專利名稱：用棒狀細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種用其中mqo基因被擴(kuò)增的棒狀細(xì)菌(Coryneformbacteria)經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的方法。
L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸用于動物飼料，人的內(nèi)服藥及制藥工業(yè)。
已知那些氨基酸由棒狀細(xì)菌，尤其是谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵菌株生產(chǎn)。由于其非常之重要性，持續(xù)進(jìn)行一些研究工作以改進(jìn)生產(chǎn)方法。改進(jìn)的方法可涉及與發(fā)酵過程相關(guān)的措施，如攪拌及氧補(bǔ)給，或營養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期糖的濃度，或如經(jīng)離子交換層析加工產(chǎn)物形式，或微生物自身的內(nèi)在性質(zhì)。
為改進(jìn)那些微生物的性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇方法。在此方式中，獲得對抗代謝物如賴氨酸同源物S-[2-氨乙基]-半胱氨酸有抗性的菌株，或在調(diào)節(jié)方面重要氨基酸的營養(yǎng)缺陷體，并產(chǎn)生L-氨基酸。
幾年來，通過擴(kuò)增氨基酸生物合成的各個基因，并研究對L-氨基酸生產(chǎn)的影響，重組DNA技術(shù)已被用于改進(jìn)谷氨酸棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)菌株。此方面的文章見于Kinoshita(“Glutamic AcidBacteria”，in Biology of Industrial Microorganisms，Demain andSolomon(eds。)，Benjamin Cummings，London，UK，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(Amino Acids 6，261-272(1994)，Jetten and Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology 15，73-103(1995)和Sahm et al.(Annuals of the New York Academy ofScience 782，25-39(1996)。
本發(fā)明之目的是尋求適當(dāng)新措施，以通過發(fā)酵改進(jìn)L-氨基酸尤其是L-賴氨酸的生產(chǎn)。
L-氨基酸尤其L-賴氨酸用于動物的飼料，人內(nèi)服藥及制藥工業(yè)。因而，尋求適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)方法生產(chǎn)那些化合物令人矚目。
應(yīng)了解后文提及的任何L-賴氨酸或賴氨酸不只意味著堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供一種用棒狀細(xì)菌通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的方法，特別是所述棒狀細(xì)菌已能生產(chǎn)所需氨基酸，且其中編碼蘋果酸醌氧化還原酶的核酸序列被擴(kuò)增，特別是被過量表達(dá)。
優(yōu)選的實(shí)施方案見于權(quán)利要求書。
在此，術(shù)語“擴(kuò)增”指通過應(yīng)用強(qiáng)啟動子或應(yīng)用編碼具有高活性的相應(yīng)酶的基因或任選的這些措施的結(jié)合增加基因的拷貝數(shù)，從而增加微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的細(xì)胞內(nèi)活性。
本發(fā)明提供的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素中，或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-賴氨酸。它們是棒狀細(xì)菌特別是棒桿菌屬的代表。在棒桿菌屬中，特別提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌屬尤其谷氨酸棒桿菌的菌株是下列的已知野生型菌株谷氨酸棒桿菌 ATTC13032醋谷氨酸棒桿菌ATTC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌 ATTC13870Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌 ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020及產(chǎn)生L-氨基酸特別是產(chǎn)生L-賴氨酸的突變株以及由其產(chǎn)生的菌株如谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709
黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌 FERM-P1712黃色短桿菌FERM 6463及黃色短桿菌FERM-P6464。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)棒狀細(xì)菌菌在蘋果酸醌氧化還原酶的過量表達(dá)后，以一種改進(jìn)方式生產(chǎn)L-氨基酸特別是L-賴氨酸。mqo基因編碼蘋果酸醌氧化還原酶(EC 1.1.99.16)，該酶通過將電子轉(zhuǎn)移至泛醌-1，催化蘋果酸為草酰乙酸(Molenaar et al.，European Journal ofBiochemistry 254，395-403(1998))。谷氨酸棒桿菌mqo基因的核苷酸序列已被Molenaar等測定(European Journal of Biochemistry 254，395-403(1998))，且通?？稍趪⑸锛夹g(shù)信息中心(NCBI，Behesda，MD，USA)的數(shù)據(jù)庫中獲得，登記號AJ 22 4946。
根據(jù)本發(fā)明，可使用Molenaar等(European Journal of biochemistry254，395-403(1998))所述的谷氨酸棒桿菌的mqo基因。也可使用得自遺傳密碼的簡并或經(jīng)功能一中性有義突變產(chǎn)生的mqo基因的等位基因。
為達(dá)到過量表達(dá)，可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或使位于結(jié)構(gòu)基因前的啟動子及調(diào)節(jié)區(qū)突變。插入結(jié)構(gòu)基因前的表達(dá)盒具有相同作用。利用可誘導(dǎo)啟動子還可在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸過程中增加表達(dá)。表達(dá)也可通過延長m-RNA的壽命的措施加以改進(jìn)。酶的活性也可通過防止酶蛋白的降解而提高?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或在染色體中整合及擴(kuò)增?；蛘撸虻倪^量表達(dá)也可通過改變培養(yǎng)基組分而達(dá)到，在此方式中要進(jìn)行培養(yǎng)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將在下列文獻(xiàn)中得到指導(dǎo)Martin等(Bio/Technology 5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya及Mirinaga(Bio/Technology 6，428-430(1998))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EP-B 0 472869，美國專利4,601,893，Schwarzer及Puhler(Bio/Technology 9，84-87(1991))，Reinscheid等(Applied and Environmental Microbiology 60，126-132(1994))，LaBarre等(Journal of Bacteriology 175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbers等(基因134，15-24(1993))，Jensen及Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))，Makrides(Microbiological Reviews 60512-538(1996))以及已知遺傳及分子生物學(xué)的教科書。
輔助蘋果酸醌氧化還原酶過量表達(dá)的質(zhì)粒例如pRM17(Molenaar等，1998，歐洲生物化學(xué)雜志254，395-403)。質(zhì)粒pRM17基于穿梭載體pJC1，其見于Cremer等所述(Molecular and GeneralGenetics 220，478-480)。
另外，對于L-氨基酸的生產(chǎn)可能有利的是過量表達(dá)相應(yīng)生物合成途徑的一或多種酶以及蘋果酸醌氧化還原酶。因此如在L-賴氨酸的生產(chǎn)中，編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因可同時被過量表達(dá)(EP-B0 197 335)，或·介導(dǎo)S-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段同時被擴(kuò)增(EP-A 0 088 166)。
對于L-氨基酸的生產(chǎn)也可能有利的是除了蘋果酸醌氧化還原酶的過量表達(dá)之外，阻止非所需二級反應(yīng)(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的培育”，微生物產(chǎn)物的過量表達(dá)，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可在分批工藝中或補(bǔ)料分批或重復(fù)補(bǔ)料分批方法中連續(xù)或非連續(xù)培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸。熟知的培養(yǎng)法的綜述見于Chemiel的教科書(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)，或Storhas的教科書(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/-Wiesbaden，1994))。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式滿足所研究菌株的要求。各種微生物的培養(yǎng)基的闡述包含于美國細(xì)菌學(xué)會的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊”(Washington D.C.，USA，1981)內(nèi)。用作碳源的糖及碳水化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉及纖維素，油及脂肪如大豆油，葵花籽油，花生油，及椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸及亞油酸，醇如甘油及乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或以混合物形式應(yīng)用。用作氮源的有機(jī)含氮化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米漿，大豆粉及尿素，或無機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨及硝酸銨。氮源可單獨(dú)或以混合物方式應(yīng)用。用作磷源的如磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基還必須含有金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵，它們是生長所必須的。最后，除了上述物質(zhì)外還可應(yīng)用生長必需氨基酸及維生素。另外，在培養(yǎng)基中可加入適當(dāng)?shù)念A(yù)時期。所述物質(zhì)可以單批形式加入培養(yǎng)基中，或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式補(bǔ)料。
為調(diào)節(jié)培養(yǎng)pH值，可以適當(dāng)方式應(yīng)用堿性化合物如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨，或酸性化合物如磷酸或硫酸。消泡劑，如脂肪酸聚乙二醇酯，可以用來控制起泡。合適的選擇性作用物質(zhì)，如抗生素，可以添加至培養(yǎng)基中，以保持質(zhì)粒穩(wěn)定性。氧氣或含氧的氣體混合物，如空氣，引入培養(yǎng)基，以保持需氧條件。培養(yǎng)溫度通常從20℃至45℃，優(yōu)選地為25℃至40℃。培養(yǎng)繼續(xù)至形成最大量的所需L-氨基酸。這一目標(biāo)通常在10小時至160小時之內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
如Spackman等所述(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)，通過離子交換層析隨后進(jìn)行茚三酮衍生化，進(jìn)行L-氨基酸分析。
谷氨酸棒桿菌菌株DM22/pRM17已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國)，保藏號為DSM12711。
本發(fā)明的方法通過應(yīng)用棒狀細(xì)菌用于發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-高絲氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸及L-蛋氨酸，尤其是L-賴氨酸的生產(chǎn)。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例得以更詳細(xì)闡述。
為此，應(yīng)用生產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715(EP-B-0435132)進(jìn)行實(shí)驗，其中權(quán)利要求的方法的優(yōu)點(diǎn)將更清晰。
實(shí)施例1含有擴(kuò)增的蘋果酸醌氧化還原酶的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的產(chǎn)生將菌株DSM5715用質(zhì)粒pRM17(Molenaar等，1998，歐洲生物化學(xué)雜志254(395-403))，如Liebl等所述(FEMS MicrobiologyLetters 65，299-304(1989))進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在已加入25mg/ml卡那霉素的LBHIS瓊脂上進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的選擇。LBHIS瓊脂是由在LB培養(yǎng)基(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗手冊(1989)，冷泉港實(shí)驗室)中加入37g/l來自Merck(Darmstadt，德國)的腦心肉湯，0.5M山梨醇及15g/l瓊脂組成的。以此方式形成菌株DSM5715/pRM17。以相同方式產(chǎn)生菌株DSM5715/pJC1。
實(shí)施例2L-賴氨酸的生產(chǎn)首先將菌株DSM5715/pRM17及DSM5715/pJC1在已加入卡那霉素(25mg/ml)的腦心瓊脂上在33℃溫育24小時。為在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，應(yīng)用已另加入卡那霉素(25mg/ml)的CgIII培養(yǎng)基(Kase& Nakayama，Agricultural and Biology Chemistry 36(9)1611-1621(1972))。將包含在具有4個緩沖板的100ml Erlenmeyer燒瓶中的10ml培養(yǎng)基用菌株的接種物接種，并將培養(yǎng)物在240rpm，30℃溫育16小時，隨后此培養(yǎng)物用于進(jìn)一步預(yù)培養(yǎng)。
用于生產(chǎn)或試驗的培養(yǎng)基是已另加入卡那霉素(25mg/ml)的MM培養(yǎng)基。
在用菌株DSM5715的方法中，相應(yīng)的培養(yǎng)基不含卡那霉素。
MM培養(yǎng)基的組成及制備如下玉米漿(CSL)5g/L3-嗎啉代丙磺酸(MOPS) 20g/L
葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌的) 50g/L鹽(NH4)2SO425g/LKH2PO40.1g/LMgSO4·7H2O 1.0g/LCaCl2·2H2O 10mg/LFeSO4·7H2O 10mg/LMnSO4·H2O 5.0mg/L生物素0.3mg/l(經(jīng)過濾滅菌)鹽酸維生素B10.2mg/L(經(jīng)過濾滅菌)CaCO325g/L亮氨酸0.1g/L用氨水將CSL，MOPS及鹽溶液調(diào)節(jié)至pH為7并高壓滅菌，然后加入滅菌基質(zhì)及維生素溶液及干燥高壓滅菌的CaCO3。
在已裝入10mL上述生產(chǎn)培養(yǎng)基的具有緩沖板的100mlErlenmeyen燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。用預(yù)培養(yǎng)物如此接種此培養(yǎng)基，以使起始光密度為0.1。在33℃及80％相對濕度進(jìn)行培養(yǎng)。
在溫育72小時后，測定培養(yǎng)物懸浮液的光密度及已生成的L-賴氨酸的濃度。用Dr.Lange的LP2W光度計(Berlin，Germany)在660nm測定波長測定光密度。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)氨基酸分析儀通過離子交換層析及與茚三酮檢測的柱后反應(yīng)測定L-賴氨酸，試驗結(jié)果示于表1表1
<p>實(shí)施例3含有擴(kuò)增的蘋果酸醌氧化還原酶的蘇氨酸生產(chǎn)菌的產(chǎn)生將質(zhì)粒pRM17(Molenaar等，1998，歐洲生物化學(xué)雜志254(395-403))用如Tauch等所述的電穿孔方法(FEMS MicrobiologyLetters 123343-347(1994))電穿孔入谷氨酸棒桿菌菌株DSM5399。菌株DSM5399為蘇氨酸生產(chǎn)菌，其描述于EP-B-0358940。將電穿孔沉積物涂布在已加入25mg/ml卡那霉素的LB瓊脂上進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的選擇(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。以此方式形成菌株DSM5399/pRM17。
實(shí)施例4蘇氨酸的生產(chǎn)將實(shí)施例3中得到的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5399/pRM17在適于生產(chǎn)蘇氨酸的類似培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并隨后測定蘇氨酸含量。
首先將菌株在已加入相應(yīng)的抗生素的瓊脂平板(含卡那霉素(25mg/ml)的腦心瓊脂)上在33℃溫育24小時。以瓊脂板培養(yǎng)物為預(yù)培養(yǎng)接種物起始接種(100ml Erlenmeyer燒瓶中的10ml培養(yǎng)基)。所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為CgIII培養(yǎng)基(Kase &amp; Nakayama，Agriculturaland Biology Chemistry 36(9)1611-1621(1972))，其中已另加入卡那霉素(25mg/ml)。將預(yù)培養(yǎng)物在搖床上于240rpm，33℃溫育24小時，隨后此預(yù)培養(yǎng)物用作主培養(yǎng)接種物接種培養(yǎng)基，以使主培養(yǎng)物起始光密度(660nm)為0.1。主培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MM-蘇氨酸培養(yǎng)基。
MM-蘇氨酸培養(yǎng)基玉米漿(CSL) 5g/L3-嗎啉代丙磺酸(MOPS) 20g/L葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌的)50g/L鹽(NH4)2SO425g/L
KH2PO40.1g/LMgSO4·7H2O 1.0g/LCaCl2·2H2O 10mg/LFeSO4·7H2O 10mg/LMnSO4·H2O 5.0mg/L生物素(經(jīng)過濾滅菌)0.3mg/l鹽酸維生素B1(經(jīng)過濾滅菌) 0.2mg/LCaCO325g/L用氨水將CSL，MOPS及鹽溶液調(diào)節(jié)至pH為7并高壓滅菌，然后加入滅菌基質(zhì)及維生素溶液及干燥高壓滅菌的CaCO3。
在已裝入10mL上述培養(yǎng)基的具有緩沖板的100ml Erlenmeyen燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。加入卡那霉素(25mg/L)。在33℃及80％相對濕度進(jìn)行培養(yǎng)。
在溫育48小時后，用Biomek 1000(Beckman Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長測定光密度。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)氨基酸分析儀通過離子交換層析及與茚三酮檢測的柱后反應(yīng)測定蘇氨酸濃度。
試驗結(jié)果示于表2。
表權(quán)利要求
1.通過棒狀細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中使用編碼蘋果酸醌氧化還原酶的核苷酸序列被擴(kuò)增、尤其是被過量表達(dá)的細(xì)菌。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所用細(xì)菌中所需L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因也被擴(kuò)增。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所用細(xì)菌中至少一些降低所需L-氨基酸形成的代謝途徑被除去。
4.根據(jù)前述一或多項權(quán)利要求的方法，其中使用了經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且質(zhì)粒載體攜帶編碼蘋果酸醌氧化還原酶的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中使用的是經(jīng)質(zhì)粒載體pRM17轉(zhuǎn)化的菌株，所說的質(zhì)粒載體以在谷氨酸棒桿菌中的形式保藏，保藏號為DSM12711。
6.如前述一或多項權(quán)利要求的方法，其中使用生產(chǎn)L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-高絲氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸或L-蛋氨酸的棒狀細(xì)菌。
7.如權(quán)利要求1-5的一或多項權(quán)利要求的方法，其中使用生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因同時被過量表達(dá)。
9.如權(quán)利要求7的方法，其中介導(dǎo)S-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段同時被擴(kuò)增。
10.如前述一或多項權(quán)利要求所述的通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵生產(chǎn)所需L-氨基酸的細(xì)菌，所說的細(xì)菌中至少蘋果酸醌氧化還原酶基因被擴(kuò)增，b)在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌細(xì)胞中積累L-氨基酸，和c)分離所產(chǎn)生的L-氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用棒狀細(xì)菌通過發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法,其中所述細(xì)菌中mqo基因被擴(kuò)增。
文檔編號C12N9/02GK1267734SQ0010345
公開日2000年9月27日 申請日期2000年3月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月19日
發(fā)明者道韋·莫勒納爾, 米歇爾·愛德華·范德雷斯特, 貝蒂娜·默克爾 申請人:德古薩－于爾斯股份公司