專利名稱：Kit信號相關基因qpcr芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種用于KIT信號相關基因檢測的QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用。
背景技術：
人KIT原癌基因起源于HZ4貓肉瘤病毒，位于人染色體4ql2，在4號染色體長臂中心體周圍區(qū)域，是白色斑點顯性基因的等位基因。在小鼠中該基因位于第5號染色體距著絲粒約42cM處。人類KIT基因組DNA全長大約89kb，包括21個外顯子。KIT基因編碼 的蛋白質(zhì)被稱為KIT或c-kit受體，是一個分子量為145kD的I型跨膜性糖蛋白，屬于III型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，分布于細胞膜表面。其結構類似于巨噬細胞集落刺激因子和血小板源生長因子受體，由胞外結構域、單一跨膜區(qū)及胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域三部分組成。胞外區(qū)包含5個免疫球蛋白樣結構域，開始的3個是SCF(干細胞因子)結合區(qū)，第4、5個結構域在穩(wěn)定SCF及誘導KIT受體二聚化方面起重要作用。Broudy等研究發(fā)現(xiàn)第5個結構域還與KIT受體從細胞膜上的溶蛋白性裂解有關。胞內(nèi)部分則包含了由ATP結合區(qū)和磷酸轉(zhuǎn)移酶區(qū)組成的具有酪氨酸激酶活性的結構域。其配體為肥大細胞生長因子、干細胞生長因子、steel因子等，以分泌型和膜結合型兩種方式與KIT受體結合。分泌型可使KIT受體激活、內(nèi)化、降解；膜結合型則能維持KIT受體較長的激活狀態(tài)。KIT受體與配體特異性結合可觸發(fā)其同源二聚化和細胞膜內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化，產(chǎn)生停泊位點，捕獲含SH2結構域的信號分子，還能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、RacUJNK, Raf-I、JAK2等，通過多種信號因子的參與將細胞外的信號轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)部，引發(fā)某些基因的特異性表達。SCF/KIT共同參與多種細胞信號的轉(zhuǎn)導，如Jak/STAT信號途徑、PI3K途徑、Src家族激酶途徑、Ras/Raf/MEK/ERK信號途徑等，是各種底物激酶的酪氨酸磷酸化和絲/蘇氨酸激酶磷酸化的整合步驟，并且存在著多種信號轉(zhuǎn)導途徑之間的交互作用(cross-talking)，從而精確地調(diào)控細胞的增殖和分化。Kit基因突變不僅僅影響黑素細胞的遷徙與分化而導致斑駁病的產(chǎn)生，也會影響原始生殖細胞的發(fā)育而導致不孕不育，以及影響造血細胞生成而導致貧血及肥大細胞缺乏等，嚴重的Kit基因突變還會導致純合致死，同時，Kit基因是一個重要的原癌基因，Kit基因高表達會導致粒細胞白血病、精原細胞瘤及消化系統(tǒng)間質(zhì)腫瘤。SCF/KIT共同參與的多種細胞信號轉(zhuǎn)導與上述病變密切相關，這些疾病病理發(fā)育過程中相關信號過程的變化是近年來kit信號轉(zhuǎn)導研究中的熱點問題。QPCR(Real-Time Quantitative PCR)在基因表達水平、病原體及產(chǎn)前診斷等方面得到廣泛運用。其原理是在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，常用的兩種方法為SYBR Green (熒光染料摻入法)和Taqman probe (探針法)。SYBR Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結合，因此它也能與非特異的dsDNA (如引物二聚體)結合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線(melting curve)分析的軟件加以解決。相關論文最早發(fā)表于1996年，隨后在實驗方法、儀器設備上進行了一系列改善，已經(jīng)在科研和臨床診斷領域得到了越來越廣泛的應用。近年來，對于熒光定量PCR的要求越來越規(guī)范化。從RNA的提取一RNA完整性和純度的鑒定一逆轉(zhuǎn)錄一反應體系的優(yōu)化一最后的數(shù)據(jù)分析都有一套嚴格的標準，從而增加了熒光定量PCR結果的可靠程度，也使實驗的可重復性得到提高。QPCR芯片是在儀器設備更新的基礎上發(fā)展起來的，將近百個或數(shù)百個QPCR反應設計在一塊板子上同時進行擴增，以檢測相關基因的表達豐度。基因芯片是“高通量”現(xiàn)代生物技術的標志，其原理是基于核酸分子雜交，用熒光染料標記樣本DNA或cDNA，與基因芯片雜交，經(jīng)激光共聚焦熒光顯微鏡檢出雜交信號，通過計算機處理、分析，得到所需信息。突出特點在于高通量、微型化和自動化。但它存在三個方面的缺點1、費用高；2、難以檢測低豐度表達的基因；3、偏重高通量(一次檢測上萬個甚至幾萬個基因)，缺少針對如皮膚、海馬組織或某種腫瘤等特定組織類型的表達“芯片”。與基因芯片相比，QPCR芯片的通量顯著減低，一次至多檢測96個或384個基因，基本相當于基因芯片通量的I %，但是QPCR芯片的擴增對象經(jīng)過仔細選擇，是某一組織或病變類型高度相關的基因，更便于數(shù)據(jù)的分析處理，檢測基因還可以隨研究需要加以改動，便于操作，而且價格低廉?；蛐酒蚎PCR芯片的原理不同，但對于基因表達譜而言，他們的檢測對象(mRNA或cDNA)到實驗結果(表達豐度)，QPCR芯片與基因芯片都高度一致，許多研究者都把這兩種方法作為互相印證的手段，而對于幾十個甚至幾百個基因的表達豐度檢測，QPCR技術完全可以取代基因芯片。計算機預測是將基因表達水平的數(shù)據(jù)與分子信號過程進行聯(lián)系的關鍵步驟，廣泛運用的軟件是PathwayStudio。根據(jù)基因表達量的變化，計算機結合已知信號通路的信息，將“宏觀表型”與分子信號過程結合。由于這一軟件預測的基礎是已知信號過程，并不能預測新的未知信號過程，所以對基因芯片的海量數(shù)據(jù)的利用率有限。而在QPCR芯片的設計過程中，研究者依據(jù)已知的信號過程選擇檢測對象，盡管選擇的基因總數(shù)不多，但可能都是預測軟件的參考基因，同樣會得到較好的結果。也就是說，被檢測基因的“質(zhì)量”而不是基因信息的通量才是信號通路預測的關鍵。人類斑駁病的研究受到很多限制，易受到諸如醫(yī)學倫理、發(fā)病率低和連續(xù)觀察困難等問題的困擾，動物模型可以很好的解決這些問題。小鼠由于世代周期較短又易于飼養(yǎng)繁殖，其組織形態(tài)和生理生化特征與人相似，與人類基因的同源性、同線性高，已作為應用最廣泛的實驗動物之一，成為建立人類疾病模型最重要的實驗材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的缺陷提供一種KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用。 本發(fā)明的上述技術問題是通過以下技術方案得以實施的一種KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用，所述芯片以Aktl、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3_ps、CsfI、Crk、Ecml、Fes、Fyn、Grb7、HrasI、Jakl、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrkl、Pdgfa、Pik3ca、Ppplrl3b、Prkcc、Rafl、Sh2b2、Shcl、Snai2、Soatl、StatI、Zhx2基因為檢測位點，以Actb為內(nèi)參，以以下32個基因的上游引物和下游引物為基礎檢測特定基因的表達水平
權利要求
1.一種KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用。
2.根據(jù)權利要求I所述的KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用，其特征在于所述的KIT信號相關基因QPCR芯片是以從之、Cbl、Ccnd3、Ccnd3_ps、Csfl、Crk、Ecml、Fes、Fyn、Grb7、Hrasl、Jakl、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、NrOb2、Ntrkl、Pdgfa、Pik3ca、Ppplrl3b、Prkcc、Rafl、Sh2b2^ Shcl、Snai2、Soatl、Statl、Zhx2 基因為檢測位點，以為內(nèi)參，以以下32個基因的上游引物和下游引物為基礎檢測特定基因的表達水平基因名稱I上游引物I下游引物Actb_F: AGATGACCCAGATCATGTTTGAGAR: AGATGACCCAGATCATGTTTGAGAAktlF:TGAGGAGCGGGAAGAATGGRiGGTGAGCCTGATCGGAAGTCBe 12F:GAGGCTGGGATGCCTTTGTRicCAGGTATGCACCCAGAGTGACblF:GAGCGCCGGCGGTGGTTGCRiGGAATGGAGCCGGGCGAGAAGGACcndSF:TGCGTGCAAAAGGAGATCAARicACACACCTCCAGCATCCAGTACcnd3-psF:CCTGTCTCTGCCCAGTGGTTRicCAAAAAGTCTGGGCATGCTCrkF:CCAACCCAGCGTCAACACTRiGCTCACCGACCTCCAAAGCCsflF:GCAGCAGTTGATCGACAGTCARicGCATGGTCTCATCTATTATGTCTTGEcmlF:TGCCGCAGCGACACAArIcATTGCATCCTCCCACACAAGFesF:AGCAAGGATCCTGAAACAGTACAAR TGTGCAGACCCCGATGAGAFynF:CCATACCCAGGCATGAACAACRiGTGGGCAGGGCATCCTATAGGrb7F:CTGGATGCACAAACAGGCATARiTGCAGGAAGCCCTGGATCTHraslF:CAAGCTGGCGTGGAGGATRicGCAATTTATGCTGCCGAATJaklF:CCGCATGAGGTTCTACTTTACCARiTGTCGCCATACAGACTGTTCGTKi tlF:GCACAGTGGCTGGTAACAGTTCRiGAACAGGTAAGGATGAGGTCTGTCALynF:CTACGTGGCCAAGGTCAACARicTGTCGCTCTGCATCTTTCCTMap2kF:ACAGAGATGTGAAGCCCTCCAARicCCCGAAGTCACACAGCTTAAMatkF:GCAGTTTGCTCTTCATGTTGCTRicAAGTCCTCAGAGACCAGGATGTMybF:CTGAACCCTGAACTCATCAAAGGRiGACCAACGCTTCGGACCATANrOb2F:GAGCTGGGTCCCAAGGAGTATRiGCACATCTGGGTTGAAGAGGATNtrklF:TCTGGGAGATCTTCACCTATGGARicGATCGCCTCAGTGTTGGAPdgfaF:GTGCGACCTCCAACCTGAARiGCTCATCTCACCTCACATCTGTCTPikScaF:CGAGATATATGATGCAGCCATTGRiAGATAAAGGTTGCCACGCAGTACPpplrlSbF:TGCTGGACTTTGGTGTCAATGRi CAAGAGGCAGCACAATGCPrkccF:AGCAACTGGGCAAGTTTAAGGARiGAAGAAGAGGCCTATGGCGATTRaflF:AGCTTCCCTACGCCCACATRiACCCACGGCCTACCATGASerpinalcF:CTGGACCAAGACACAGTTTTCGRiGCTTCTTCCATTTGCCTTTAAAGASh2b2F:TCCGCCTGGAGTTCTTCGTRi TGTTGTCCTTTTCAGGCATTTCShclF:GCCGACTGCAAACAGATCATTRicCACCGGACGCGAAAGSnai2F:CACACAGTTATTATTTCCCCATATCTCTRicGAGGTGAGGATCTCTGGTTTTSoatlF:AGAATATCCCACGAGTACTAAATGCARiGGTACTGGTTGACTGTGGGTAGTGStatlF:TGAGCCCGACCCTATTACAAAARicCACGAAGGAGCTCTGAATGAZhx2IF:AACTCACAGCAGACACTGATAGGAA| R:TCAGAAGGATTTCAGCACAGACA 根據(jù)權利要求I所述的KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用，其特征在于所述32個基因的上游引物和下游引物分別放置在同一塊96孔板的各孔內(nèi)，每個基因做3個復孔。
3.根據(jù)權利要求I所述的KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用，其特征在于32個基因的上游引物和下游引物分別放置在同一塊384孔板的各孔內(nèi)，每個基因做3個復孔，每塊板檢測4個標本。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種用于KIT信號相關基因檢測的QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用。一種KIT信號相關基因QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中的應用，所述芯片以Akt1、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3-ps、Csf1、Crk、Ecm1、Fes、Fyn、Grb7、Hras1、Jak1、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrk1、Pdgfa、Pik3ca、Ppp1r13b、Prkcc、Raf1、Sh2b2、Shc1、Snai2、Soat1、Stat1、Zhx2基因為檢測位點，以Actb為內(nèi)參，該QPCR芯片在小鼠斑駁病檢測中用于QPCR反應的擴增。與基因芯片相比，本發(fā)明的KIT信號相關基因QPCR芯片具有以下優(yōu)勢1、費用低；2、所涉及基因是針對某一信號通路或某一組織設計而成的，具有一定的特異性；3、操作及數(shù)據(jù)分析相對簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102776272SQ20111036528
公開日2012年11月14日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權日2011年8月23日
發(fā)明者吳寶金 申請人:杭州師范大學