. 0mg/L GA3;對于西洋參無菌苗培養(yǎng)為，MS+2. 0-3. 0mg/L2, 4-D+3. 0-4. 5mg/LGA3;其中，西洋參無菌 苗為西洋參種仁經(jīng)升汞、酒精消毒后接種于MS培養(yǎng)基，獲得的無菌苗。
[0019] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0020] 1、本發(fā)明采用并且比較不同原材料的西洋參采集源：新鮮完整3年生植株、新鮮 剛剛出苗1個月的西洋參苗、無菌苗（幼苗）。目的是：有利于西洋參細(xì)胞培養(yǎng)和后續(xù)工作 的開展；
[0021] 2、系統(tǒng)研宄了西洋參不同外植體的消毒條件，避免因消毒不徹底引發(fā)的污染及消 毒劑對外植體的過度損害；
[0022] 3、通過L16(45)正交試驗確定了五種常用激素對西洋參不同外植體愈傷組織誘導(dǎo) 的影響，有利于西洋參細(xì)胞培養(yǎng)中的外源激素選擇；
[0023] 4、在種胚的處理過程中出現(xiàn)了兩種情況（無菌苗、愈傷組織），種胚直接誘導(dǎo)的愈 傷長勢好、