專利名稱：一種用于多人份診斷的基因芯片載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因芯片，尤其涉及一種用于多人份，多疾病診斷的基因芯片載體。
基因芯片是二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的一項前沿生物技術(shù)。將大量的靶基因片段有序地、高密度地(點與點之間的距離一般小于500μm)排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片。基因芯片從制作上可分為兩大類原位合成法(DNAchip)和微矩陣法(DNA mircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等發(fā)明，他們將半導(dǎo)體中的光蝕刻技術(shù)運用到DNA合成化學(xué)中，用單核苷酸或其它生物大分子為底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循環(huán)都有特定的核苷酸結(jié)合上去，直到設(shè)定的寡核苷酸長度，每個寡核苷酸片段代表了一種特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上。微矩陣法最早由Stanford大學(xué)的P.Brown等發(fā)明，將PCR等方法得到的cDNA用針點或噴點的方法直接排列到玻片等介質(zhì)上，從而制備成芯片。
基因芯片可以用熒光檢測和計算機軟件進行數(shù)據(jù)的比較和分析，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到southern blot雜交技術(shù)，即DNA-DNA之間通過堿基配對機制形成互補鏈。隨后又發(fā)展出northern blot雜交和點雜交技術(shù)。這三種技術(shù)都是將核酸樣品固定在濾膜上，樣品容易擴散，因此在單位面積上點樣的密度受到限制，無法進行大規(guī)模、高通量的DNA雜交。同時，由于濾膜面積較大而需較多探針量，檢測靈敏度較低。為了提高點樣密度和檢測靈敏度，降低探針用量，以玻璃、硅等材料為載體的基因芯片技術(shù)逐步得到了發(fā)展。
美國affymetrix公司于二十世紀(jì)八十年代末至90年代初，率先開展了這方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，該公司運用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics 13,1008-1017.)。同時，探針的熒光標(biāo)記，激光共聚焦掃描(U.S Patent5981965)和計算機分析(U.S Patent 5974164)等技術(shù)也隨之發(fā)展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因芯片(微矩陣)在美國Stanford大學(xué)誕生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，這標(biāo)志著基因芯片技術(shù)步入了廣泛研究和應(yīng)用的時期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等優(yōu)點，適用于DNA序列測定、SNP分析等。但其缺點是合成寡聚核苷酸長度有限，因而基因特異性差，而且隨長度的增加合成錯誤率隨之增高，作為基因表達譜研究遠(yuǎn)不如cDNA芯片。cDNA芯片是將微量cDNA片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列并固化，也叫微矩陣(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science 278,680-686.)。基因點樣密度雖不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用傳統(tǒng)載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點樣密度要高得多，可達到每張載玻片4萬個基因。而cDNA芯片最大的優(yōu)點是靶基因檢測特異性非常好，用作表達譜研究結(jié)果可靠。目前許多國家實驗室和大制藥公司都用此類芯片(Baldwin,D等(1999)Curr Opin Plant Biol2(2):96-103.)。
基因芯片最早是由于高通量、大規(guī)模研究基因功能的需求而產(chǎn)生的，但隨著基因芯片技術(shù)的日漸成熟，人們驚喜地發(fā)現(xiàn)基因芯片在傳染性疾病和遺傳病的診斷上有獨特的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)市場。感染性病原體診斷芯片就是將待測病原體的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經(jīng)擴增標(biāo)記螢光后與芯片進行雜交，雜交信號由掃描儀掃描，再經(jīng)計算機分析，判斷陰陽性。診斷芯片區(qū)別于其他檢測手段的優(yōu)越性在于(1)檢測樣品為各類致病基因片段，提高了檢測效率；(2)因無需機體免疫反應(yīng)，能及早診斷，且待測樣品用量較少；(3)診斷芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
在疾病診斷方面，已有一些單一疾病基因診斷芯片產(chǎn)品上市，例如美國的Affymetrix公司已利用基因芯片進行愛滋病病毒(HIV)的研究工作，并有商業(yè)化的GeneChip HIV PRT診斷芯片上市，用于愛滋病的早期診斷。
但芯片技術(shù)在疾病診斷上的應(yīng)用尚處于起步階段，還未大面積推廣，原因主要有(1)基因芯片技術(shù)是一項全新的技術(shù)，對人才、技術(shù)、資金的要求很高，目前只有一部分的科研機構(gòu)和高科技公司完全掌握了該項技術(shù)；(2)如果一種芯片只能進行單人份檢測，診斷一個被檢者可能存在的一種疾病或幾種疾病，芯片檢測成本較貴，檢測效率不高，未充分發(fā)揮基因芯片可進行高通量、大規(guī)模檢測的優(yōu)勢和特點。因此，目前國內(nèi)外已有多家機構(gòu)致力于研究開發(fā)可用于多人份的基因芯片載體，以真正實現(xiàn)利用基因芯片的技術(shù)特征和優(yōu)勢應(yīng)用于臨床診斷的實際應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種進行多人份診斷的基因芯片載體，在一塊芯片上同時存在多個獨立的反應(yīng)單元，各反應(yīng)單元是一個獨立的診斷單元，包括檢測監(jiān)控系統(tǒng)和疾病診斷系統(tǒng)；每一獨立反應(yīng)單元可進行單人份檢測，反映一個被檢個體的健康狀況，所以，一塊芯片就能夠同時診斷多人份的健康狀況，因此一塊芯片就能進行多疾病、多人份的診斷。
發(fā)明的構(gòu)思是這樣的(1)本發(fā)明的一塊基因芯片上同時具有多個獨立的反應(yīng)單元，每一反應(yīng)單元構(gòu)成一個單人份健康狀況檢測系統(tǒng)，可對一個被檢個體的健康狀況進行檢測，一塊芯片就能同時進行多疾病、多人份的診斷；(2)為形成獨立反應(yīng)單元和避免交叉污染，可在基因芯片載體表面設(shè)計下凹的獨立反應(yīng)單元；本發(fā)明亦是這樣實現(xiàn)的為使診斷芯片符合多疾病、多人份診斷的要求，我們對基因芯片載體進行如下設(shè)計所說的基因芯片載體材料可以為玻璃、塑料以及陶瓷，基因芯片載體表面由兩個部分組成，第一部分為非點樣區(qū)，第二部分為點樣區(qū)。
(1)一塊基因芯片有一到兩個非點樣區(qū)，如果有一個非點樣區(qū)，該點樣區(qū)位于芯片的一側(cè)，寬度為10～25mm如果有兩個非點樣區(qū)，該非點樣區(qū)分別位于芯片的兩側(cè)，寬度為5～10mm。非點樣區(qū)表面經(jīng)磨沙處理，非點樣區(qū)用于芯片檢測時的操作接觸。
(2)芯片其他部分為點樣區(qū)，點樣區(qū)內(nèi)有若干數(shù)量的點樣池，形成獨立的反應(yīng)單元。每個點樣池為長度為1mm～6mm，寬度為1mm～8mm，深度為1mm-3mm，在載體表面形成下凹的正方形和長方形反應(yīng)單元，每個反應(yīng)單元的實際面積大小與所點點數(shù)的多少有關(guān)。反應(yīng)單元在非點樣區(qū)呈均勻分布。每個反應(yīng)單元與載體承載面平行的反應(yīng)表面經(jīng)特殊處理，表面具有與DNA形成共價鍵的氨基、巰基等。表面處理為已有技術(shù)。
(3)每一反應(yīng)單元內(nèi)基因芯片包括兩個部分組成，第一部分為檢測監(jiān)控系統(tǒng)，第二部分為疾病診斷系統(tǒng)。
檢測監(jiān)控系統(tǒng)至少有四個對照元素構(gòu)成，分別為1．點樣液，為陰性對照(1)，若雜交后檢測無信號，表明正常；若有雜交信號，表明點樣液有污染；2．為植物基因a，為陰性對照(2)，若雜交后檢測無信號，表明正常；若有雜交信號表明系統(tǒng)有污染；1或2其中之一出現(xiàn)雜交信號，該芯片不能使用；3．為植物基因b，為陽性對照(1)，該植物基因的RNA在抽提血RNA時按一定的比例加入到待檢的血清樣品中，并隨著實驗流程進行逆轉(zhuǎn)錄。若雜交后該樣品有雜交信號為正常；若無雜交信號，表明RNA抽提過程有問題或逆轉(zhuǎn)錄不正常；4．為植物基因c，為陽性對照(2)，該植物基因DNA在PCR擴增摻入熒光底物時按一定的比例加入到逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物中，以檢測熒光底物的摻入效率。若雜交后該樣品有雜交信號為正常；若無雜交信號，表明標(biāo)記效果不理想。
所說的點樣液為一種包含離子多聚物的緩沖液，可以采用美國Telechem公司生產(chǎn)的、商品名為Micro-Spotting Solution的點樣液；所說的為植物基因a的基因序列如下述的植物基因a Sequence a所示植物基因a Sequence a:
Arabidopsis thaliana(擬南芥)SUPERMAN(sup)geneAATTGCCAACAGGATCATGATTATCTTCTAGGGTTTTCATGGCCACCAAGATCCTACACTTGCAGCTTCTGCAAAAGGGAATTCAGATCGGCTCAAGCACTTGGTGGCCACATGAATGTTCACAGAAGAGACAGAGCAAGACTCAGATTACAACAGTCTCCATCATCATCTTCAACACCTTCTCCTCCTTACCCTAA-CCCTAATTACTCTTACTCAACCATGGCAAACTCTCCTCCTCCTCATCATTCTCCTCTAACCCTATTTCCAACCCTTTCTCCTCCATCCTCACCAAGATATAGGGCAGGTTTGATCCGTTCCTTGAGCCCCAAGTCAAAACATACACCAGAAAACGCTTGTAAGACTAAGAAATCATCTCTTTTAGTGGAGGCTGGAGAGGCTACAAGGTTCACCAGTAAAGATGCTTGCAAGATCCTGAGGAATGATGAAATCATCAGCTTGGAGCTTGAGATTGGTTTGATTAACGAATCAGAGCAAGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAATTAGATGGTAATAACTTTATCCATAAAGGATTCG--AAGTTCACAATTCTAGAAGATATGATGCTTCTCTAAGGTTAATTAGTTTCATCCATATGAAATTCTCTAAGCTTGCTATTTAGTAGAACG該植物基因a可通過對擬南芥SUPERMAN(sup)gene克隆獲得，此為已有技術(shù)。所說的為植物基因b的基因序列如下述的植物基因b Sequence b所示植物基因b Sequence b(陰影部分為其PCR擴增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene AGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGAGCGAGCTCAATGGCTACAGGACCAACCTTATCAAAGAGAGCATCAGAATGGGTTACAATGACATTGGTGANGGCTTCTATGCTCATGGCCACCTTTCAGATGCCTTCAAAAGCTACATCCGTACACGTGATTATTGTACCACTTCCAAGCATATAGTTCAGATGTGTATGAATGTGATTCT 該植物基因b可通過對水稻Usn 5sRNA gene克隆獲得，此為已有技術(shù)。所說的為植物基因c的基因序列如下述的植物基因c Sequence c所示植物基因c Sequence c(陰影部分為其PCR擴增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene ACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATNNCGTCGACCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAGAGTTACTATGCATCACAGTACCAGCTCTAAGCATTTATATTTTAAAAAATAGCTTGGCCTCAAATGTGACAGATCGTTCTGTCAAGTCTCTAGATGCTTAAATATCCAGAGCTGTTTACACAGCATCATATTTAAAACCACA 該植物基因c可通過對水稻Usn 5sRNA gene克隆獲得，此為已有技術(shù)。
每一反應(yīng)單元的疾病診斷系統(tǒng)將若干種病原體的保守區(qū)作為靶基因固定在芯片上，配以相應(yīng)的靶基因擴增引物，并通過DNA雜交、熒光標(biāo)記等芯片診斷技術(shù)，進行臨床疾病的診斷。芯片診斷技術(shù)為已有技術(shù)。以下將通過實施例對本發(fā)明的有關(guān)細(xì)節(jié)作進一步的闡述，但實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍，有關(guān)的技術(shù)人員完全可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和所公開的技術(shù)方案，舉一反三地制備其它類型的多人份、多疾病診斷芯片，這也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。


圖1是本發(fā)明的一個多人份診斷的基因芯片載體的示意圖；圖2是本發(fā)明的另一個多人份診斷的基因芯片載體的示意圖；圖3所示的是本發(fā)明的三種不同反應(yīng)池的放大示意圖。
其中
圖1中，所示1為非點樣部分，2為點樣池；圖2中，所示1和2與
圖1中相同，3為經(jīng)表面經(jīng)磨沙處理過的非點樣區(qū)；圖3是點樣池的三種形狀A(yù)為正方形、B為長方形、C為圓形，其中A還示出了點樣池中的點樣位點排列示意圖。
實施例1將一塊長度為約175mm、寬度為約25mm、厚度為約4mm的芯片專用玻片加工成多人份診斷基因芯片。載玻片由兩個部分組成，第一部分為非點樣區(qū)，第二部分為點樣區(qū)。載玻片有兩個非點樣區(qū)，該非點樣區(qū)分別位于芯片的兩側(cè)，寬度為約10mm。非點樣區(qū)表面經(jīng)磨沙處理，非點樣區(qū)用于芯片檢測時的操作接觸。載玻片的其他部分為點樣區(qū)，點樣區(qū)內(nèi)有12個點樣池，形成獨立的反應(yīng)單元。每個點樣池為長度為約6mm，寬度為約6mm，深度為約2mm，在載體表面形成下凹的長方形反應(yīng)單元。反應(yīng)單元在非點樣區(qū)呈均勻分布。每個反應(yīng)單元與載體承載面平行的反應(yīng)表面經(jīng)特殊處理，表面具有與DNA形成共價鍵的氨基或巰基。表面特殊處理為已有技術(shù)。
每一反應(yīng)單元表面基因芯片包括兩個部分組成，第一部分為檢測監(jiān)控系統(tǒng)，第二部分為疾病診斷系統(tǒng)。檢測監(jiān)控系統(tǒng)和疾病診斷系統(tǒng)的設(shè)立為已有技術(shù)。
權(quán)利要求
1．一種疾病診斷用基因芯片載體，其特征在于點樣區(qū)內(nèi)有多個呈均勻分布的點樣池，其長度為1mm-3mm，寬度為1mm-3mm，深度為1mm-3mm，每個點樣池下凹的載體表面構(gòu)成一個獨立的反應(yīng)單元。
2．如權(quán)利要求1所述的基因芯片載體，其特征在于所說的基因芯片載體由兩個部分組成，第一部分為經(jīng)表面經(jīng)磨沙處理過的非點樣區(qū)，第二部分為點樣區(qū)，而且(1)所述非點樣區(qū)可只位于芯片的一側(cè)或分列于兩側(cè)，其總寬度為10-25mm；(2)所述的點樣區(qū)內(nèi)是多個呈均勻分布的點樣池。
3．如權(quán)利要求1或2所述的基因芯片載體，其特征在于所述基因芯片載體的材料可以是玻璃，塑料或陶瓷。
4．如權(quán)利要求1或2所述的基因芯片載體，其特征在于，每個反應(yīng)單元與載體承載面平行的反應(yīng)表面經(jīng)特殊處理，表面具有與DNA形成共價鍵的氨基或巰基。
5．如權(quán)利要求1或2所述的基因芯片載體，其特征在于，每一反應(yīng)單元表面基因芯片包括兩個部分組成，第一部分為檢測監(jiān)控系統(tǒng)，第二部分為疾病診斷系統(tǒng)。
6．如權(quán)利要求1或2所述的基因芯片載體的用途，其特征在于用于多人份、多疾病診斷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種疾病診斷用基因芯片載體,其特征在于點樣區(qū)內(nèi)有多個呈均勻分布的點樣池,其長度為1mm－3mm,寬度為1mm－3mm,深度為1mm－3mm,每個點樣池下凹的載體表面構(gòu)成一個獨立的反應(yīng)單元。每一反應(yīng)單元構(gòu)成一個單人份健康狀況檢測系統(tǒng),可對一個被檢個體的健康狀況進行檢測,一塊芯片就能同時進行多疾病、多人份的診斷而不會產(chǎn)生交叉污染。
文檔編號C12Q1/68GK1314493SQ0011499
公開日2001年9月26日 申請日期2000年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月20日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 肖自力 申請人:上海博道基因開發(fā)有限公司