專利名稱：丙型肝炎病毒hcv5'非編碼區(qū)基因分型的生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丙型肝炎病毒HCV5’非編碼區(qū)基因分型的生物芯片。
丙型肝炎病毒HCV是9，600個核苷酸的單鏈RNA病毒。含有一個編碼3011氨基酸的ORF和5’非編碼區(qū)(5’-Non-coding region)，3’非編碼區(qū)。
HCV病毒現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有十大類型(HCV type1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)；每一大類型又有許多亞型(subtypes)，如HCV1a，HCV2b等。在臨床上不同的亞型對于α-IFN的治療，肝病的發(fā)生過程及嚴重程度有重要意義。HCV不同基因型也影響HCV感染的抗體診斷及病毒傳染途徑。α-IFN是治療HCV感染最有效的方法之一，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HCV不同的亞型對α-IFN有不同的治療效果，如HCV 1a，1b，2a，3a的治療LTR(long-term response)分別為20％，7％，17％和16％。RIBAVIRIN是治療慢性HCV肝炎的藥物，經(jīng)常與α-IFN同時使用，相關(guān)研究結(jié)果是HCV 1b，2a，3a的LTR分別是20％，40％和75％。另外，HCV 1b和4比HCV 1a，2a，3a感染在手術(shù)移植后，更快出現(xiàn)慢性肝病和cirrhosis并發(fā)癥；而HCV 1b感染也更容易導(dǎo)致嚴重的慢性肝炎，cirrhosis和HCC(hepatocellular careinoma)形成。
人類在疾病基因診斷(又稱分子診斷)上的早期實踐始于70年代初期，但直到80年代中期PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)誕生后，其在醫(yī)學診斷上的應(yīng)用才得到了迅速的發(fā)展?，F(xiàn)代基因診斷是應(yīng)用分子生物學高新技術(shù)-如PCR、分子雜交和DNA測序等技術(shù)手段，通過在分子水平上對被檢樣品進行分析來達到診斷疾病的目的。
目前人類對人體基因及病源體基因致病性的知識積累，己使基因診斷技術(shù)廣泛應(yīng)用于人類遺傳病、傳染病、腫瘤和其他與基因相關(guān)的許多疾病等方面的診斷。與醫(yī)學上傳統(tǒng)的實驗診斷比較，基因診斷技術(shù)的主要優(yōu)勢是能獲得高度特異性的針對病因分子的診斷結(jié)果，而對于人類遺傳病，細菌，病毒感染和某些腫瘤病而言，基因診斷結(jié)果是最后的確診指標。簡變快速可靠的現(xiàn)代基因診斷新技術(shù)的發(fā)展，特別是最近生物芯片(biochip)技術(shù)的出現(xiàn)，其發(fā)展趨勢將不可避免的替代現(xiàn)有臨床實驗室的許多方法，并可能改變傳統(tǒng)的醫(yī)學診斷觀念。
現(xiàn)在HCV的亞型分析一般是分析5’非編碼區(qū)(5’NCR)，核心(core)區(qū)序列和NS5B序列。利用的方法主要有(1)PCR-RFLP(restriction fragment lengthpolymorphism)，該方法利用多種限制性內(nèi)切酶對基因擴增產(chǎn)物進行酶切，不同的基因序列將產(chǎn)生不同的電泳圖譜(Davidson F et al，J Gen Virol 1995，76，1197-1204；Murphy D et al，J Infect Dis，1994，169，473-475；Mellor Jet al，J Gen Virol，1995，76，2493-2507)，該方法只能應(yīng)用于當突變改變了某一酶切位點時。(2)探針雜交方法(Stuyver J et al，Virus Res，1995，38，137-157；Tisminetzky SG et al，Int Hepatol Commun，1994，2，105-142)，待測基因經(jīng)PCR擴增后，分別與15-20bp標記的特異性探針雜交。該方法需進行同位素標記或地高辛，生物素，過氧化物酶等標記，分析過程復(fù)雜，不適宜快速分析。(3)特異性PCR引物擴增方法(Okamoto H et al，J Gen Virol，1992，73，673-679；Okamoto H et al，J Gen Virol，1993，74，2385-2390)，其原理是根據(jù)已知突變位點的性質(zhì)在引物中設(shè)計一錯配堿基，使之僅能擴增突變型或野生型基因。該方法較為快速簡便。但一次只能檢測有限的亞型。(4)DNA酶免疫分析方法(DNA enzyme immunoassay)(Viazov S et al，J Virol Methods，1994，48，81-91)。(5)DNA測序法，這是最直觀，最準確的方法。但技術(shù)復(fù)雜價格昂貴，不能作為常規(guī)方法。(6)ELISA分析法(Simmonds P et al，J ClinMicrobiol，1993，31，1493-503；Bhattacherjee V et al，J Gen Virol，1995，76，1737-48；Machida A et al，Hepatology，1992，16，886-91；Tanaka T etal，Hepatology，1994，19，1347-53)，這種方法只能對HCV病毒的主要類型(type)，如HCV1和HCV2，進行分類，不能分析亞型(subtype)。
綜上所述，在有關(guān)丙型肝炎病毒HCV的診斷及基因分型的現(xiàn)有技術(shù)中，存在操作繁雜，所需時間長，成本較高，難以自動化及大量樣本平行分析等問題。本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種與現(xiàn)有技術(shù)完全不同的有關(guān)HCV基因分型診斷方法。利用DNA芯片技術(shù)檢測HCV病毒，并對30多種亞型進行分型。
本發(fā)明的目的是提供一種可以方便，快速地一次檢測30種左右的丙型肝炎病毒的亞型的丙型肝炎病毒HCV5’非編碼區(qū)基因分型生物芯片。
為了達到上述目的本發(fā)明采取下列措施丙型肝炎病毒HCV5’非編碼區(qū)基因分型的生物芯片是在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定診斷丙型肝炎病毒及其30多種亞型的DNA探針，所說的探針為HCV1(127-113) ATG CCT GGA GAT TTGHCV1(168-154) TTG CCA GGA CGA CCGHCV1a(242-228) GTG TCG TGC AGC CTCHCV1b(106-92) CCC CCG CGA GAC T/CGCHCV1c(145-131) CTT GGA TTA ACC CGCHCV1d(144-130) TTG GAT AAC CCC GCTHCV1f(143-129) TGG ATC TAA CCG CTCHCV2(139-125) TAA ACC CAC TCT ATGHCV2(83-69) TAG CGT TGG GTT GCGHCV2a(128-114) TAT GCC CGG TCA TTTHCV2b(168-154) TTA CCG GAA AGA CTGHCV2c(126-112) TGC CCG GCC ATT TGGHCV2d(129-115) CTA TGC CTG GTC ATTHCV2e(101-87) GCA AGA CCG CTA GCCHCV3(170-156) AAT CGC TGG GGT GACHCV3(129-114) CAA TAC CCA GAA ATT THCV3(103-89)CCG CGA GAT CAC TAGHCV3a(146-132) TCT TGG AGC AAC CCGHCV3d(145-132) CTT GGA ACA AAC CCGHCV3f(145-132) CTT GGA ATC AAC CCGHCV4(244-229) GAG TGT TGT ACA GCC THCV4(170-156) AAT CGC CGG GAT GACHCV4bg(127-113) ATG CCC GGC AAT TTGHCV4e(144-129) TTG GAT TAA ACC GCT CHCV5a(243-229) AGT GTC GAA CAG CCTHCV6ab(147-136) TTC CAT TGG ATC AAAHCV6a(242-228) GTG TCG TAC AGC CTCHCV10a(168-154) TCG CCG GGT TGA CCG本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以方便，快速地一次檢測30種左右的丙型肝炎病毒的亞型，非常適合于臨床的病毒基因分型。每一種病毒亞型有一種雜交信號模式，通過雜交信號模式分析，判斷待檢測病毒的亞型，分辨率高，專一性強。一次測試能檢測的病毒亞型數(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中最多的。采用熒光分析方法，靈敏度高。同一芯片可同時檢測HCV1a，HCV1b，HCV1c，HCV1d，HCV1e，HCV1f，HCV2a，HCV2b，HCV2c，HCV2d，HCV2e，HCV3a，HCV3b，HCV3c，HCV3d，HCV3e，HCV3f，HCV4a，HCV4b，HCV4c，HCV4d，HCV4e HCV4f，HCV4g，HCV5a，HCV6a，HCV6b，HCV10a。本發(fā)明也適用于其他病毒和微生物的檢測及基因分型，如HBV的基因分型。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細說明。


圖1是丙型肝炎病毒(HCV)5’非編碼區(qū)基因分型生物芯片模式圖；圖2是檢測HCV2a，1b病毒的雜交信號模式示意圖；圖3是HCV1b，HCV2a檢測雜交結(jié)果圖。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的。通過對HCV病毒的5’非編碼區(qū)(5’NCR)的PCR擴增及特異性探針雜交的方法鑒定HCV病毒的基因型1a，1b，1c，1d，1f，1e，2a，2b，2c，2d，2e，3a，3b，3c，3d，3e，3f，4a，4b，4c，4d，4e，4f，4g，4h，4k，5a，6a，6b和10a。5’非編碼區(qū)(5’NCR)的核苷酸序列(341bp)5’non-coding region of HCV-1 1a genome(GenBank ACC No.D31603) 5’非編碼區(qū)(5’NCR)的PCR擴增引物(243bp)Primers of 5’non-coding region of HCV-1 1a genomeOLIGO tm gc％ seqPrimerHCV1 59.37 50.00 cttcacgcagaaagcgtctaPrimerHCV2 60.42 55.00 gcaccctatcaggcagtacc探針設(shè)計搜查大量文獻資料，比較HCV的所有類型及亞型的5’非編碼區(qū)(5’NCR)的340bp的序列，用計算機軟件設(shè)計可分析30多種亞型的DNA探針，設(shè)計的探針為HCV1(127-113) ATG CCT GGA GAT TTGHCV1(168-154) TTG CCA GGA CGA CCGHCV1a(242-228)GTG TCG TGC AGC CTCHCV1b(106-92) CCC CCG CGA GAC T/CGCHCV1c(145-131)CTT GGA TTA ACC CGCHCV1d(144-130)TTG GAT AAC CCC GCTHCV1f(143-129)TGG ATC TAA CCG CTCHCV2(139-125) TAA ACC CAC TCT ATGHCV2(83-69) TAG CGT TGG GTT GCGHCV2a(128-114)TAT GCC CGG TCA TTTHCV2b(168-154)TTA CCG GAA AGA CTGHCV2c(126-112)TGC CCG GCC ATT TGGHCV2d(129-115)CTA TGC CTG GTC ATTHCV2e(101-87) GCA AGA CCG CTA GCCHCV3(170-156) AAT CGC TGG GGT GACHCV3(129-114) CAA TAC CCA GAA ATT THCV3(103-89) CCG CGA GAT CAC TAGHCV3a(146-132)TCT TGG AGC AAC CCGHCV3d(145-132)CTT GGA ACA AAC CCGHCV3f(145-132)CTT GGA ATC AAC CCGHCV4(244-229) GAG TGT TGT ACA GCC THCV4(170-156) AAT CGC CGG GAT GACHCV4bg(127-113) ATG CCC GGC AAT TTGHCV4e(144-129)TTG GAT TAA ACC GCT CHCV5a(243-229)AGT GTC GAA CAG CCTHCV6ab(147-136) TTC CAT TGG ATC AAAHCV6a(242-228)GTG TCG TAC AGC CTCHCV10a(168-154) TCG CCG GGT TGA CCGDNA探針的固定氨基修飾DNA探針(NH2-(CH2)6-DNA oligo)，以上28種DNA探針以每種探針重復(fù)2次以上固定于載體表面(載玻片，硅片，高分子材料，膜等)。樣品處理取待測者血液1毫升，利用商業(yè)化的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng))擴增HCV病毒5’非編碼區(qū)(5’NCR)，引物5’末端用熒光修飾。PCR產(chǎn)物加入1/10體積的3M pH5.2醋酸緩沖液，加入2.5倍體積的-20℃冷藏的100％乙醇，混勻后，-20℃放置30分鐘。13000rpm離心10分鐘，用70％乙醇洗滌沉淀，干燥。DNA芯片表面雜交過程5μl雜交緩沖液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加于DNA陣列表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時。雜交信號檢測及信號模式分析用共聚焦熒光顯微鏡或熒光掃描儀檢測DNA芯片雜交信號。通過信號模式分析判別HCV病毒亞型。信號模式識別分析表HCV1a1，2，3HCV1b1，2，4HCV1c1，2，5，3HCV1d1，2，6HCV1e1，2，27HCV1f1，2，7HCV2a8，9，10HCV2b8，9，11HCV2c8，9，12HCV2d8，9，13HCV2e8，9，14HCV3a15，16，17，18，3HCV3b17，3，22HCV3c15，16，3HCV3d15，16，17，3，19HCV3e15，16，17，3HCV3f3，20HCV4a21HCV4b21，22，23HCV4c21，22HCV4d21，22HCV4e21，22，24HCV4f21，20HCV4g19，23HCV4h20，22HCV4k22HCV5a25HCV6a1，9，26，27HCV6b1，2，3，9，26HCV10a3，28
圖1為丙型肝炎病毒(HCV)5’非編碼區(qū)(5’non-coding region，NCR)基因分型的生物芯片模式圖。1HCV1(127-113)，2HCV1(168-154)，3HCV1a(242-228)，4HCV1b(106-29)，5HCV1c(145-131)，6HCV1d(144-130)，7HCV1f(143-129)，8HCV2(139-125)，9HCV2(83-69)，10HCV2a(128-114)，11HCV2b(168-154)，12HCV2c(126-112)，13HCV2d(129-115)，14HCV2e(101-87)，15HCV3(170-156)，16HCV3(129-114)，17HCV3(103-89)，18HCV3a(146-132)，19HCV3d(145-132)，20HCV3f(145-132)，21HCV4(244-229)，22HCV4(170-156)，23HCV4bg(127-113)，24HCV4e(144-129)，25HCV5a(243-229)，26HCV6ab(149-135)，27HCV6a(242-228)，28HCV10a(168-154)。
圖2為檢測HCV2a，1b病毒的雜交信號模式。HCV2a的信號點是8，9，10；HCV1b的信號點是1，2，4。
圖3 HCV2a，HCV1b檢測雜交結(jié)果圖實施例1利用本發(fā)明的生物芯片檢測HCV 2a病毒。取待測者血液1毫升，用設(shè)計的PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))引物PrimerHCV1cttcacgcagaaagcgtcta和PrimerHCV2FITC-gcaccctatcaggcagtacc和商業(yè)化的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng))試劑盒擴增HCV病毒5’非編碼區(qū)(5’NCR)。得243bp的基因片斷，加入1/10體積的3M pH5.2醋酸緩沖液，加入2.5倍體積的-20℃冷藏的100％乙醇，混勻后，-20℃放置30分鐘。13000rpm離心10分鐘，用70％乙醇洗滌沉淀，干燥。5μl雜交緩沖液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加于DNA陣列表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時。用熒光掃描儀檢測DNA芯片雜交信號，結(jié)果如圖3右圖。
實施例2利用本發(fā)明的生物芯片檢測HCV 1b病毒。取待測者血液1毫升，用設(shè)計的PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))引物PrimerHCV1cttcacgcagaaagcgtcta和PrimerHCV2FITC-gcaccctatcaggcagtacc和商業(yè)化的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng))試劑盒擴增HCV病毒5’非編碼區(qū)(5’NCR)。得243bp的基因片斷，加入1/10體積的3M pH5.2醋酸緩沖液，加入2.5倍體積的-20℃冷藏的100％乙醇，混勻后，-20℃放置30分鐘。13000rpm離心10分鐘，用70％乙醇洗滌沉淀，干燥。5μl雜交緩沖液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加于DNA陣列表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時。用熒光掃描儀檢測DNA芯片雜交信號，結(jié)果如圖3左圖。
權(quán)利要求
1.一種丙型肝炎病毒HCV5’非編碼區(qū)基因分型的生物芯片，其特征在于在玻片、硅片、膜、高分子材料上固定檢測丙型肝炎病毒及其30多種亞型的DNA探針，所說的探針為HCV1(127-113) ATG CCT GGA GAT TTGHCV1(168-154) TTG CCA GGA CGA CCGHCV1a(242-228) GTG TCG TGC AGC CTCHCV1b(106-92) CCC CCG CGA GAC T/CGCHCV1c(145-131) CTT GGA TTA ACC CGCHCV1d(144-130) TTG GAT AAC CCC GCTHCV1f(143-129) TGG ATC TAA CCG CTCHCV2(139-125) TAA ACC CAC TCT ATGHCV2(83-69) TAG CGT TGG GTT GCGHCV2a(128-114) TAT GCC CGG TCA TTTHCV2b(168-154) TTA CCG GAA AGA CTGHCV2c(126-112) TGC CCG GCC ATT TGGHCV2d(129-115) CTA TGC CTG GTC ATTHCV2e(101-87) GCA AGA CCG CTA GCCHCV3(170-156) AAT CGC TGG GGT GACHCV3(129-114) CAA TAC CCA GAA ATT THCV3(103-89)CCG CGA GAT CAC TAGHCV3a(146-132) TCT TGG AGC AAC CCGHCV3d(145-132) CTT GGA ACA AAC CCGHCV3f(145-132) CTT GGA ATC AAC CCGHCV4(244-229) GAG TGT TGT ACA GCC THCV4(170-156) AAT CGC CGG GAT GACHCV4bg(127-113) ATG CCC GGC AAT TTGHCV4e(144-129) TTG GAT TAA ACC GCT CHCV5a(243-229) AGT GTC GAA CAG CCTHCV6ab(147-136) TTC CAT TGG ATC AAAHCV6a(242-228) GTG TCG TAC AGC CTCHCV10a(168-154) TCG CCG GGT TGA CCG
全文摘要
本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒HCV5’非編碼區(qū)基因分型的生物芯片。它是在玻片、硅片、膜和高分子材料上固定我們設(shè)計的28種特異DNA探針,可用來檢測丙型肝炎病毒及其30多種亞型。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,可以方便,快速地一次檢測30種左右的丙型肝炎病毒的亞型,非常適合于臨床的病毒基因分型。每一種病毒亞型有一種雜交信號模式,分辨率高,專一性強。一次測試能檢測的病毒亞型數(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中最多的。采用熒光分析方法,靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK1335410SQ0012216
公開日2002年2月13日 申請日期2000年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月23日
發(fā)明者葉邦策 申請人:浙江江南生物科技有限公司