專利名稱：副粘病毒科的包膜基因缺陷型病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種副粘病毒的包膜基因缺陷型病毒載體。
背景技術(shù)：
到目前為止，在基因治療的許多臨床方法中，已經(jīng)使用了來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒的病毒載體。這些基因治療載體在基因?qū)胄屎统掷m(xù)表達(dá)方面存在限制，并且還具有細(xì)胞毒性和免疫原性，在這些載體應(yīng)用于臨床時，這些都是重要的問題(Lamb，R.A.和Kolakofsky，D.，病毒學(xué)領(lǐng)域，副粘病毒科病毒及其復(fù)制.第三版，(B.N.Fields、D.M.Knipe和P.P.Howley編)pp.1177-1204(費(fèi)城，Lippincott-Raven〔1996〕)。已經(jīng)提出基于慢病毒屬和HSV的新載體作為解決此問題的對策，并且還在進(jìn)行廣泛的研究以改善現(xiàn)存的載體。但是，所有這些載體在整個生命周期中為胞核中的DNA形式。因此難以完全克服這些載體與患者染色體隨機(jī)相互作用的安全性問題。
最近反向遺傳學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，這使已延遲了很久的基于RNA病毒的載體的開發(fā)成為可能。重組RNA病毒載體的基因?qū)胄屎捅磉_(dá)能力較高，因此充當(dāng)基因治療載體的潛力很大(Roberts，A.和Rose，J.K.，《病毒學(xué)》247，1-6(1998)；Rose，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，14998-15000(1996)；Palese，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11354-11358(1996))。然而仍未有來源于減毒病毒的缺陷型基因組的副粘病毒載體實(shí)際應(yīng)用的報道。
具有負(fù)鏈RNA作為基因組的副粘病毒載體，它具有幾種明顯不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒、DNA病毒或正鏈RNA病毒載體的特性。負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反基因組不具備直接充當(dāng)mRNA的功能，所以它們不能啟動病毒蛋白的合成和基因組的復(fù)制。這些病毒的RNA基因組和反基因組總是以核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)的形式存在，因此它們幾乎不會產(chǎn)生由反義鏈產(chǎn)生的問題，諸如因?yàn)閙RNA與互補(bǔ)的裸基因組RNA雜交而妨礙基因組裝配為RNP，這在正鏈RNA病毒中常出現(xiàn)。這些病毒含有它們自己的RNA聚合酶，可應(yīng)用RNP復(fù)合體充當(dāng)模板，進(jìn)行病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄或病毒基因組的復(fù)制。值得注意的是，因?yàn)樨?fù)鏈RNA(nsRNA)病毒不具有DNA相，所以它們僅在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中增殖，并不整合至染色體中。而且已經(jīng)認(rèn)識到在RNA之間沒有同源重組。有人認(rèn)為這些特性非常利于負(fù)鏈RNA病毒作為基因表達(dá)載體的穩(wěn)定性和安全性。
在負(fù)鏈RNA病毒中，本發(fā)明人已經(jīng)將注意力集中到仙臺病毒(SeV)上。仙臺病毒是一種非分節(jié)段型負(fù)鏈RNA病毒，屬于副粘病毒屬，并且是鼠源副流感病毒的一種類型。這種病毒通過兩種包膜糖蛋白，即血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)，粘附于宿主細(xì)胞膜，引起膜融合，并且有效地將它們自己的RNA聚合酶和核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體形式的RNA基因組釋放到胞質(zhì)中，并在此部位進(jìn)行病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制(Bitzer，M.等，《病毒學(xué)雜志》71(7)5481-5486，1997)。此病毒包膜蛋白F被合成為一種無活性前體蛋白(F0)，然后通過胰蛋白酶切割為F1和F2(Kido，H.等，《生物高分子》(肽科學(xué))51(1)79-86，1999)，從而成為可引起膜融合的活性蛋白。據(jù)稱這種病毒對人無致病性。另外，已經(jīng)分離出仙臺病毒的一種減毒實(shí)驗(yàn)室株(Z株)，它僅在其自然宿主嚙齒動物中引起輕度肺炎。此減毒株已經(jīng)廣泛地用作副粘病毒轉(zhuǎn)錄-復(fù)制機(jī)制的分子水平研究的一種研究模型，并用于雜交瘤的制備。除了上述較高安全性外，此病毒在細(xì)胞系或雞胚中具有較高的制備滴度，為109-11pfu/ml。在最近一個成功的從cDNA回收負(fù)鏈RNA病毒載體系統(tǒng)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)仙臺病毒的重建效力尤其高。導(dǎo)入了外源基因的重組野生型病毒有效并穩(wěn)定地表達(dá)外源導(dǎo)入的基因的能力受到廣泛的關(guān)注。
因此，負(fù)鏈RNA病毒充當(dāng)基因?qū)胼d體具有許多優(yōu)勢。然而就基因治療的應(yīng)用而言，需要開發(fā)安全性較高的載體，當(dāng)此載體感染細(xì)胞時，并不釋放感染性顆粒。為了達(dá)到此目的，需要一種技術(shù)，此技術(shù)可大量生產(chǎn)在野生型病毒生產(chǎn)能力方面有缺陷的病毒。但是，開發(fā)可利用的基于包膜基因-缺陷型基因組的載體仍未成功。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種包膜基因缺陷型副粘病毒載體。
為構(gòu)建適宜基因治療的完全缺乏傳播能力的副粘病毒載體，本發(fā)明人利用引入了GFP基因充當(dāng)報道基因的cDNA從SeV的基因組中刪除了F基因，以建立一種在表達(dá)仙臺病毒F蛋白的細(xì)胞中回收感染性病毒顆粒的方法。通過這種F基因缺陷型病毒載體，可將基因高效地導(dǎo)入原代大鼠神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物、小鼠原始造血干細(xì)胞、人正常細(xì)胞和各種其它類型的細(xì)胞，并高表達(dá)。而且針對大鼠腦的體內(nèi)給藥也獲得了較好的表達(dá)。此F基因缺陷型SeV載體可在感染細(xì)胞中比較持久和強(qiáng)烈地表達(dá)基因，而不產(chǎn)生次生感染病毒顆粒，并且不在鄰近細(xì)胞中增殖。因此提示這種載體可用于基因治療。
另外本發(fā)明人生產(chǎn)一種F基因和HN基因均有缺陷的SeV載體cDNA，以建立一種可在表達(dá)仙臺病毒F蛋白和HN蛋白的細(xì)胞系中回收感染性病毒顆粒的方法。另外，通過將這種SeV載體cDNA導(dǎo)入F表達(dá)細(xì)胞，本發(fā)明人成功地構(gòu)建了HN蛋白缺陷型SeV載體。
因此本發(fā)明首次建立了一種新的可應(yīng)用的基于負(fù)鏈RNA病毒的包膜基因缺陷型載體系統(tǒng)。在應(yīng)用輔助細(xì)胞從F基因缺陷或FHN基因缺陷基因組cDNA回收感染性缺陷病毒顆粒方面的成功為研究和開發(fā)利用仙臺病毒顯著特征的新的基因治療載體鋪平了道路。
本發(fā)明的缺陷型仙臺病毒載體對各種類型細(xì)胞具有相當(dāng)高的基因?qū)胄?，而且在表達(dá)外源基因方面具有很強(qiáng)的能力。另外它在感染細(xì)胞中可持續(xù)表達(dá)，而且不釋放次代感染病毒顆粒，這證明它是一種完全不具備病毒傳播能力的安全性較高的載體。
當(dāng)應(yīng)用RNA病毒時，基因組的穩(wěn)定性是一個難題。在連續(xù)多次傳代后，通過SeV載體的異源基因表達(dá)幾乎沒有任何堿基突變，這表明它可長期穩(wěn)定地表達(dá)所插入的異源基因(Yu，D.等《基因細(xì)胞》2，457-466(1997))。與基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)或新培斯病毒(Sindbis virus)的復(fù)制子相比，基于負(fù)鏈RNA病毒復(fù)制子的載體具有幾種有利的特性，諸如所導(dǎo)入或包裝的基因的基因組穩(wěn)定性或基因大小的柔性，因?yàn)樗鼈儧]有衣殼結(jié)構(gòu)蛋白。所述塞姆利基森林病毒是一種已經(jīng)成功的正鏈RNA病毒?？蓪⒅辽?kbp外源DNA插入野生型仙臺病毒載體，可將比這長得多的外源DNA插入所述缺陷型載體。通過加入一個轉(zhuǎn)錄單位，可同時表達(dá)兩種或多種基因。因?yàn)槔碚撋?，在胞質(zhì)中復(fù)制的多拷貝RNP在細(xì)胞分裂時將分布至子代細(xì)胞中，所以預(yù)計(jì)基于仙臺病毒復(fù)制子的載體中可有持續(xù)的表達(dá)。實(shí)際上，這種情況已經(jīng)在某種血細(xì)胞的體外研究中得到證明。另外因?yàn)楸景l(fā)明人已經(jīng)證實(shí)可將仙臺病毒載體高效地導(dǎo)入血細(xì)胞，尤其是粒細(xì)胞，而且也證實(shí)可將它導(dǎo)入c-kit陽性原代(primitive)始細(xì)胞，所以認(rèn)為此載體是一種組織應(yīng)用范圍很廣泛的利用價值極高的載體。
因而本發(fā)明涉及包膜基因缺陷型仙臺病毒載體，特別涉及(1)一種副粘病毒科的病毒載體，它包含一種復(fù)合體，此復(fù)合體包含(a)源自副粘病毒的負(fù)鏈單鏈RNA，它被修飾而不能表達(dá)副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白，和(b)一種與所述負(fù)鏈單鏈RNA結(jié)合的蛋白；(2)按照(1)的載體，其中的負(fù)鏈單鏈RNA表達(dá)NP蛋白、P蛋白和L蛋白，而且它被修飾而不能表達(dá)F蛋白和/或HN蛋白；(3)按照(1)或(2)的載體，其包含至少一種包膜蛋白，此蛋白的表達(dá)在修飾的負(fù)鏈單鏈RNA中受到抑制；(4)按照(1)至(3)中任意一種的載體，它包含VSV-G蛋白；(5)按照(1)至(4)中任意一種的載體，其中的負(fù)鏈單鏈RNA源自仙臺病毒；(6)按照(1)至(5)中任意一種的載體，其中的負(fù)鏈單鏈RNA還編碼一種外源基因；(7)一種編碼負(fù)鏈單鏈RNA的DNA或者它的互補(bǔ)鏈，它包含在按照(1)至(6)中任意一種的載體中；(8)一種生產(chǎn)按照(1)至(6)中任意一種的載體的方法，它包含以下步驟(a)通過編碼經(jīng)修飾不能表達(dá)副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白的副粘病毒衍生性負(fù)鏈單鏈RNA或其互補(bǔ)鏈，導(dǎo)入表達(dá)所述包膜蛋白的細(xì)胞中，以便表達(dá)所述載體DNA，(b)培養(yǎng)所述的細(xì)胞，以及，(c)從培養(yǎng)物上清液中回收病毒顆粒；(9)一種生產(chǎn)按照(1)至(6)中任意一種的載體的方法，它包含以下步驟(a)一種復(fù)合體包含源自副粘病毒且已被修飾而不能表達(dá)副粘病毒屬病毒的至少一種包膜蛋白的負(fù)鏈單鏈RNA和一種與所述負(fù)鏈單鏈RNA結(jié)合的蛋白，將此復(fù)合體導(dǎo)入表達(dá)所述包膜蛋白的細(xì)胞，(b)培養(yǎng)所述的細(xì)胞，以及，(c)從培養(yǎng)物上清液中回收病毒顆粒；(10)按照(8)或(9)的方法，其中(b)中的細(xì)胞培養(yǎng)物與表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞共培養(yǎng)；(11)按照(8)或(9)的方法，其中將表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞置于(b)的細(xì)胞培養(yǎng)物所述細(xì)胞的上層；(12)按照(8)至(11)任意一種的方法，其中由細(xì)胞表達(dá)的至少一種包膜蛋白與在上述負(fù)鏈單鏈RNA中表達(dá)受抑制的至少一種包膜蛋白相同；(13)按照(8)至(12)任意一種的方法，其中由細(xì)胞表達(dá)的至少一種包膜蛋白為VSV-G蛋白。
在本發(fā)明中，名詞“載體”指包裹可在宿主中表達(dá)外源基因的核酸分子的病毒顆粒。
屬于副粘病毒科的病毒的“NP、P、M、F、HN和L基因”分別指編碼核衣殼、磷、基質(zhì)、融合體、血凝素-神經(jīng)氨酸酶和大分子蛋白的基因。屬于副粘病毒科的亞科的各個病毒基因通常表示如下。NP基因通常也描述為“N基因”。
呼吸道病毒(Respirovirus)屬N P/C/V MF HN- L風(fēng)疹病毒(Rubullavirus)屬 N P/V MF HN(SH) L麻疹(Morbillivirus)屬 N P/C/V MF H - L副粘病毒科呼吸道病毒屬仙臺病毒的NP基因的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫錄入號是M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218，對于P基因，是M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008，對于M基因，是D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056，對于F基因，是D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131，對于HN基因，是D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131以及對于L基因，是D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886。
本發(fā)明涉及副粘病毒科包膜基因缺陷型病毒載體。此病毒載體包含來源于副粘病毒的負(fù)鏈單鏈RNA，此RNA已被修飾而不能表達(dá)至少一種包膜蛋白。副粘病毒在包膜中通常包含一個由RNA和蛋白組成的復(fù)合體(核糖核蛋白，RNP)。RNP中所包含的RNA是負(fù)鏈單鏈RNA，它是副粘病毒的基因組。該蛋白與RNA結(jié)合形成復(fù)合體。也就是，本發(fā)明的副粘病毒科的病毒載體包含一種復(fù)合體，此復(fù)合體包含(a)一種來源于副粘病毒的負(fù)鏈單鏈RNA，此RNA已被修飾而不能表達(dá)副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白，和(b)一種與所述負(fù)鏈單鏈RNA結(jié)合的蛋白。結(jié)合負(fù)鏈單鏈RNA的蛋白指直接或間接結(jié)合負(fù)鏈單鏈RNA，并與此負(fù)鏈單鏈RNA一起形成RNP復(fù)合體的蛋白。通常副粘病毒的負(fù)鏈單鏈RNA(基因組RNA)與NP、P和L蛋白結(jié)合。在這種RNP中所包含的RNA充當(dāng)病毒基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板(Lamb，R.A.和D.Kolakofsky，1996，《副粘病毒科病毒及其復(fù)制》，1177-1204，《病毒學(xué)領(lǐng)域》，第3版，F(xiàn)ields，B.N.，D.M.Knipe和P.M.Howley等(主編)，Raven出版社，紐約，N.Y.)。本發(fā)明的復(fù)合體包括那些包含來源于副粘病毒的負(fù)鏈單鏈RNA，也包含來源于副粘病毒的與所述RNA結(jié)合的蛋白的那些復(fù)合體。本發(fā)明的載體包含RNP，此RNP包含例如與這些蛋白(NP、P和L蛋白)結(jié)合的副粘病毒負(fù)鏈單鏈RNA。通常副粘病毒RNP復(fù)合體能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制。因而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的載體在胞內(nèi)增殖RNP從而增加基因(復(fù)合體中包含的RNA)的拷貝數(shù)，由此導(dǎo)致對RNP所攜帶的外來基因的高水平表達(dá)。本發(fā)明的載體優(yōu)選那些能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中復(fù)制復(fù)合體(RNP)中所含RNA的載體。
除了仙臺病毒外，本發(fā)明可應(yīng)用的副粘病毒科病毒還有麻疹病毒、猴副流感病毒(SV5)和人副流感病毒3，但不局限于此。
通常，修飾病毒載體中所包含的負(fù)鏈單鏈RNA，以表達(dá)NP、P和L蛋白，但不表達(dá)F和/或HN蛋白。
對于仙臺病毒(SeV)，天然病毒基因組的大小大約為15000個核苷酸，其負(fù)鏈包含編碼NP(核衣殼)、P(磷)、M(基質(zhì))、F(融合蛋白)、HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶)和L(大)蛋白的6個基因，它們排成一排，一端緊隨3′-短前導(dǎo)區(qū)，另一端連接短5′-尾隨區(qū)。在本發(fā)明中，通過在基因組中設(shè)計(jì)F、HN和M基因中的任一缺陷或它們的組合，可以修飾這個基因組，以使它不能表達(dá)包膜蛋白。優(yōu)選是在F基因和/或HN基因中有缺陷。因?yàn)檫@些蛋白并非RNP形成所必需，所以可通過在有NP、P和L蛋白的情況下轉(zhuǎn)錄該基因組RNA(正鏈或負(fù)鏈)來生產(chǎn)本發(fā)明的RNP。例如可在LLC-MK2細(xì)胞或類似細(xì)胞中形成RNP。通過將分別攜帶這些蛋白的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，可提供NP、P和L蛋白(參看實(shí)施例)。也可將每個基因摻入宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)。為形成RNP而被表達(dá)的NP、P和L基因不需要與載體基因組中編碼的那些基因完全相同。也就是說，由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列可能不與由RNP基因組編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列完全相同，只要它們可結(jié)合基因組RNA、并能夠在細(xì)胞中復(fù)制RNP即可。可誘導(dǎo)這些基因發(fā)生突變、或用其它病毒的同源基因替換。一旦形成RNP，此RNP的NP、P和L基因?qū)⒈槐磉_(dá)、從而在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制RNP，并產(chǎn)生病毒載體。
如果在細(xì)胞內(nèi)重組一個載體時，一種包膜蛋白感染至細(xì)胞，這種包膜蛋白將摻入細(xì)胞內(nèi)，并因其而導(dǎo)致感染性病毒載體的生產(chǎn)。這種載體一旦感染至細(xì)胞，雖然它能夠在細(xì)胞內(nèi)增殖RNP，但它將不能象來源病毒那樣生產(chǎn)包含包膜蛋白的病毒，因?yàn)樗鼪]有包膜基因。這種載體在諸如基因治療等安全性要求特別高的領(lǐng)域非常有用。
當(dāng)一種包膜蛋白因在病毒重組時修飾了負(fù)鏈單鏈RNA，即基因組包膜基因缺陷而表達(dá)受抑制時，通過表達(dá)這種包膜蛋白可生產(chǎn)與野生型病毒感染能力相同的病毒載體。表達(dá)基因組中缺陷的包膜基因的一部分也是想得到的。例如，對于F和HN基因均有缺陷的基因組，當(dāng)只表達(dá)F蛋白時，可生產(chǎn)以F蛋白為包膜的病毒載體。僅含F(xiàn)蛋白，不含HN蛋白的病毒可作為載體通過唾液酸糖蛋白受體(ASG-R)的介導(dǎo)特異性感染肝細(xì)胞。因此，本發(fā)明包括副粘病毒科的包含至少一種包膜蛋白的病毒載體，這種包膜蛋白的表達(dá)在修飾的負(fù)鏈單鏈RNA中被抑制。
另外，也可通過應(yīng)用與那些表達(dá)通過修飾負(fù)鏈單鏈RNA而抑制的包膜蛋白不同的包膜蛋白重建本發(fā)明的載體。對這些包膜蛋白的類型沒有特別限定。其它病毒包膜蛋白的一個實(shí)例是水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本發(fā)明副粘病毒科的病毒的載體包括假型病毒載體，其包膜蛋白和基因組來自不同病毒，其包膜蛋白可以是如VSV-G蛋白等。
通?？赏ㄟ^如下方法制備本發(fā)明的病毒載體(a)將編碼副粘病毒衍生性負(fù)鏈單鏈RNA或其互補(bǔ)鏈的載體DNA引入表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞(輔助細(xì)胞)，以表達(dá)所述的RNA，此負(fù)鏈單鏈RNA已經(jīng)修飾而不能表達(dá)副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白，以及(b)培養(yǎng)這些細(xì)胞、以便從培養(yǎng)物上清液中回收病毒顆粒。通過在載體DNA表達(dá)的同時共表達(dá)NP、L和P蛋白，形成了RNP，并構(gòu)建含有包膜蛋白的病毒。
在輔助細(xì)胞中所表達(dá)的載體DNA編碼本發(fā)明復(fù)合體中所包含的負(fù)鏈單鏈RNA(負(fù)鏈)或其互補(bǔ)鏈(正鏈)。例如，將編碼負(fù)鏈單鏈RNA或其互補(bǔ)鏈的DNA連接在T7啟動子的下游，通過T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為RNA?？蓪⑤d體DNA克隆至質(zhì)粒中、以在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。盡管在細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)錄的鏈既可是正鏈、也可是負(fù)鏈，但是為了提高復(fù)合體重建效率，可優(yōu)選安排轉(zhuǎn)錄正鏈。
作為輔助細(xì)胞，使用可表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞。如上所述，輔助細(xì)胞并不局限于表達(dá)病毒載體中缺陷的包膜基因的各種蛋白，例如，對于F、HN基因-缺陷型仙臺病毒載體DNA，僅表達(dá)F蛋白的細(xì)胞可用作輔助細(xì)胞。另外，也可應(yīng)用表達(dá)其它包膜蛋白的細(xì)胞，所述其它包膜蛋白與在病毒載體中缺陷的包膜基因所編碼的蛋白不同。例如，如上所述，除副粘病毒科病毒的包膜蛋白以外的包膜蛋白，諸如VSV-G蛋白也可作為包膜蛋白使用。
例如，通過將一種表達(dá)包膜基因缺陷型重組仙臺病毒載體基因組的質(zhì)粒與表達(dá)所述缺陷的包膜蛋白的載體、以及NP、P/C和L蛋白表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，可重建一種病毒載體?；蛘?，例如可應(yīng)用其染色體中摻入了F基因的宿主細(xì)胞生產(chǎn)RNP復(fù)合體。病毒基因組以外的來源所提供的這些蛋白組的氨基酸序列不需要與來源于此病毒的序列完全相同。在將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的方面，只要這些蛋白比那些天然蛋白具有相同或更高活性，那么編碼這些蛋白的基因可通過插入某些突變或用其它病毒的同源基因置換來修飾。因?yàn)橥ǔＧ闆r下許多包膜蛋白具有細(xì)胞毒作用，因此可使它們僅在誘導(dǎo)型啟動子控制下重建此載體時表達(dá)(參看實(shí)施例)。
一旦形成了RNP或包含RNP的病毒，將這種RNP或病毒再次導(dǎo)入上述輔助細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，從而擴(kuò)增本發(fā)明的復(fù)合體。這種方法包括下面步驟(a)將包含源自副粘病毒的負(fù)鏈單鏈RNA和與所述負(fù)鏈單鏈RNA結(jié)合的蛋白的復(fù)合體導(dǎo)入可表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞，此處的負(fù)鏈單鏈RNA經(jīng)過修飾而不能表達(dá)副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白，(b)培養(yǎng)這種細(xì)胞，并從培養(yǎng)上清液中回收病毒顆粒。
可將RNP與例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺和一種聚陽離子脂質(zhì)體形成一種復(fù)合體，然后導(dǎo)入細(xì)胞。尤其是可應(yīng)用各種轉(zhuǎn)染試劑。這些試劑例如為DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer #1811169)等?？杉尤肼揉苑乐筊NP在內(nèi)體中分解(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 803015)。
一旦在宿主細(xì)胞內(nèi)如此構(gòu)建了一種病毒載體，可通過使表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞與這些細(xì)胞共培養(yǎng)而進(jìn)一步增殖所述載體。如實(shí)施例12所述，優(yōu)選的實(shí)施例是將表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞置于生產(chǎn)病毒之上層的細(xì)胞的方法。
包膜蛋白除了病毒包膜蛋白外，還可應(yīng)用嵌合蛋白，此嵌合蛋白在其胞外區(qū)包含來源于粘附分子、配體、受體蛋白的多肽并因此可粘附于特定細(xì)胞，其胞內(nèi)區(qū)可包含來源于病毒包膜的多肽。因此可生產(chǎn)針對于特定組織的載體。例如，本發(fā)明的病毒載體可包含此載體中所含的病毒基因，此基因經(jīng)修飾能降低抗原性，或提高RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制效力。
本發(fā)明的病毒載體在它們的負(fù)鏈單鏈RNA中可包括編碼外源基因的RNA。需要在靶細(xì)胞中表達(dá)的任意基因可用作外源基因。例如，當(dāng)要進(jìn)行基因治療時，可將治療目標(biāo)疾病的基因插入病毒載體DNA中。在將外源基因插入病毒載體DNA，例如，仙臺病毒載體DNA的情況中，優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄終止序列(E)和轉(zhuǎn)錄起始序列(S)之間插入一個所含核苷酸數(shù)是6的倍數(shù)的序列，等等(《病毒學(xué)雜志》，第67卷，第8期，19934822-4830)。外源基因可插入每個病毒基因(NP、P、M、F、HN和L基因)之前或之后(參看實(shí)施例)。將E-I-S序列(轉(zhuǎn)錄起始序列-間插序列-轉(zhuǎn)錄終止序列)或其部分適當(dāng)插入到外源基因的前面或后面，以便不干擾外源基因前面或后面的基因的表達(dá)。外源基因上游所加入的轉(zhuǎn)錄起始序列的類型，基因插入位點(diǎn)和此基因前面或后面的核苷酸序列均可調(diào)控所插入的外源基因的表達(dá)水平。例如在仙臺病毒中，插入位點(diǎn)距負(fù)鏈RNA的3′-端越近(在野生型病毒基因組的基因排列中，距NP基因越近)，此插入基因的表達(dá)水平則越高。為了確保外源基因高水平的表達(dá)，優(yōu)選在負(fù)鏈基因組的上游區(qū)，諸如在NP基因的上游(負(fù)鏈的3′-端)或NP和P基因之間插入此外源基因。相反，插入位置距負(fù)鏈RNA的5′-端越近(在野生型病毒基因組的基因排列中，距L基因越近)，此插入基因的表達(dá)水平則越低。為了將外源基因的表達(dá)抑制在低水平，可將外源基因插入到負(fù)鏈的5′-端最遠(yuǎn)的地方，即野生型病毒基因組中L基因的下游(負(fù)鏈中鄰近L基因的5′-端)或L基因的上游(負(fù)鏈中鄰近L基因的3′-端)。為了便于外源基因的插入，可在插入位置設(shè)計(jì)一個克隆位點(diǎn)。例如，可將這個克隆位點(diǎn)安排為限制酶的識別序列?？蓪⑼庠椿蚱尾迦刖幋a此基因組的載體DNA中的限制酶位點(diǎn)?？蓪⒋丝寺∥稽c(diǎn)安排為一種所謂的多克隆位點(diǎn)，它包含多個限制酶識別序列。本發(fā)明的載體可在除上述以外的插入位點(diǎn)包含外源基因。
例如可根據(jù)“Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587”和“Yu，D.等，1997，《基因細(xì)胞》2457-466”的如下描述構(gòu)建包含外源基因的重組仙臺病毒載體。
首先，制備包含所需外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA樣品。優(yōu)選在濃度為25ng/μl或更高時，這個DNA樣品可通過電泳確認(rèn)為單一質(zhì)粒。下面描述一個實(shí)例，其中應(yīng)用NotI位點(diǎn)將外源基因插入編碼病毒基因組的DNA中。當(dāng)目標(biāo)cDNA核苷酸序列中包括NotI識別位點(diǎn)時，優(yōu)選事先通過定點(diǎn)誘變等方法修飾這個核苷酸序列來刪除此NotI位點(diǎn)，以便能不改變cDNA編碼的氨基酸序列。所需的基因片段可由該DNA樣品通過PCR方法擴(kuò)增和回收。為了使所擴(kuò)增DNA片段的兩個末端均具有NotI位點(diǎn)，并進(jìn)一步其中一個末端添加仙臺病毒的一個拷貝的轉(zhuǎn)錄終止序列(E)、間插序列(I)和轉(zhuǎn)錄起始序列(S)(EIS序列)，可制備正向合成DNA序列和反向側(cè)合成DNA序列(反義鏈)作為一對引物，此引物包含NotI限制酶裂解位點(diǎn)序列、轉(zhuǎn)錄終止序列(E)、間插序列(I)、轉(zhuǎn)錄起始序列(S)和目標(biāo)基因的一部分序列。
例如，為確保被NotI裂解，可將正向合成DNA序列安排為，在其5′-側(cè)選擇任意2個或多個核苷酸(優(yōu)選除GCG和GCC，即NotI識別位點(diǎn)的起始序列以外的4個核苷酸，更優(yōu)選ACTT)，在其3′-側(cè)添加NotI識別位點(diǎn)“gcggccgc”，然后在其3′-側(cè)添加任意所需的9個核苷酸或9個核苷酸加上6的倍數(shù)的核苷酸作為間隔序列，再于它們的3′側(cè)添加含所需cDNA的起始密碼子ATG的大約25個核苷酸的ORF。優(yōu)選從所需cDNA選擇約25個核苷酸作為正向合成DNA序列以便在其3′-端有G或C作為末端核苷酸。
在反向合成DNA序列中，在其5′-側(cè)選擇任意2個或多個核苷酸(優(yōu)選除GCG和GCC，即NotI識別位點(diǎn)的起始序列以外的4個核苷酸，更優(yōu)選ACTT)，在其3′-側(cè)添加NotI識別位點(diǎn)“gcggccgc”，并進(jìn)一步在3′-側(cè)添加一種寡DNA作為插入片段以調(diào)節(jié)長度。該寡DNA應(yīng)設(shè)計(jì)為能使總核苷酸數(shù)為6的倍數(shù)，其中包括NotI識別位點(diǎn)“gcggccgc”、cDNA的互補(bǔ)序列和起始于下面所述病毒的仙臺病毒基因組的EIS核苷酸序列(所謂“六的規(guī)則”；Kolakofski，D.等，《病毒學(xué)雜志》72891-899，1998)。進(jìn)一步在所插入片段的3′側(cè)添加仙臺病毒S序列的互補(bǔ)序列，優(yōu)選為5′-CTTTCACCCT-3′；I序列、優(yōu)選為5′-AAG-3′；和與E序列互補(bǔ)的序列，優(yōu)選為5′-TTTTTCTTACTACGG-3′；而且從所需cDNA序列的終止密碼子起沿其反方向選擇含約25個核苷酸的序列的互補(bǔ)序列，調(diào)節(jié)該互補(bǔ)序列的長度以使G和C為其最后的核苷酸，并將此序列加至所插入片段的3′-端，作為反向側(cè)合成DNA的3′-端。
可應(yīng)用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)以常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)。優(yōu)選應(yīng)用Vent聚合酶(NEB)進(jìn)行PCR，并用NotI酶切消化如此擴(kuò)增的所需片段，然后將它插入質(zhì)粒載體pBluescript的NotI位點(diǎn)。用測序儀確定由此獲得的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，以選擇具有正確序列的質(zhì)粒。應(yīng)用NotI從此質(zhì)粒中切除所插入的片段，并將此片段克隆至攜帶包膜基因缺陷型基因組cDNA的質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)?；蛘?，也可不經(jīng)質(zhì)粒載體pBluescript，直接將此片段插入NotI位點(diǎn)，而獲得重組仙臺病毒cDNA。
也可在試管或細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的病毒載體DNA，重建具有病毒L、P和NP蛋白的RNP，和生成包含這種RNP的病毒載體。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法、應(yīng)用表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞，可由病毒載體DNA重建病毒(WO97/16539和97/16538Durbin，A.P.等，1997，《病毒學(xué)》235323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell，M.J.等，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F(xiàn).等，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.等，1996，基因細(xì)胞1569-579；Baron，M.D.和Barrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9315400-15404)。當(dāng)使病毒載體DNA在F、HN和/或M基因中有缺陷時，這種缺陷載體不能形成感染性病毒顆粒。然而，也可分別將這些缺陷基因、編碼其它病毒包膜蛋白的基因等等轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，并在此宿主細(xì)胞中對它們進(jìn)行表達(dá)，來形成感染性病毒顆粒。
將病毒載體DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的方法包括1)制備目標(biāo)細(xì)胞可吸收的DNA沉淀物的方法；2)制備含復(fù)合體的DNA的方法，所述復(fù)合體適于被目標(biāo)細(xì)胞吸收、細(xì)胞毒性不是很強(qiáng)并帶正電荷；3)即刻間在目標(biāo)細(xì)胞膜上鉆孔、通過電脈沖其寬度足以使DNA分子通過的方法。
在方法2)中，可應(yīng)用各種轉(zhuǎn)染試劑，例如DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)等。方法1)的實(shí)例是一種應(yīng)用磷酸鈣的轉(zhuǎn)染方法，在此方法中，將進(jìn)入細(xì)胞的DNA摻入吞噬體中，在核中也摻入足夠量(Graham，F(xiàn).L.和Van Der Eb，J.，1973，《病毒學(xué)》52456；Wigler，M.和Silverstein，S.，1977，《細(xì)胞》11223)。Chen和Okayama研究了轉(zhuǎn)移技術(shù)的最佳方法，他們報道最佳DNA沉淀物可在下面條件下獲得1)在35℃、大氣中CO2比例為2至4％的條件下，將細(xì)胞與DNA一起培養(yǎng)15至24小時，2)應(yīng)用比線性DNA具有更高沉淀物形成活性的環(huán)形DNA，和3)沉淀物混合物中DNA濃度為20至30μg/ml(Chen，C.和Okayama，H.，1987，《分子細(xì)胞生物學(xué)》72745)。方法2)適宜于瞬間轉(zhuǎn)染。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知一種舊方法，在這種方法中，按照所需DNA濃度的比率制備DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885，M.W.5×105)混合物以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。因?yàn)榇蟛糠謴?fù)合體在內(nèi)體中分解，所以可加入氯喹以提高轉(zhuǎn)染效果(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。方法3)是指電穿孔法，它比方法1)和方法2)更通用，因?yàn)樗鼪]有細(xì)胞選擇性。方法3)在脈沖電流時間、脈沖形狀、電場電位(兩電極間的電位差，電壓)、緩沖劑的導(dǎo)電性、DNA濃度和細(xì)胞密度的最佳條件下是高效的。
在上述3類中，轉(zhuǎn)染試劑(方法2))適宜于本發(fā)明，這是因?yàn)榉椒?)易于操作，且易于用大量細(xì)胞進(jìn)行多個檢驗(yàn)樣品的檢測。優(yōu)選應(yīng)用Superfect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN，產(chǎn)品編號301305)或DOSPER脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer Mannheim，產(chǎn)品編號1811169)。
尤其是，可按照下面所述由cDNA重建病毒載體。
在24孔至6孔塑料培養(yǎng)板或直徑100mm的培養(yǎng)皿上，應(yīng)用含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100單位/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)培養(yǎng)猴腎源LLC-MK2細(xì)胞，使其鋪滿率達(dá)70％-80％，并例如用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒vTF7-3以2PFU/細(xì)胞進(jìn)行感染。該病毒已在1μg/ml補(bǔ)骨脂素存在下，應(yīng)用UV照射處理20分鐘而滅活(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126，1986；Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1569-579，1996)。可以適當(dāng)調(diào)節(jié)補(bǔ)骨脂素的加入量和UV照射時間。感染1小時后，應(yīng)用質(zhì)粒(24至0.5μg的pGEM-N、12至0.25μg的pGEM-P和24至0.5μg的pGEM-L，優(yōu)選1μg的pGEM-N、0.5μg的pGEM-P和1μg的pGEM-L)(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1569-579，1996)與Superfect(QIAGEN)一起通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法以2至60μg、優(yōu)選3至5μg上述重組仙臺病毒cDNA轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，所述質(zhì)粒能表達(dá)全長仙臺病毒基因組的產(chǎn)生所需要的反式作用病毒蛋白。在無血清MEM中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如果需要，無血清MEM中可含有利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)各100μg/ml，優(yōu)選僅含有40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，而且將試劑的濃度設(shè)定在最佳、以使痘苗病毒的細(xì)胞毒性最小，并且使病毒的回收率最大(Kato，A.等，1996，《基因細(xì)胞》1569-579)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)約48至72小時以后，回收這些細(xì)胞，反復(fù)凍融3個循環(huán)以破壞細(xì)胞，將它們轉(zhuǎn)染至表達(dá)包膜蛋白的LLC-MK2細(xì)胞，并且培養(yǎng)。培養(yǎng)3至7天后，收集培養(yǎng)液?；蛘?，通過用表達(dá)NP、L和P蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已表達(dá)了包膜蛋白的LLC-MK2細(xì)胞，或者與包膜表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染，可更高效地獲得感染性病毒載體。通過培養(yǎng)鋪在表達(dá)包膜蛋白的LLC-MK2細(xì)胞上的這些細(xì)胞，可擴(kuò)增病毒載體(參見實(shí)施例)。通過“內(nèi)點(diǎn)稀釋法”測定血凝素(HA)活性可測定培養(yǎng)上清液中所含病毒的滴度(Kato，A.等，1996，《基因細(xì)胞》1569-579)?？稍?80℃下儲存由此獲得的病毒貯存物。
本發(fā)明的重組仙臺病毒載體可應(yīng)用例如生理鹽水和磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)適當(dāng)稀釋以制備一種組合物。當(dāng)本發(fā)明重組仙臺病毒載體在雞胚等中增殖時，此組合物可包括絨毛尿囊液。含有本發(fā)明重組仙臺病毒載體的組合物可含有生理上可接受的介質(zhì)，諸如去離子水、5％葡萄糖水溶液等等，而且還可進(jìn)一步含有穩(wěn)定劑和抗生素。
對用于病毒重建的宿主細(xì)胞類型不做特別地限制，只要病毒載體可在其中重建即可。例如，在仙臺病毒載體的重建中，可應(yīng)用諸如猴腎源CV-T細(xì)胞和LLC-MK2細(xì)胞、倉鼠腎源BHK細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞。通過在這些細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)包膜蛋白還可獲得具有包膜的感染性病毒顆粒。為了獲得大量仙臺病毒載體，可以擴(kuò)增此載體，例如通過用從上述宿主細(xì)胞中獲得的病毒載體與表達(dá)包膜基因的載體一起感染雞胚?；蛘撸蓱?yīng)用摻入包膜蛋白基因的轉(zhuǎn)基因雞胚生產(chǎn)病毒載體。已經(jīng)開發(fā)了應(yīng)用雞胚生產(chǎn)病毒載體(Nakanishi，等(eds.)，1993，神經(jīng)學(xué)研究的高技術(shù)協(xié)議III，《分子神經(jīng)細(xì)胞生理學(xué)》，厚生社，大阪，153-172)。具體是，例如將受精卵放在孵化器中，37℃至38℃孵化9至12天以使胚胎發(fā)育。將仙臺病毒載體與表達(dá)包膜蛋白的載體一起接種到雞胚的絨毛尿囊腔中，并將它們培養(yǎng)幾天以增殖病毒。可根據(jù)所用重組仙臺病毒類型的不同改變培養(yǎng)時間的長短等條件。隨后，回收含有病毒的絨毛尿囊液。按照常規(guī)方法進(jìn)行仙臺病毒載體的分離和純化(Tashiro，M.，“病毒實(shí)驗(yàn)方案”，Nagai和Ishihama(編)，Medicalview，68-73頁，(1995))。
作為表達(dá)包膜蛋白的載體，可以使用本發(fā)明病毒載體本身。例如，當(dāng)將病毒基因組中包膜基因有不同缺陷的兩類載體轉(zhuǎn)移至同一個細(xì)胞時，一種RNP復(fù)合體中缺陷的包膜蛋白可由與此互補(bǔ)的另一種復(fù)合體的表達(dá)來提供，由此導(dǎo)致感染性病毒顆粒的形成和復(fù)制循環(huán)的激活從而擴(kuò)增病毒載體。也就是，當(dāng)兩種或多種載體聯(lián)合接種至細(xì)胞使得彼此互補(bǔ)包膜蛋白時，分別有包膜蛋白缺陷的病毒載體的混合物可大量產(chǎn)生且成本較低。由此生產(chǎn)的混合的病毒可用于疫苗等的生產(chǎn)。由于包膜基因的缺陷，這些病毒比完整病毒的基因組小，所以它們可包含一個長的外源基因。此外，由于這些原本為非感染性的病毒在胞外被稀釋，以及由于難以保持它們的共感染，使它們變得不育，因而有利于控制它們不對環(huán)境造成污染。
所制備的病毒載體利用治療性基因充當(dāng)外源基因時，通過給予此病毒載體可以進(jìn)行基因治療。在本發(fā)明病毒載體的基因治療應(yīng)用中，通過將復(fù)合體直接或間接(來自體內(nèi))給藥，可以表達(dá)具有所要療效的外源基因，或在患者體內(nèi)供應(yīng)不足的內(nèi)源基因。對于外源基因的類型沒有特別的限制，除了編碼蛋白的核酸外，它們還可為不編碼蛋白的核酸，諸如反義核酸或核酶。另外，當(dāng)將編碼與感染性疾病有關(guān)的細(xì)菌或病毒的抗原的基因充當(dāng)外源基因時，通過將這些基因給藥至動物，可在這些動物中誘導(dǎo)免疫力。也就是說，這些基因可用作疫苗。
當(dāng)用作疫苗時，本發(fā)明的病毒載體可以應(yīng)用于例如癌癥、感染性疾病和其他一般疾病。例如，當(dāng)治療癌癥時，通過使用本發(fā)明的載體，可以在腫瘤細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞(APC)例如DC細(xì)胞上表達(dá)具有治療作用的基因。這樣的基因的實(shí)例是那些編碼腫瘤抗原Muc-1或Muc-1樣突變子(mutin)串聯(lián)重復(fù)肽的基因(美國專利第5,744,144)、編碼黑素瘤gp100抗原等的基因。這樣的基因治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于乳腺、結(jié)腸、胰腺、前列腺、肺等部位的癌癥。在基因治療中聯(lián)合使用細(xì)胞因子以增強(qiáng)佐劑作用也是有效的。這樣的基因的實(shí)例是i)單鏈IL-12和IL-2聯(lián)用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15)8591-8596，1999)，ii)干擾素-γ與IL-2聯(lián)用(美國專利第5,798,100)，iii)單獨(dú)使用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，和iv)針對腦腫瘤治療的GM-CSF與IL-4聯(lián)用(《神經(jīng)外科雜志》，90(6)，1115-1124(1999))等。
用于治療感染性疾病的基因?qū)嵗蔷幋a以下蛋白的基因，所述蛋白有流感病毒毒力株H5N1的包膜蛋白、日本腦炎病毒的包膜嵌合蛋白(《疫苗》，第17卷，第15-16期，1869-1882(1999))、AIDS病毒的HIV gag或SIV gag蛋白(《免疫學(xué)雜志》(2000)，第164卷，4968-4978)、HIV包膜蛋白(其已摻入聚乳酸-乙二醇共聚物微粒中作為口服疫苗給藥)(Kaneko，H.等，《病毒學(xué)》267，8-16(2000))、霍亂毒素B亞單位(CTB)(Arakawa，T.等，《自然生物工程》(1998)16(10)934-8；Arakwa，T.等，《自然生物工程》(1998)16(3)292-297)、狂犬病毒的糖蛋白(Lodmell，D.L.等，1998，《天然藥物》4(8)949-52)和引起宮頸癌的人乳頭瘤病毒6型的衣殼蛋白L1(《醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志》，60，200-204(2000)。
基因治療還可以應(yīng)用于一般疾病。例如，在糖尿病的情況下，已在I型糖尿病動物模型上通過接種編碼胰島素肽片段的質(zhì)粒DNA完成了此肽的表達(dá)(Coon，B.等，《臨床研究雜志》，1999，104(2)189-94)。


附圖1的照片顯示通過F蛋白Cre-Loxp-誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)的Western印跡結(jié)果。它顯示了在與抗Sev-F抗體交叉反應(yīng)的轉(zhuǎn)移膜上通過化學(xué)發(fā)光方法檢測蛋白的結(jié)果。
附圖2顯示F蛋白的細(xì)胞表面展示的分析結(jié)果，此蛋白的表達(dá)通過Cre-Loxp系統(tǒng)誘導(dǎo)。它表明了用抗SeV-F抗體對LLC-MK2/F7的流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果。
附圖3的照片顯示通過Western印跡證實(shí)所表達(dá)的F蛋白被胰蛋白酶裂解的結(jié)果。
附圖4的照片顯示在紅細(xì)胞表面吸附實(shí)驗(yàn)中證實(shí)的HN的細(xì)胞表面表達(dá)。
附圖5的照片顯示使用表達(dá)缺陷蛋白的細(xì)胞收獲缺陷型病毒的實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果。它揭示了用于F-缺陷型SeV重建的痘苗病毒可以快速阻止輔助細(xì)胞系的F蛋白表達(dá)。
1.LLC-MK2和CV-1代表相應(yīng)的細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物。
2.LLC-MK2/F+ad和CV-1/F+ad代表已進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)并已加入了腺病毒AxCANCre的相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。
3.LLC-MK2/F-ad和CV-1/F-ad代表已導(dǎo)入F基因但不含腺病毒AxCANCre的相應(yīng)細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物。
4.LLC-MK2/F+ad 3rd代表一種細(xì)胞裂解物，所述細(xì)胞已由腺病毒AxCANCre誘導(dǎo)表達(dá)并已再傳代3次。
5.1d和3d分別表示誘導(dǎo)表達(dá)后1天和3天。
6.Vac1d和Vac3d分別表示痘苗病毒感染后1天和3天的細(xì)胞。
7.AraC1d和AraC3d分別表示添加了AraC后1天和3天的細(xì)胞。
8.CHX 1d和CHX 3d分別表示添加了蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺后1天和3天的細(xì)胞。
附圖6的照片顯示將含有GFP的F-缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)轉(zhuǎn)染未表達(dá)F的LLC-MK2細(xì)胞后觀察GFP表達(dá)(RNP檢測)的結(jié)果。在對照組中，F(xiàn)基因在3′端用NP基因改組，然后使用SeV cDNA(F改組型SeV)，其中已將GFP引入F缺陷位點(diǎn)。標(biāo)志“all”表示用指導(dǎo)NP基因、P基因和L基因表達(dá)的質(zhì)粒(pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L)和SeV cDNA同時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；“cDNA”表示僅用cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在RNP轉(zhuǎn)染中，收集表達(dá)GFP的P0細(xì)胞；將所述細(xì)胞(107細(xì)胞/ml)懸浮在Opti-MEM(GIBCO BRL)中；凍-融3次所得裂解物取100μl與25μl陽離子脂質(zhì)體DOSPER(Boehringer Mannheim)混合，室溫靜置15分鐘；將該混合物加入已經(jīng)誘導(dǎo)了F表達(dá)的細(xì)胞(+ad)中，以實(shí)現(xiàn)RNP轉(zhuǎn)染。表達(dá)Cre DNA重組酶的細(xì)胞(其中未引入重組腺病毒〕用作對照細(xì)胞(-ad)。結(jié)果顯示GFP的表達(dá)取決于LLC-MK2的P0細(xì)胞中Sev RNP的生成；F缺陷型病毒的擴(kuò)增取決于F在P1中表達(dá)的誘導(dǎo)。
附圖7的照片顯示F-缺陷型基因組cDNA重建的功能性RNP是否可以通過表達(dá)F的輔助細(xì)胞來拯救并形成該缺陷病毒的感染性病毒顆粒的研究結(jié)果。RNP/o代表包覆了RNP的細(xì)胞；RNP/t代表用RNP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
附圖8的照片顯示F表達(dá)細(xì)胞中F缺陷病毒的特異性生長證據(jù)。如實(shí)施例2所述將含有由從缺乏該基因的基因組構(gòu)建的功能性RNP的裂解物脂質(zhì)轉(zhuǎn)染至表達(dá)F的細(xì)胞中；然后回收此培養(yǎng)物上清液。將此培養(yǎng)物上清液加入表達(dá)F的細(xì)胞的培養(yǎng)基中以完成感染；在第三天，回收培養(yǎng)物上清液，并同時加入表達(dá)F的細(xì)胞和沒有表達(dá)F的細(xì)胞；然后在有或沒有胰蛋白酶存在的條件下將這些細(xì)胞培養(yǎng)3天。結(jié)果顯示于此。病毒僅在有胰蛋白酶存在的條件下在F表達(dá)細(xì)胞中擴(kuò)增。
附圖9的照片顯示F缺陷病毒在引入表達(dá)F的細(xì)胞后向培養(yǎng)物上清液中的特異性釋放。如實(shí)施例2所述，將含有從缺乏所述基因的基因組中構(gòu)建的功能性RNP的裂解物脂質(zhì)轉(zhuǎn)染至表達(dá)F的細(xì)胞中，然后回收培養(yǎng)物上清液。將此培養(yǎng)物上清液加入表達(dá)F的細(xì)胞的培養(yǎng)基中以實(shí)現(xiàn)感染；在第三天，回收培養(yǎng)物上清液，并同時加入表達(dá)F的細(xì)胞和沒有表達(dá)F的細(xì)胞；然后在有或沒有胰蛋白酶存在下將這些細(xì)胞培養(yǎng)3天。下圖顯示未表達(dá)F的細(xì)胞的上清液的結(jié)果。
附圖10的照片顯示從表達(dá)F的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中回收病毒、提取總RNA并用F和HN作為探針進(jìn)行Northern印跡分析以檢驗(yàn)從F缺陷型cDNA中回收的病毒顆粒的基因組結(jié)構(gòu)的結(jié)果。在從表達(dá)F的細(xì)胞所回收的病毒中，檢測出HN基因，但F基因檢測不到；因此可以明顯看出F基因不存在于病毒基因組中。
附圖11的照片顯示RT-PCR結(jié)果，它說明GFP基因位于F缺失的基因座上，如在cDNA的構(gòu)建中一樣。1+18-NP，證實(shí)了+18NotI位點(diǎn)的存在。2M-GFP，證實(shí)了GFP基因存在于F基因缺陷位點(diǎn)上。3F基因，證實(shí)了F基因的存在。野生型SeV和F缺陷的表達(dá)GFP的SeV的基因組結(jié)構(gòu)顯示于上圖。它證實(shí)了GFP基因存在于F缺陷基因座中，來源于+18的NotI位點(diǎn)存在于NP的3′端，F(xiàn)基因在RNA基因組的任何部分均不存在。
附圖12顯示了如下照片，它是通過使用膠體金結(jié)合型IgG(抗-F、抗-HN)與病毒的F或HN進(jìn)行特異性反應(yīng)后，經(jīng)免疫電鏡檢查而獲得的。可以明顯地看出病毒包膜的刺突樣結(jié)構(gòu)含有F和HN蛋白。
附圖13顯示RT-PCR結(jié)果，它說明除GFP基因外的其他基因的結(jié)構(gòu)均與野生型相同。
附圖14的照片顯示用電子顯微鏡檢查F缺陷病毒顆粒的形態(tài)的結(jié)果。象野生型病毒顆粒一樣，F(xiàn)缺陷病毒顆粒內(nèi)部具有螺旋狀RNP結(jié)構(gòu)和刺突樣結(jié)構(gòu)。
附圖15的照片顯示用高效F缺陷型SeV載體體外基因轉(zhuǎn)移至各種細(xì)胞的結(jié)果。
附圖16顯示將F缺陷型SeV載體引入小鼠(BM c-kit+/-)的原代骨髓細(xì)胞的分析結(jié)果?？招闹鞵E+/GFP-；實(shí)心柱代表PE+/GFP+。
附圖17的照片顯示載體向小鼠腦室體內(nèi)給藥的結(jié)果。
附圖18的照片顯示使用從表達(dá)F的細(xì)胞中回收的含有F缺陷SeV病毒的培養(yǎng)物上清液感染沒有表達(dá)F的LLC-MK2細(xì)胞，在有或沒有胰蛋白酶存在下將這些細(xì)胞培養(yǎng)3天、通過HA試驗(yàn)證實(shí)病毒在上清液中的存在。
附圖19的照片顯示用來自附圖18B的HA陽性雞胚的絨毛尿囊液(泳道11和12)接種雞胚，培養(yǎng)2天后取絨毛尿囊液進(jìn)行HA試驗(yàn)的結(jié)果。
附圖20的照片顯示用免疫電鏡檢查HA陽性無感染性病毒液的結(jié)果。證實(shí)了病毒顆粒的存在，并發(fā)現(xiàn)病毒體包膜與識別膠體金標(biāo)記型HN蛋白的抗體反應(yīng)，但不與識別膠體金標(biāo)記型F蛋白的抗體反應(yīng)。
附圖21的照片顯示將F缺陷病毒顆粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的結(jié)果。
附圖22的照片顯示共表達(dá)F和HN的細(xì)胞的產(chǎn)生，它是用蛋白質(zhì)印跡評價的。LLC/VacT7/pGEM/FHN代表用pGEM/FHN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已被痘苗病毒感染的LLC-MK2細(xì)胞而獲得的細(xì)胞；LLC/VacT7代表痘苗病毒感染的LLC-MK2細(xì)胞。LLCMK2/FHNmix代表引入F和HN基因但未對其克隆的LLC-MK2細(xì)胞。LLC/FHN代表引入了F和HN基因并且通過腺病毒誘導(dǎo)其表達(dá)(3天后)的LLC-MK2細(xì)胞；1-13、2-6、2-16、3-3、3-18、3-22、4-3和5-9是克隆中細(xì)胞系的序號(命名)。
附圖23的照片顯示對病毒的產(chǎn)生取決于pGEM/FHN的存在的證實(shí)結(jié)果?；旌螰HN-缺陷的表達(dá)GFP的SeV cDNA、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN，并將其引入LLC-MK2細(xì)胞中?；蜣D(zhuǎn)移的3小時后，用含有AraC和胰蛋白酶的MEM更換培養(yǎng)基，然后進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞3天?；蜣D(zhuǎn)移的2天后，用體視熒光顯微鏡進(jìn)行觀察以評價因pGEM/FHN存在與否而產(chǎn)生的差異，并根據(jù)GFP表達(dá)細(xì)胞的擴(kuò)散證實(shí)病毒的產(chǎn)生。此結(jié)果顯示于此。當(dāng)在重建時加入pGEM/FHN，可以觀察到GFP表達(dá)的細(xì)胞的擴(kuò)散；但當(dāng)沒有加入pGEM/FHN時，僅僅在單個細(xì)胞中可以觀察到GFP的表達(dá)。
附圖24的照片顯示通過RNP轉(zhuǎn)染的重建結(jié)果和FHN缺陷病毒增殖的結(jié)果。在誘導(dǎo)表達(dá)后的第3天，用P0 RNP上層或者DOSPER對共表達(dá)FHN的細(xì)胞(12個孔)進(jìn)行脂轉(zhuǎn)染，4天后觀察到GFP。當(dāng)進(jìn)行RNP轉(zhuǎn)染時，表達(dá)FHN的P1細(xì)胞成功收獲了病毒，與F缺陷細(xì)胞(最上圖)一樣。細(xì)胞用ADe/Cre感染，6小時或更長時間后，誘導(dǎo)FHN蛋白質(zhì)的表達(dá)，然后將含有FHN-缺陷型表達(dá)的液體接種至所述細(xì)胞，檢驗(yàn)這種病毒的增殖。
附圖25的照片顯示將含有從FHN缺陷但表達(dá)GFP的cDNA重建的病毒的液體接種至LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN，并在有或沒有胰蛋白酶存在下培養(yǎng)它們的結(jié)果。培養(yǎng)3天后，證實(shí)了表達(dá)GFP蛋白的細(xì)胞的擴(kuò)散。結(jié)果顯示于此。僅LLC-MK2/FHN可以觀察到GFP的擴(kuò)散，因此可以證實(shí)在液體中所含的病毒以一種特異于FHN共表達(dá)且依賴于胰蛋白酶的方式生長。
附圖26的照片顯示對來源于FHN表達(dá)細(xì)胞上清液的RNA的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行證實(shí)的結(jié)果。
附圖27的照片顯示對來源于已被FHN缺陷病毒感染的F表達(dá)細(xì)胞上清液的RNA的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行證實(shí)的結(jié)果。
附圖28顯示當(dāng)在補(bǔ)骨脂素/UV照射中補(bǔ)骨脂素濃度發(fā)生變化時痘苗病毒的滅活及T7活性。
附圖29顯示在補(bǔ)骨脂素/UV照射中UV照射時間發(fā)生變化時痘苗病毒的滅活及T7RNA聚合酶活性。
附圖30的照片顯示補(bǔ)骨脂素/UV照射后痘苗病毒的細(xì)胞毒性(CPE)的照片。將3×105LLC-MK2細(xì)胞置于6孔平板上。培養(yǎng)過夜后，用痘苗病毒以感染復(fù)數(shù)(moi)＝2感染細(xì)胞。24小時后，測定CPE。痘苗病毒偽(mock)處理后的CPE顯示于A中；用痘苗病毒處理15分鐘、20分鐘或30分鐘后的CPE分別顯示于B、C和D中。
附圖31顯示痘苗病毒UV照射的時間對仙臺病毒重建效率的影響。
附圖32顯示仙臺病毒重建實(shí)驗(yàn)后在細(xì)胞中所殘留的具有復(fù)制能力的痘苗病毒的滴度。
附圖33顯示利用抗VSV-G抗體進(jìn)行的Western印跡分析結(jié)果。
附圖34顯示利用抗VSV-G抗體進(jìn)行的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析結(jié)果。它顯示了在AxCANCre感染(moi＝0、2.5、5)后第4天LLC-MK2細(xì)胞系(L1)中對VSV-G表達(dá)的誘導(dǎo)作用的分析結(jié)果。所用的第一抗體是抗VSV-G抗體(MoAbI-1)；第二抗體是FITC標(biāo)記的抗小鼠Ig。
附圖35的照片顯示以下結(jié)果，其中用不同量的AxCANCre(MOI＝0、1.25、2.5、5、10)和恒定量的具有F基因缺陷型基因組的假型仙臺病毒感染后，回收上清液，再將此上清液用于在VSV-G誘導(dǎo)前(-)和誘導(dǎo)后(+)感染細(xì)胞，5天后可以觀察到表達(dá)GFP的細(xì)胞。
附圖36顯示病毒產(chǎn)生量隨時間的變化。
附圖37顯示用表達(dá)VSV-G的細(xì)胞系建立的具有F缺陷型基因組的假型仙臺病毒用抗VSV抗體處理的FHN缺陷型仙臺病毒所進(jìn)行的處理對感染性是否具有影響的檢查結(jié)果。
附圖38顯示以下結(jié)果，其中測定GFP基因的表達(dá)并將其作為一種指標(biāo)以確定在用含有GFP基因的F和HN缺陷型仙臺病毒感染VSV-G基因表達(dá)細(xì)胞LLCG-L1后，在衣殼中攜有VSV-G的假型病毒的產(chǎn)生。
附圖39顯示，通過對感染的細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)的Western分析，證實(shí)了在表達(dá)VSV-G基因的細(xì)胞中所增殖的病毒在F和HN基因上具有缺陷。
附圖40顯示熒光顯微鏡下GFP表達(dá)細(xì)胞的觀察結(jié)果。
附圖41顯示通過聯(lián)合使用包膜表達(dá)質(zhì)粒和細(xì)胞上層使SeV/ΔF-GFP的重建效力提高。P0代(傳代前)在第3天至第4天可以觀察到顯著的提高。
附圖42顯示以下結(jié)果，其中對通過聯(lián)合使用表達(dá)包膜的質(zhì)粒和細(xì)胞復(fù)層進(jìn)行的SeV/ΔF-GFP重建的處理?xiàng)l件進(jìn)行評價。陽性GFP細(xì)胞代表了重建病毒的數(shù)量。
附圖43顯示以下結(jié)果，其中對cDNA中的F缺陷仙臺病毒的拯救作用進(jìn)行評價。它表明通過聯(lián)合使用表達(dá)包膜的質(zhì)粒和細(xì)胞復(fù)層、提高了SeV/ΔF-GFP的重建效力。在第7天所有實(shí)驗(yàn)均為陽性。在第3天(其成功的可能性是適中范圍)對其效力進(jìn)行評價。
附圖44表示通過用攜帶LacZ而不含有GFP的F缺陷仙臺病毒載體LacZ表達(dá)的結(jié)果。
附圖45顯示亞克隆仙臺病毒基因組cDNA片段(A)和用新導(dǎo)入的NotI位點(diǎn)(B)構(gòu)建的5種類型仙臺病毒基因組cDNA的結(jié)構(gòu)。
附圖46顯示質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，此質(zhì)粒是為了克隆以增加NotI位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始信號、插入序列和將轉(zhuǎn)錄終止信號轉(zhuǎn)錄入SEAP所使用的。
附圖47顯示每種仙臺病毒載體的噬斑測定結(jié)果。在由LAS1000獲得的噬斑測定中顯示了部分熒光圖。
附圖48表示在每種仙臺病毒中對報道基因(SEAP)表達(dá)水平之差異的比較。SeV18+/SEAP的數(shù)據(jù)取作100，它們分別表示相對值。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)SEAP基因被放置于更下游時，此活性，即表達(dá)水平，降低。
附圖49表示GFP在共表達(dá)FNH的P1細(xì)胞中表達(dá)的顯微照片。
附圖50表示使用了抗F抗體(抗-F)、抗HN抗體(抗-HN)和抗仙臺病毒抗體(抗-SeV)對VSV-G假型SeV/ΔFGFP感染的細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果。
附圖51表示在中和抗體(VGV抗體)存在或不存在下用VSV-G假型SeV感染的F和HN缺陷細(xì)胞的GFP熒光照片。
附圖52為具有F基因缺陷或F基因和HN基因缺陷基因組的VSV-G假型仙臺病毒所作的蛋白質(zhì)分析照片，它是通過密度梯度超速離心分級分離的。
附圖53顯示具有F基因缺陷基因組的仙臺病毒、或具有F基因缺陷或F基因和HN基因缺陷基因組的VSV-G假型仙臺病毒介導(dǎo)的血凝試驗(yàn)的照片。
附圖54表示對具有F基因缺陷基因組的仙臺病毒或VSV-G假型仙臺病毒的培養(yǎng)細(xì)胞感染特異性。
附圖55證實(shí)表達(dá)NGF的F缺陷型仙臺病毒(NGF/SeV/ΔF)結(jié)構(gòu)的照片。
附圖56表明通過用F缺陷SeV感染的攜帶NGF的細(xì)胞所表達(dá)的NGF的活性。在培養(yǎng)的開始，將SeV感染細(xì)胞的稀釋上清液或NGF蛋白(對照)加入初生雞背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)原的分離的培養(yǎng)物中。3天后，通過用線粒體還原活性作為指標(biāo)(n＝3)計(jì)算生長發(fā)育的細(xì)胞數(shù)。所加的培養(yǎng)物上清液的稀釋量相當(dāng)于1/1000。
附圖57表明通過用F缺陷型SeV感染的攜帶NGF的細(xì)胞所表達(dá)的NGF的活性。在培養(yǎng)的開始，將SeV感染細(xì)胞的稀釋上清液或NGF蛋白(對照)加入初生雞背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)原的分離的培養(yǎng)物中。3天后，在顯微鏡下觀察樣品。
(A)對照(不含NGF)；(B)添加NGF蛋白質(zhì)(10ng/mL)；(C)添加NGF/SeV感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(100倍稀釋)；(D)添加NGF/SeV感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(100倍稀釋)；(E)添加NGF/SeV/ΔF感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(100倍稀釋)，(F)添加NGF/SeV/ΔF-GFP感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(100倍稀釋)。
附圖58顯示Ad-Cre感染復(fù)數(shù)和F蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
附圖59表明用Adeno-Cre表達(dá)LLC-MK2/F。
附圖60表明傳代期間表達(dá)的持久性。
附圖61表明傳代期間F蛋白的定位。
附圖62表明GFP-CIU和抗SeV-CIU之間的相互關(guān)系。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式結(jié)合下面實(shí)施例對本發(fā)明詳細(xì)說明，但并不限制于此。
F缺陷型仙臺病毒的構(gòu)建<1>F缺陷型SeV基因組cDNA和表達(dá)F的質(zhì)粒的構(gòu)建用SphI/KpnI消化仙臺病毒(SeV)全長基因組cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，1997，《普通病毒學(xué)雜志》782813-2820)(“pSeV18+b(+)”也被稱作“pSeV18+”)，回收所得的片段(14673bp)并克隆入pUC18，名為質(zhì)粒pUC18/KS。在此pUC18/KS上構(gòu)建F缺陷的位點(diǎn)。通過聯(lián)合使用PCR連接反應(yīng)的方法，完成F基因的缺陷，結(jié)果，去掉了F基因(ATG-TGA＝1698bp)的ORF；因此將如此的atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO1)在EcoT22I位點(diǎn)連接于其上以構(gòu)建F缺陷型SeV基因組cDNA(pSeV18+/ΔF)。在PCR中，將通過使用一個引物對(正向5′-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO2，反向5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO3)所產(chǎn)生的一種PCR產(chǎn)物連接于F的上游，將通過使用一個引物對(正向5′-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO4，反向5′-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ IDNO5)所產(chǎn)生的另一種PCR產(chǎn)物連接于F基因的下游。所得質(zhì)粒用SacI和SalI消化，然后回收此片段(4931bp)，此片段含有F缺陷位點(diǎn)區(qū)域，并克隆入pUC18以產(chǎn)生pUC18/dFSS。用DraIII消化此pUC18/dFSS。回收所得片段，并用一個來自于含有pSeV18+的F基因的區(qū)域的DraIII片段取代；進(jìn)行連接反應(yīng)以產(chǎn)生質(zhì)粒pSeV18+/ΔF。
再者，為了構(gòu)建一個其中已經(jīng)在F缺陷位點(diǎn)上攜帶EGFP基因的cDNA(PSeV18+/ΔF-GFP)，通過PCR將EGFP基因擴(kuò)增。為了建立6的倍數(shù)的EGFP基因(Hausmann，S.等，RNA 2，1033-1045(1996))，對5′端，用一種NsiI尾的引物(5′-atgcatatggtgatgcggttttggcagtacSEQ序列號6)、而對3′端用一種NgoMIV尾的引物(5′-Tgccggctattattacttgtacagctcgtc序列號7)進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物用限制酶NsiI和NgoMIV消化，然后從凝膠中回收此片段；將此片段連接于pUC18/dFSS的F缺陷位點(diǎn)，此位點(diǎn)為NsiI和NgoMIV限制酶位點(diǎn)，并對該序列進(jìn)行測定。去掉含有EGFP基因的DraIII片段，并從此位點(diǎn)回收，并在含有PSeV18+F基因的區(qū)域替代一種DraIII片段；然后進(jìn)行連接以獲得質(zhì)粒PSeV18+/ΔF-GFP。
另一方面，為了獲得質(zhì)粒pCALNdLw/F，通過用PCR擴(kuò)增SeVF基因、確定序列、并插入質(zhì)粒pCALNdlw的唯一位點(diǎn)SwaI，來構(gòu)建用于F基因表達(dá)的Cre/loxP誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒(Arai等，《病毒學(xué)雜志》72，1998，p1115-1121)，其中將基因產(chǎn)物的表達(dá)設(shè)計(jì)為通過Cre DNA重組酶誘導(dǎo)。
<2>誘導(dǎo)SeV-F蛋白質(zhì)表達(dá)的輔助細(xì)胞的制備為了從F缺陷基因組中回收感染的病毒顆粒，建立表達(dá)SeV-F蛋白質(zhì)的輔助細(xì)胞菌株。所采用的細(xì)胞為LLC-MK2細(xì)胞，此細(xì)胞通常用于SeV的增殖、并且是一種來源于猴腎的細(xì)胞菌株。在37℃，5％CO2下，在含有10％熱處理過的固定的胎牛血清(FBS)、青霉素G鈉(50單位/ml)和鏈霉素(50μg/ml)的MEM中培養(yǎng)LLC-MK2細(xì)胞。由于SeV-F基因產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性，按照基因轉(zhuǎn)移方案用磷酸鈣方法(哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene))將上述質(zhì)粒pCALNdLw/F導(dǎo)入LLC-MK2細(xì)胞，此質(zhì)粒pCALNdLw/F是為通過Cre DNA重組酶誘導(dǎo)F基因產(chǎn)物的表達(dá)所設(shè)計(jì)的。
將10μg質(zhì)粒pCALNdLw/F導(dǎo)入在一個10cm的平板上已增殖為40％融合的LLC-MK2細(xì)胞中，用10ml含有10％FBS的MEM于培養(yǎng)箱中，在37℃，5％CO2下，培養(yǎng)該細(xì)胞。24小時后，刮掉該細(xì)胞，并懸浮于10ml介質(zhì)中；然后將此細(xì)胞置于5個MEM(此MEM含有10ml10％FBS和1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)皿中直徑10cm(一個皿含有5ml；兩個皿含有2ml；兩個皿含有0.2ml)以進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2天換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)14天，以選擇其中基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。采用克隆環(huán)回收30個細(xì)胞菌株作為介質(zhì)中所生長的G418抗性細(xì)胞。所得每個克隆在10cm平板上連接培養(yǎng)至細(xì)胞融合。
用表達(dá)Cre DNA重組酶的重組腺病毒AxCANCre對每一個克隆感染后，如下所述，通過蛋白質(zhì)印跡用抗SeV-F蛋白單克隆IgG(f236；《生物化學(xué)雜志》1231064-1072)檢驗(yàn)細(xì)胞的SeV-F蛋白質(zhì)表達(dá)。
在一個6cm皿中增殖融合后，按照Saito等的方法以感染復(fù)數(shù)＝3的腺病毒AxCANCre對每一個克隆進(jìn)行感染(Saito等，《核酸研究》233816-3821(1995)；Arai，T.等，《病毒學(xué)雜志》72，1115-1121(1998))。感染后，對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)3天。棄去培養(yǎng)物上清液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，用一刮刀刮掉細(xì)胞，并通過以1500xg離心5分鐘收集。
細(xì)胞在-80℃下保存，當(dāng)使用時將其融化。將所收集的細(xì)胞懸浮于150μlPBS緩沖液中，然后將同等數(shù)量的裝有緩沖液(0.625 M Tris，pH6.8，5％SDS，25％2-ME，50％甘油，0.025％BPB；Owl)的2x Tris-SDS-BME樣品加入其中。在98℃下熱處理該混合物3分鐘，然后用作電泳樣品。將樣品(1×105細(xì)胞/泳道)通過電泳在SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Multi Gel 10/20，第一化學(xué))中分級分離。通過半干印跡將分級分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至一個PVDF轉(zhuǎn)移膜(Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜；Millipore)上。轉(zhuǎn)移所使用的轉(zhuǎn)移膜是在已經(jīng)在100％甲醇中浸泡30秒并且在水中浸泡30分鐘的轉(zhuǎn)移膜，以1mA/cm2不變的電流下進(jìn)行轉(zhuǎn)移1小時。
將轉(zhuǎn)移膜在含有0.05％吐溫20和1％BSA的封閉溶液(BlockAce；雷印產(chǎn)品)中振蕩1小時，然后用一種抗SeV-F抗體(f236)在室溫下培養(yǎng)2小時，此抗體已經(jīng)用一種含有0.05％吐溫20和1％BSA的封閉溶液稀釋了1000倍。將轉(zhuǎn)移膜用20ml的PBS-0.1％吐溫20振蕩5分鐘，沖洗3次，然后在PBS緩沖液振蕩5分鐘再沖洗。將轉(zhuǎn)移膜在室溫下在10ml過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(山羊抗小鼠IgG；Zymed)中培養(yǎng)1小時，此抗體用含有0.05％吐溫20和1％BSA的封閉溶液稀釋了2000倍。將轉(zhuǎn)移膜用20ml的PBS-0.1％吐溫20振蕩5分鐘沖洗3次，然后用PBS緩沖液振蕩5分鐘再沖洗。
通過化學(xué)發(fā)光方法(ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑；Amersham)在轉(zhuǎn)移膜上對與抗SeV抗體交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖1所示。對AxCANCre特異性感染的SeV-F表達(dá)進(jìn)行了檢測、以證實(shí)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一種SeV-F基因產(chǎn)物表達(dá)的LLC-MK2細(xì)胞。
通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)用一種抗SeV-F抗體、對幾種所得細(xì)胞系中的一種LLC-MK2/F7細(xì)胞，進(jìn)行了分析(附圖2)。也就是說，通過以15,000rpm在4℃下離心5分鐘沉淀1×105個細(xì)胞，并用200μlPBS沖洗，然后使之在PBS中、4℃下與含有100倍稀釋的抗F單克隆抗體(f236)、0.05％疊氮化鈉、2％FCS的FACS(日研化學(xué))避光反應(yīng)1小時。將此細(xì)胞再以15,000rpm在4℃下沉淀5分鐘，用200μlPBS沖洗，然后在冰上使之與1μg/ml的FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG(CAPPEL)反應(yīng)30分鐘。然后再用200μlPBS沖洗細(xì)胞，并接著通過以15,000rpm在4℃下離心5分鐘沉淀。將此細(xì)胞懸浮于1mlFACS的PBS中，然后通過使用EPICS ELITE(Couter)氬激光在488nm的激發(fā)波長和525nm的熒光波長對細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果顯示LLC-MK2/F7以特異性誘導(dǎo)SeV-F基因表達(dá)的方式對抗體具有高的反應(yīng)性，因此證實(shí)了SeV-F蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面的表達(dá)。
對由輔助細(xì)胞表達(dá)的SeV-F蛋白質(zhì)功能的確認(rèn)對由輔助細(xì)胞誘導(dǎo)的SeV-F蛋白質(zhì)是否保持原來的蛋白質(zhì)功能進(jìn)行試驗(yàn)。
在將LLC-MK2/F7細(xì)胞播種于一個6cm皿并增殖至融合后，按照Saito等的方法以感染復(fù)數(shù)＝3用腺病毒AxCANCre感染(如上所述)。然后，在一個培養(yǎng)箱中，在37℃、5％CO2條件下，在含有胰蛋白酶(7.5μg/ml；GIBCOBRL)的MEM(不含血清)中培養(yǎng)該細(xì)胞3天。
棄去培養(yǎng)物上清液，將細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗兩次，用一刮刀刮掉，并通過以1500xg離心5分鐘收集。如上所述(附圖3)通過蛋白質(zhì)印跡證實(shí)表達(dá)F的蛋白質(zhì)通過胰蛋白酶發(fā)生了裂解。合成SeV-F蛋白質(zhì)作為F0，F(xiàn)0是一種沒有活性的蛋白質(zhì)前體，然后在通過胰蛋白酶發(fā)生酶解被消化為兩個亞單位F1和F2后，此前體被活化。在如此誘導(dǎo)F蛋白質(zhì)表達(dá)后，LLC-MK2/F2細(xì)胞象普通細(xì)胞一樣連續(xù)表達(dá)F蛋白質(zhì)，甚至在傳代后，觀察到?jīng)]有出現(xiàn)由表達(dá)F蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，表達(dá)F蛋白質(zhì)的細(xì)胞也沒有出現(xiàn)細(xì)胞融合。然而，當(dāng)SeV-HN表達(dá)質(zhì)粒(pCAC/SeV-HN)被轉(zhuǎn)染至表達(dá)F的細(xì)胞并且將該細(xì)胞在含有胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)3天后，可以頻繁地觀察到細(xì)胞融合。紅細(xì)胞在細(xì)胞表面的吸收實(shí)驗(yàn)(血吸收測定；Had測定)中證實(shí)了HN在細(xì)胞表面上的表達(dá)(附圖4)。也就是說，以1ml/皿的濃度向培養(yǎng)物細(xì)胞中加入1％雞紅細(xì)胞，并將該混合物在4℃下靜置10分鐘。用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞三次，然后觀察到紅細(xì)胞菌落在細(xì)胞表面上。對于紅細(xì)胞聚集于其上的細(xì)胞，可以觀察到細(xì)胞融合；我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合是通過F蛋白質(zhì)與HN的相互作用誘導(dǎo)的；因此它說明F蛋白質(zhì)(它的表達(dá)在LLC-MK2/F7中持續(xù))保持有其原有的功能。
具有F缺陷型基因組的功能性RNP和病毒顆粒的形成為了從缺陷型病毒中回收病毒顆粒，有必要使用表達(dá)缺陷蛋白質(zhì)的細(xì)胞。因此，嘗試用表達(dá)缺陷蛋白質(zhì)的細(xì)胞回收此缺陷病毒時，但是我們發(fā)現(xiàn)通過輔助細(xì)胞系的F蛋白質(zhì)的表達(dá)由于在F缺陷SeV中所用的痘苗病毒而很快停止(附圖5)，因此基于從輔助細(xì)胞系中直接供應(yīng)F蛋白質(zhì)的病毒重建失敗了。曾經(jīng)有報道痘苗病毒的復(fù)制能力喪失，但是通過在所加入的補(bǔ)骨脂素(PLWUV處理)的存在下用長波長的紫外光(長波長UV)處理痘苗病毒(Tsung等，《病毒學(xué)雜志》70，165-171，1996)，T7表達(dá)的活性沒有減弱。因此，嘗試通過使用PLWUV處理的痘苗病毒(PLWUV-VacT7)進(jìn)行病毒的重建。裝有5個15瓦燈泡的UV Stratalinker 2400(商品目錄編號400676(100V)；Stratagene，La Jolla，CA，美國)用于紫外光照射。結(jié)果表明重建中所用的表達(dá)F的細(xì)胞抑制了F蛋白質(zhì)的表達(dá)，但是用此PLWUV-VacT7重建的細(xì)胞的裂解物被感染至輔助細(xì)胞后，痘苗在araC存在下幾乎不生長，我們還發(fā)現(xiàn)通過輔助細(xì)胞系的F蛋白質(zhì)的表達(dá)幾乎不受影響。再者，使用此PLWUV-VacT7的重組野生型SeV的重建，可以從甚至103的細(xì)胞中回收病毒，然而通過以前的方法，這是不可能的，除非具有105或更多的細(xì)胞，這樣大大提高了病毒重建的效力。因此，使用此方法嘗試了F缺陷SeV病毒的重建。
<F缺陷SeV病毒的重建和擴(kuò)增>
按照6n原則以下述的方式用上面提到的增強(qiáng)的綠熒光蛋白質(zhì)(EGFP)基因被導(dǎo)入其中作為報道基因的pSeV18+/ΔF-GFP，將LLC-MK2細(xì)胞轉(zhuǎn)染入其中F缺陷位點(diǎn)后，觀察了GFP的表達(dá)。我們還評價了病毒來源的基因NP、P和L(它們是形成RNP所需要的三種成分)所產(chǎn)生的影響。
以5×106細(xì)胞/皿的濃度，將LLC-MK2細(xì)胞播種于一個100mm的培養(yǎng)皿上，并培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)完成后，用補(bǔ)骨脂素處理細(xì)胞，并用長波長(365nm)的紫外光照射20分鐘，在室溫下，用表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國83，8122-8126(1986))感染細(xì)胞1小時(感染復(fù)數(shù)＝2)(感染復(fù)數(shù)＝2至3；優(yōu)選感染復(fù)數(shù)＝2)。沖洗細(xì)胞三次后，將質(zhì)粒pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1，569-579(1996))分別懸浮于數(shù)量為12μg、4μg、2μg和4μg/皿的最適MEM(GIBCO)中；向其中加入SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(1μgDNA/5μl SuperFect；QIAGEN)，在室溫下靜置混合物10分鐘；最后將其加入3ml含有3％FBS的最適MEM中，將細(xì)胞加入其中并培養(yǎng)。使用野生型SeV基因組cDNA(p SeV(+))進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1，569-579(1996))作為代替pSeV18+/ΔF-GFP的對照。培養(yǎng)3小時后，用不含血清的MEM沖洗細(xì)胞兩次，然后在含有胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，40μg/ml；Sigma)和胰蛋白酶(7.5μg/ml；GIBCO)的MEM中培養(yǎng)70小時。收集這些細(xì)胞，并將此粒狀沉淀懸浮于最適MEM(107細(xì)胞/ml)中。凍融處理重復(fù)三次后，將細(xì)胞與脂轉(zhuǎn)染試劑DOSPER(Borhringer Mannheim)(106細(xì)胞/25μl DOSPER)混合，并在室溫下靜置15分鐘。然后轉(zhuǎn)染至能夠表達(dá)F的LLC-MK2/F7細(xì)胞系(在12孔的平板中，106細(xì)胞/孔)，然后在不血清的(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶MEM中培養(yǎng)細(xì)胞。
結(jié)果表明只有當(dāng)所有的三種來源于病毒的成分NP、P和L均存在時，才可以證實(shí)GFP的表達(dá)，才能夠產(chǎn)生表達(dá)外源基因的缺陷病毒RNP(附圖6)。
<F缺陷型病毒顆粒的確認(rèn)>
我們研究可通過上述方法由F缺陷基因組cDNA重組的功能性RNP，是否可以由表達(dá)F的輔助細(xì)胞拯救并形成F缺陷病毒的感染性病毒顆粒。將細(xì)胞裂解物與陽離子脂質(zhì)體混合；在其中功能性RNP已經(jīng)形成的條件(其中pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L被同時轉(zhuǎn)染的條件)下，或在功能性RNP沒有形成的條件(其中兩種質(zhì)粒pSeV18+/ΔF-GFP和pGEM/NP被轉(zhuǎn)染的條件)下，如上所述，通過冷凍/融化從重建的細(xì)胞中制備裂解物；將此裂解物質(zhì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染入表達(dá)F的細(xì)胞和無表達(dá)細(xì)胞中；基于表達(dá)GFP細(xì)胞破壞的擴(kuò)展，可以觀察到病毒顆粒的產(chǎn)生。結(jié)果顯示只有當(dāng)通過使用一種在其中功能性RNP被重建的條件下所獲得的裂解物導(dǎo)入表達(dá)F的細(xì)胞時，才可識別表達(dá)GFP細(xì)胞的分布擴(kuò)展(附圖7)。再者，甚至在噬斑測定中，僅僅在此相同條件下，觀察到噬斑的形成。從這些結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)從F缺陷病毒基因組中產(chǎn)生的功能性RNP、在來源表達(dá)F細(xì)胞蛋白質(zhì)的存在下，還可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為感染性病毒顆粒，并且此顆?？梢詮募?xì)胞中釋放。
下列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了感染性F缺陷病毒顆粒存在于培養(yǎng)物上清液中。如實(shí)施例2所述，將含有從F基因缺陷型基因組中構(gòu)建的功能性RNP的裂解物脂質(zhì)轉(zhuǎn)染至表達(dá)F的細(xì)胞，并回收培養(yǎng)物上清液。將此培養(yǎng)物上清液加入表達(dá)F細(xì)胞的培養(yǎng)基中以達(dá)到感染；在第三天，回收此培養(yǎng)物上清液，同時加入表達(dá)F細(xì)胞和非表達(dá)F細(xì)胞中；然后在有或沒有胰蛋白酶存在下對此細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)三天。在表達(dá)F的細(xì)胞中，病毒僅僅在胰蛋白酶存在下被擴(kuò)增(附圖8)。還發(fā)現(xiàn)沒有感染的病毒顆粒被釋放到非表達(dá)F的細(xì)胞的上清液中(在附圖9的底面)或從沒有胰蛋白酶所培養(yǎng)的表達(dá)F的細(xì)胞中釋放。上述總結(jié)如下F缺陷表達(dá)GFP病毒的增殖對表達(dá)F的細(xì)胞具有特異性，并且取決于胰蛋白酶的蛋白酶解。如此增殖的感染性F缺陷型的仙臺病毒的滴度范圍為0.5×107至1×107CIU/ml。
F缺陷型表達(dá)GFP病毒的分析為了證實(shí)從F缺陷cDNA中回收的病毒顆?；蚪M結(jié)構(gòu)，從表達(dá)F細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中回收病毒，提取總RNA，然后用F和HN作為探針進(jìn)行RNA印跡分析。結(jié)果顯示在從表達(dá)F的細(xì)胞中收集的病毒中，可以檢測到HN基因，但是檢測不到F基因，而且F基因在病毒的基因組中不存在(附圖10)。再者，通過RT-PCR的GFP基因，可以證實(shí)該基因存在于F缺陷基因座中，正如在cDNA的構(gòu)建中所示(附圖11)。其他基因的結(jié)構(gòu)與那些來源于野生型的相同?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，表明在病毒的重建中，沒有發(fā)生基因組的重排。另外，通過電子顯微鏡研究了回收的F缺陷病毒顆粒的形態(tài)。象野生型病毒一樣，F(xiàn)缺陷病毒顆粒其內(nèi)部具有螺旋RNP結(jié)構(gòu)和突起樣結(jié)構(gòu)(附圖14)。而且，通過用特異性地與F或HN反應(yīng)的膠體金共軛IgG(抗F、抗HN)對此病毒進(jìn)行免疫電鏡檢檢測。結(jié)果表明病毒包膜的突起樣結(jié)構(gòu)由F和HN蛋白組成(附圖12)，它表明由輔助細(xì)胞產(chǎn)生的F蛋白質(zhì)被有效地?fù)饺氩《绢w粒。此結(jié)果將詳細(xì)描述于下。
<總RNA的提取、RNA印跡分析和RT-PCR>
使用OIAamp病毒RNA迷你試劑盒(QIAGEN)在病毒感染表達(dá)F的細(xì)胞LLC-MK2/F7 3天后所獲得的培養(yǎng)物上清液中按照方案提取總RNA。在一種含有甲醛的1％變性的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離提純總RNA(5μg)，然后轉(zhuǎn)移至一個真空印跡裝置中的一個Hybond-N+膜(Amersham-Pharmacia)上。用0.05M NaOH固定所制備的膜，用2倍稀釋的SSC緩沖液漂洗(Nacalai tesque)，然后在一種雜交溶液(Boehringrer Mannheim)中進(jìn)行預(yù)雜交30分鐘；將一個通過使用毛地黃毒苷(DIG)-dUTP(堿敏感性)的隨機(jī)原始DNA標(biāo)記(DIG DNA標(biāo)記試劑盒；Boehringrer Mannheim)所制備的F或HN基因的探針加入其中，然后進(jìn)行雜交16小時。然后，沖洗此膜，并使之與堿性磷酸酶標(biāo)記抗DIG抗體(抗毛地黃毒苷-AP)反應(yīng)；通過使用一個DIG檢測試劑盒進(jìn)行分析。結(jié)果表明在從表達(dá)F的細(xì)胞中收集的病毒中，可以檢測出FN基因，但檢測不到F基因；F基因不存在于病毒基因組中(附圖10)。
再者，通過RT-PCR進(jìn)行詳細(xì)的分析。在RT-PCR中，按照方案通過使用SUPERSCRIPTII預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)(Gibco BRL)從純化的病毒RNA中合成第一鏈cDNA；對于LA PCR試劑盒(TAKARA ver2.1)使用下面的PCR的條件94℃/3分鐘；94℃/45秒、55℃/45秒、72℃/90秒的擴(kuò)增30個循環(huán)；在72℃下培養(yǎng)10分鐘；然后將樣品在2％瓊脂糖凝膠上以100v電泳30分鐘，用溴乙錠染色并照相。用于證實(shí)M基因和EGFP被插入F缺陷位點(diǎn)所用的引物是正向15′-atcagagacctgcgacaatgc(SEQ ID NO8)和反向15′-aagtcgtgctgcttcatgtgg(SEQ ID NO9)；用于證實(shí)EGFP被插入F缺陷位點(diǎn)和HN基因是正向25′-acaaccactacctgagcacccagtc(SEQ ID NO10)和反向25′-gcctaacacatccagagatcg(SEQ ID NO11)；M基因和HN基因之間的連接通過使用正向35′-acattcatgagtcagctcgc(SEQ ID NO12)和反向2引物(SEQ IDNO11)而證實(shí)。結(jié)果表明GFP基因存在于F的缺陷基因座中，如cDNA的構(gòu)建中所示(附圖11)，其他基因的結(jié)構(gòu)均與那些來源于野生型的相同(附圖13)。從上面可以明顯地看出在病毒重建期間，基因組沒有發(fā)生重排。
<用膠體金免疫標(biāo)記的IgG進(jìn)行的電鏡分析>
通過電鏡研究回收的F缺陷病毒顆粒的形態(tài)。首先，將用缺陷型病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液以28,000rpm離心30分鐘獲得病毒的粒狀沉淀；將此粒狀沉淀以1×109HAU/ml的濃度再懸浮于10倍稀釋的PBS中；將一滴懸浮液滴入具有支持濾膜的微柵極上，然后在室溫下將此柵極干燥；為固定，用含有3.7％福爾馬林的PBS固定15分鐘，然后用含有0.1％BSA的PBS溶液預(yù)處理30分鐘；而且，將用相同的溶液稀釋200倍的抗F單克隆抗體(f236)或抗HN單克隆抗體(Miura，N.等，《實(shí)驗(yàn)研究》(1982)141409-420)滴在柵級上，同樣使之在一種潮濕的條件下反應(yīng)60分鐘。然后，用PBS沖洗柵級，然后滴進(jìn)稀釋了200倍的膠體金標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體，并使之在一種潮濕的條件下反應(yīng)60分鐘。先用PBS然后用無菌蒸餾水沖洗柵級，并在室溫下空氣干燥；將4％乙酸鈾溶液置于柵級上染色2分鐘，并將柵級干燥；用JEM-1200EXII電子顯微鏡(日本電子)觀察照相。結(jié)果表明可以明顯地看出病毒包膜的突起樣結(jié)構(gòu)由F和HN蛋白組成(附圖12)，這說明由輔助細(xì)胞產(chǎn)生的F蛋白質(zhì)被有效地?fù)饺胫敛《绢w粒中。另外，象野生型病毒一樣，F(xiàn)缺陷病毒顆粒內(nèi)部具有螺旋RNP結(jié)構(gòu)和突起樣結(jié)構(gòu)(附圖14)。
體外經(jīng)F-缺陷型SeV載體將基因高效轉(zhuǎn)移至各種細(xì)胞<導(dǎo)入大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞>
按照如下方法制備和培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞用乙醚深度麻醉懷孕18天的一個SD大鼠(SPF/VAF CrjCD，雌性，332g，約9周；Charles River)，然后從腋窩動脈放血將其處死。將其腹部剖開，然后從子宮內(nèi)取出胎兒。切開顱部皮膚和骨頭，取其大腦。在立體顯微鏡下將大腦半球轉(zhuǎn)移至工作液DMEM(含有5％馬血清、5％小牛血清和10％DMSO)中；切片，并在其中加入一種冰凍木瓜蛋白酶溶液(1.5U，0.2mg半胱氨酸、0.2mg牛血清白蛋白、5mg葡萄糖、0.1mg/ml DNase)；在32℃將含有這種切片組織的溶液培育15分鐘，同時每5分鐘顛倒小瓶以搖動此溶液。在證實(shí)了懸浮液變得足夠混濁、且組織切片變得半透明后，通過移液將這些組織切片壓成小碎片。在32℃以1200rpm將此懸浮液離心5分鐘，然后在B27-補(bǔ)充神經(jīng)基本培養(yǎng)基(GibcoBRL，Burlington，Ontario，加拿大)中將這些細(xì)胞進(jìn)行再懸浮。將這些細(xì)胞用聚-d-賴氨酸(Becton DickinsonLabware，Bedford，MA，USA)于平板上，其密度為1細(xì)胞/皿，然后在37℃、5％CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。
將大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞(5×105/孔)進(jìn)行原代培養(yǎng)5天后，用F缺陷型SeV載體感染這些細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)＝5)，然后再培養(yǎng)3天。于室溫下，在含有1％低聚甲醛、5％山羊血清和0.5％Triton-X的固定溶液中將這些細(xì)胞固定5分鐘。室溫下，應(yīng)用BlockAce(雪印乳業(yè))對這些細(xì)胞進(jìn)行封閉反應(yīng)2小時，然后在室溫下用500倍稀釋的山羊抗大鼠微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)(Boehringer)IgG將這些細(xì)胞培育1小時。接著，每15分鐘用PBS(-)將這些細(xì)胞沖洗3遍，然后在室溫下，用經(jīng)5％山羊血清/PBS稀釋100倍的cys3-共軛抗小鼠IgG培育此細(xì)胞1小時。接著，每15分鐘用PBS(-)將這些細(xì)胞沖洗3遍后，將Vectashield固定介質(zhì)(載體實(shí)驗(yàn)室，Burlingame，美國)加入這些細(xì)胞中；對已經(jīng)用MAP-2免疫染色和GFP熒光進(jìn)行了雙-染色的細(xì)胞，用共焦顯微鏡(Nippon Bio-Rad MRC 1024，日本)和安裝有470-500-nm或510-550-nm的激發(fā)帶狀-通過濾片倒置顯微鏡Nikon Diaphot 300觀察這些細(xì)胞。結(jié)果顯示，幾乎100％GFP被導(dǎo)入MAP2陽性的神經(jīng)細(xì)胞中(附圖15)。
<引入正常人細(xì)胞>
從日本制藥公司(DAINPPON PHARMACEUTICAL)購買正常人平滑肌細(xì)胞、正常人肝細(xì)胞和正常人肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(細(xì)胞體系)，在37℃、5％CO2下用SFM CS-C培養(yǎng)基試劑盒(細(xì)體系)培養(yǎng)這些細(xì)胞。
用F缺陷型SeV載體感染正常人細(xì)胞，諸如正常人平滑肌細(xì)胞(附圖15，肌肉)、正常人肝細(xì)胞(附圖15，肝)和正常人肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(附圖15，肺)(感染復(fù)數(shù)＝5)，然后觀察GFP的表達(dá)。這證實(shí)了導(dǎo)入效力幾乎為100％，而且GFP基因在所有細(xì)胞中的表達(dá)水平非常高(附圖15)。
<引入小鼠初級骨髓細(xì)胞>
另外，進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，在此實(shí)驗(yàn)中利用譜系標(biāo)記物分離小鼠初級骨髓細(xì)胞，并用F缺陷型SeV載體感染此細(xì)胞。首先，經(jīng)腹腔內(nèi)注射(IP注射)將5-氟尿嘧啶(5-FU，Wako Pure chemical Industries)給予C57BL小鼠(6周大，雄性)，劑量為150mg/kg；給藥2天后，從股骨采集骨髓細(xì)胞。應(yīng)用淋巴細(xì)胞-M(Cedarlane)通過密度梯度離心分離這種單核細(xì)胞。將已經(jīng)包被有生物素標(biāo)記的抗-CD45R(B220)、抗Ly6G(Gr-1)、抗-Ly-76(TER-119)、抗1(Thy1.2)和抗Mac-1的鏈霉親和素-磁珠(Pharmingen；Funakoshi)的一種混合物(3×107)加入此單核細(xì)胞中(3×106細(xì)胞)，并讓所得混合物在4℃反應(yīng)1小時；回收已用磁體除去了其中的Lin+細(xì)胞的一部分(Lin-細(xì)胞)(Erlich，S.等，《血液《1999.93(1)，80-86)。將2×107HAU/ml的SeV加入4×105的Lin-細(xì)胞，然后再將重組大鼠SCF(100ng/ml，BRL)和重組人IL-6(100U/ml)加入其中。另外，將4×107HAU/ml的F缺陷的SeV加入8×105的全部骨髓細(xì)胞中，并將5×107HAU/ml的GFP-SeV加入1×106細(xì)胞中。通過在SeV轉(zhuǎn)錄單位PUC18/T7HVJRzd.DNA(+18)(《基因細(xì)胞》，1996，1569-579)的限制酶NotI-切割位點(diǎn)插入一個PCR-擴(kuò)增的NotI片段制備GFP-SeV，這個片段含有加入了一個轉(zhuǎn)錄起始信號(R1)、一個終止(R2)信號和一個間插(IG)序列的綠色熒光蛋白(GFP)基因(結(jié)構(gòu)基因的長度為717bp)。使用LLC-MK2細(xì)胞和發(fā)育的雞胚、按照公知方法(《基因細(xì)胞》，1996，1569-579)進(jìn)行含有GFP基因病毒的重建，然后回收含有目標(biāo)基因的病毒。用GFP-SeV感染后培養(yǎng)48小時，再把細(xì)胞分成兩組讓一組與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗CD117(c-試劑盒；Pharmingen)反應(yīng)1小時；另一組是對照組。用PBS沖洗3次，然后將其在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(EPICS Elite ESP；Coulter，Miami，F(xiàn)L)中分析。
結(jié)果表明，F(xiàn)缺陷型Sev載體也被感染至抗c-試劑盒抗體富集的骨髓細(xì)胞中，該抗體用作血液原干細(xì)胞標(biāo)志，并且觀察到了GFP基因的表達(dá)(圖16)。用胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，加入LLC-MK2細(xì)胞中后三天測定表達(dá)GFP細(xì)胞的存在，由此證實(shí)了培養(yǎng)物上清液中感染性顆粒的存在。很清楚這些細(xì)胞中沒有一個釋放感染性病毒顆粒。
對大鼠腦室進(jìn)行載體給藥通過腹腔內(nèi)注射用生理鹽水(大冢制藥公司)稀釋10倍的戊巴比妥鈉溶液(Dainabot)(5mg/ml)來麻醉大鼠(F334/Du Crj，6周齡，雌性，Charles River)。用大腦立體定位僅對小動物(DAVID KOPE)給予病毒。在內(nèi)耳線到前囟5.2mm、從人字縫尖到右耳2.0mm、大腦表面下2.4mm處使用30G可交換針(Hamilton)注射20μl(108CIU)。在腦室的室管膜細(xì)胞中觀察到了GFP蛋白的高水平表達(dá)(圖17)。而且，在F缺陷型SeV載體中，只在注射部位周圍的室管膜細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞中觀察到GFP蛋白的表達(dá)，并且在這些區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)損傷。給藥大鼠直到解剖也沒有發(fā)現(xiàn)行為異?；蝮w重變化。解剖后，在所分析的大腦或任何組織和器官如肝、肺、腎、心、脾、胃、腸等都沒有發(fā)現(xiàn)損傷。
由F缺陷SeV基因組形成F-缺陷病毒顆粒<1>
用F-缺陷SeV病毒感染不表達(dá)F的LLC-MK2細(xì)胞和表達(dá)-F的LLC-MK2細(xì)胞(LC-MK2/F7)，并且用(+)而不用(-)胰蛋白酶進(jìn)行培養(yǎng)。在圖18A中顯示了3天后對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HA測定的結(jié)果。把培養(yǎng)物上清液分別接種至發(fā)育的雞胚，在圖18B中顯示了2天培養(yǎng)后絨毛尿囊液的HA測定的結(jié)果。在平面頂部的“C”表明用作對照組的PBS。在“稀釋”下所示的數(shù)字表示病毒溶液的稀釋倍數(shù)。而且，再把發(fā)育雞胚中的HA-陽性絨毛尿囊液(通路11和12)接種到發(fā)育雞胚中，并且在培養(yǎng)兩天后、用HA測定法檢測絨毛尿囊液(圖19C)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用F缺陷SeV病毒感染的不表達(dá)F的細(xì)胞或發(fā)育的雞胚不管HA為陽性，即使再接種到發(fā)育雞胚后病毒沒有擴(kuò)散，證實(shí)了HA-陽性病毒溶液不會有二級感染性。
<2>
檢測在不表達(dá)F的細(xì)胞中擴(kuò)增的非感染病毒溶液中病毒顆粒的存在。用F基因和HN基因作探針，通過QIAamp病毒RNA微型試劑盒(QIAGEN)對從表達(dá)F細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液、HA-陽性非感染的絨毛尿囊液和野生型SeV制備的總RNA、進(jìn)行RNA印跡分析。結(jié)果，當(dāng)用HN基因作探針時，對來自絨毛尿囊液或表達(dá)F的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中的病毒的RNA測定了條帶，反之，當(dāng)使用F基因探針時測定不到條帶(圖10)。這證實(shí)了HA-陽性非感染液具有含F(xiàn)缺陷基因組的非感染性類病毒顆粒。而且，用免疫電子顯微鏡分析該HA陽性非感染病毒溶液發(fā)現(xiàn)有病毒顆粒的存在，并且病毒顆粒的包膜與識別膠體金標(biāo)記的HN蛋白抗體反應(yīng)，但是不與識別膠體金標(biāo)記的F蛋白抗體反應(yīng)(圖20)。該結(jié)果顯示了F缺陷病毒顆粒的存在，證實(shí)了病毒能夠單獨(dú)與HN蛋白形成病毒顆粒，甚至沒有F蛋白的存在。這就已經(jīng)表明單獨(dú)用F能形成SeV病毒顆粒(Leyer，S.等，J Gen.Virol 79，683-687(1998))，并且當(dāng)前的結(jié)果首次證實(shí)了單獨(dú)用HN蛋白可形成SeV病毒顆粒。這樣，在發(fā)育雞胚中可瞬時批量生產(chǎn)F缺陷病毒顆粒的事實(shí)表明能夠批量生產(chǎn)包裹有SeV F-缺陷RNP的病毒顆粒。
<3>
如上所述，相對于仙臺病毒感染的細(xì)胞來說，在發(fā)育雞胚中瞬時擴(kuò)增的F-缺陷病毒顆粒根本沒有被感染。為了證實(shí)功能性RNP結(jié)構(gòu)包裹在包膜中，把表達(dá)F的細(xì)胞和不表達(dá)F的細(xì)胞與陽離子型脂質(zhì)體(DOSPER，Boehringer mannheim)混合并通過在室溫接種15分鐘來轉(zhuǎn)染。當(dāng)該細(xì)胞沒有與陽離子脂質(zhì)體混合時，根本沒有觀察到表達(dá)GFP的細(xì)胞，而當(dāng)與陽離子型脂質(zhì)體混合時，所有的細(xì)胞都表達(dá)GFP。在不表達(dá)F的細(xì)胞中，僅在單一細(xì)胞中看到GFP的表達(dá)并且沒有擴(kuò)展到相鄰細(xì)胞，相反，在表達(dá)F的細(xì)胞中，表達(dá)GFP的細(xì)胞擴(kuò)展形成集落(圖21)。所以，在發(fā)育雞胚中瞬時擴(kuò)增的非感染的病毒顆粒當(dāng)用諸如轉(zhuǎn)染的方法把它們接種到細(xì)胞中時，能夠表達(dá)基因。
［實(shí)施例8]從FHN-缺陷的SeV基因組重建和擴(kuò)增病毒<FHN-缺陷基因組cDNA的構(gòu)建>
為了構(gòu)建FHN-缺陷型基因組的cDNA(pSeV18+/ΔFHN)，首先用EcoRI消化pUC18/KS以構(gòu)建pUC18/Eco，然后把從F基因的起始密碼子到HN基因的終止密碼子的全部序列(4866-8419)缺失，再在BsiwI位點(diǎn)(cgtacg)連接。在用測序法確認(rèn)FHN缺陷位點(diǎn)的序列后，從凝膠中回收EcoRI片段(4057bp)來取代pUC18/KS的EcoRI片段從而完成構(gòu)建。從凝膠中回收含有FHN缺失區(qū)域的KpnI/SphI片段(14673bp)來取代pSeV18+的KpnI/SphI片段得到質(zhì)粒pSeV18+/ΔFHN。
另一方面，按照下列方法實(shí)現(xiàn)用GFP引導(dǎo)的FHN-缺陷SeV cDNA的構(gòu)建。從pSeV18+/ΔFHN中回收SalI/XhoI片段(7842bp)，并克隆到pGEM11Z(Promega)中。把所得到的質(zhì)粒命名為pGEM11Z/SXdFHN。通過用BsiwI酶消化的方法把帶有d2EGFP(Clontech)的ATG-TAA(846bp)兩端的BsiwI部位的PCR產(chǎn)物與pGEM11Z/SXdFHN的FHN-缺陷部位相連接。把所得到的質(zhì)粒命名為pSeV18+/ΔFHN-d2GFP。
<FHN-缺陷、蛋白共表達(dá)的細(xì)胞系的建立>
表達(dá)F基因的質(zhì)粒與用來建立F-缺陷的、蛋白共表達(dá)的細(xì)胞系的質(zhì)粒相同，并且用同樣的反復(fù)構(gòu)建表達(dá)HN基因的質(zhì)粒，把含有HN的ORF片段插入pCALNdlw的獨(dú)特的SwaI位點(diǎn)上(Arai等，如上所述)得到命名為pCALNdLw/HN的質(zhì)粒。
按照產(chǎn)品手冊，把LLC-MK2細(xì)胞與相同量或不同比率的pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN混合以用哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene)引導(dǎo)基因。在用G418進(jìn)行3周選擇后克隆細(xì)胞。把所得到的抗藥克隆各自用重組腺病毒感染(Ade/Cre，Saito等，如上所述)(感染復(fù)數(shù)＝10)，其中的重組腺病毒能夠表達(dá)Cre DNA重組酶。然后在用PBS(-)沖洗3次后，在誘導(dǎo)表達(dá)F和HN蛋白后3天收集細(xì)胞，并且通過使用蛋白質(zhì)印跡法用抗SeV F蛋白和抗SeV HN蛋白的單克隆IgG對它們進(jìn)行探查(圖22)。
<pGEM/FHN的構(gòu)建>
把用于構(gòu)建pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN的F和HN的片段克隆到pGEM4Z和pGEM3Z(Promega)以分別得到pGEM4Z/F和pGEM3Z/HN?；厥毡籔vuII消化的含有T7啟動子和pGEM3Z/HN的HN的區(qū)域所得到的片段，并且連接到pGEM4Z/F的F基因的下游的獨(dú)特SacI部位處的鈍化部位切口。通過使用抗F和抗HN單克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)當(dāng)F和HN的基因在相同方向連接時，它們的蛋白被同時表達(dá)。
<FHN-缺陷病毒的重建>
有兩種方法可以進(jìn)行FHN-缺陷病毒(P0)的重建。一種方法是使用RNP轉(zhuǎn)染方法用于FHN-缺陷病毒的重建，另一種是使用T7來提供FHN蛋白共表達(dá)的質(zhì)粒。也就是說，在調(diào)節(jié)T7啟動子的前提下，分別構(gòu)建表達(dá)F和HN蛋白的質(zhì)粒，并且使用那些質(zhì)粒重建F和HN蛋白。在兩種方法中，用FHN共表達(dá)細(xì)胞擴(kuò)增重建的病毒。為了按如上述F-缺陷SeV重建相同的方法把基因?qū)氲絃LC-MK2細(xì)胞中，以12μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿、2μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿和4μg/10cm平皿(最后總量，3ml/10cm平皿)的比率混合FHN-缺陷、GFP-表達(dá)的SeV cDNA(pSeV18+/ΔFHN-d2GFP)、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN?；蜣D(zhuǎn)染3小時后，把培養(yǎng)基換成含有AraC(40μg/ml，SIGMA)和胰蛋白酶(7.5μg/ml，GIBCO)的MEM，并且再培養(yǎng)3天。在基因轉(zhuǎn)染2天后用立體熒光光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。分析加入pGEM/FHN的作用，并且通過擴(kuò)散表達(dá)GFP的細(xì)胞來證實(shí)病毒的形成。結(jié)果，在重建中加入pGEM/FHN時，觀察到了擴(kuò)散的表達(dá)-GFP的細(xì)胞，相反，在沒有加入pGEM/FHN時，僅在單一細(xì)胞中觀察到了GFP的表達(dá)(圖23)。這證實(shí)了在FHN蛋白重建中的這種加入會引起病毒的病毒顆粒的形成。另一方面，在RNP轉(zhuǎn)染時，在P1的表達(dá)FHN的細(xì)胞中成功地完成了病毒的回收，就象在F缺陷的情況中一樣(圖24，較上平面部位)。
在Ade/Cre感染后6小時或更長時間，把FHN缺陷病毒感染給誘發(fā)了表達(dá)FHN蛋白的細(xì)胞后證實(shí)了病毒的擴(kuò)增(圖24，較低的平面)。
把重建于FHN缺陷GFP表達(dá)的SeV cDNA的病毒溶液感染給LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN細(xì)胞，并且加入或不加胰蛋白酶進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，分析表達(dá)GFP蛋白的細(xì)胞擴(kuò)散。結(jié)果，僅在LLC-MK2/FHN中觀察到GFP的擴(kuò)散，這證實(shí)了通過FHN共表達(dá)和以依賴于胰蛋白酶的方式可特異性地擴(kuò)增病毒溶液(圖25)。
為了確認(rèn)FHN-缺陷病毒基因組，將從LLC-MK2/FHN中回收的培養(yǎng)物上清液離心，按照廠家手冊用QIAamp病毒RNA微型試劑盒(QIAGEN)提取RNA。使用第一鏈合成的Superscript預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)將RNA用于RT-PCR的模板合成(GIBCO BRL)，并且使用TAKARA Z-Taq(Takara)進(jìn)行PCR。把F-缺陷病毒用作對照組。選擇PCR引物組合作為M基因和GFP基因的結(jié)合，或者作為M基因和L基因的結(jié)合(對M基因和GFP基因(M-GFP)的結(jié)合來說，正向5′-atcagagacctgcgacaatgc/SEQ ID NO13，反向5′-aagtcgtgctgcttcatgtg/SEQ ID NO14；對M基因和L基因的結(jié)合(M-L)，正向5′-gaaaaacttagggataaagtccc/SEQ ID NO15，反向5′-gttatctccgggatggtgc/SEQID NO16)。結(jié)果，當(dāng)使用M和GFP基因作引物時，在RT條件下，F(xiàn)-缺陷和FHN-缺陷病毒都得到特殊的條帶。在使用M和L基因作引物時，對FHN缺陷樣品測定了含有給定的GFP大小的條帶，并且對F缺陷樣品測定了含有HN基因的一定大小的加長條帶。這樣，證明了在基因組結(jié)構(gòu)中的FHN缺陷(圖26)。
另一方面，同F(xiàn)缺陷病毒一樣，把FHN-缺陷的病毒感染給表達(dá)-F的細(xì)胞，并且在4天后回收培養(yǎng)物上清液以進(jìn)行LLC-MK2、LLC-MK2/F和LLC-MK2/FHN的感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，在任何感染細(xì)胞中都沒有觀察到表達(dá)GFP的細(xì)胞，這表明病毒沒有對這些細(xì)胞感染。但是，現(xiàn)在已有報導(dǎo)，單獨(dú)的F蛋白足以形成病毒顆粒(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1，569-579(1996))并且肝臟中的唾液酸糖蛋白缺乏受體(ASG-R)能夠調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的特異感染(Spiegel等，《病毒學(xué)雜志》72，5296-5302，1998)。這樣，帶有僅用F蛋白形成的病毒包膜的、含有FHN-缺陷的RNA基因組的病毒顆粒可以釋放到表達(dá)F細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液。所以，回收用FHN-缺陷病毒感染的表達(dá)F細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，并且在離心后，如上所述提取RNA并且根據(jù)上述方法用RT-PCR分析。結(jié)果，如圖27所示證明了含有FHN-缺陷基因組的RNA的存在。
對用VSV-G轉(zhuǎn)化為假型病毒的病毒顆粒的蛋白質(zhì)印跡法分析清楚地表明不表達(dá)F和HN蛋白?？梢哉J(rèn)為本發(fā)明建立了FHN-缺陷病毒的病毒顆粒的生產(chǎn)體系。
而且，把從表達(dá)F蛋白的細(xì)胞中釋放出的病毒顆粒涂在表達(dá)FHN或不表達(dá)FHN的LLC-MK2細(xì)胞上，其中的LLC-MK2細(xì)胞可以混合或沒有混合陽離子型脂質(zhì)體(50μl DOSPER/500μl/孔)。結(jié)果，當(dāng)用DOSPER包覆成混合物時，可以觀察到表達(dá)GFP細(xì)胞的擴(kuò)散，而只有HN-缺陷病毒顆粒根本沒有感染，沒有觀察到表達(dá)GFP的細(xì)胞，這些正如在上述F-缺陷顆粒的情況中所看到的。在沒有表達(dá)FHN的細(xì)胞中，觀察到了表達(dá)GFP的細(xì)胞，但沒有發(fā)現(xiàn)病毒的再形成和擴(kuò)散的跡象。
從表達(dá)F細(xì)胞中回收的這些病毒樣顆粒能夠持續(xù)感染表達(dá)ASG-R基因的細(xì)胞、不表達(dá)ASG-R的細(xì)胞或肝細(xì)胞，用Spiegel等的方法能夠檢測出感染是肝特異性的還是ASG-R特異性的。
缺陷基因組RNA病毒載體的應(yīng)用1.用F-缺陷病毒包膜包裹在上述系統(tǒng)中擴(kuò)增的F-缺陷的RNP。把該包膜引入細(xì)胞中，它是用化學(xué)修飾等方法或者通過基因?qū)朐噭┗蚧驑尩?RNP轉(zhuǎn)染或RNP注射)給該包膜加入任何所需的具有導(dǎo)入能力的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的，并且重組RNA基因組能夠復(fù)制并在細(xì)胞中連續(xù)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
2.保留HN的細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，而HN的細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域是以特殊方式與能夠以定向其他受體的配體融合并且能夠產(chǎn)生嵌合體蛋白的重組基因包裹進(jìn)病毒的基因組中時，能夠產(chǎn)生具有特殊目標(biāo)的載體。另外，在產(chǎn)生重組蛋白的細(xì)胞中能夠制備該載體。這些載體能夠適用于基因治療，如疫苗等。
3.由于已經(jīng)成功地完成了FHH缺陷的SeV病毒的重建，所以通過以下方法生產(chǎn)導(dǎo)向載體，即通過把能夠?qū)虬さ那逗象w蛋白基因?qū)胫罠HN缺失部位替代GFP基因，按與FHN缺陷載體情況中的相同方法進(jìn)行重建，在表達(dá)FHN的細(xì)胞中擴(kuò)增一次所得物，將其感染給不表達(dá)的細(xì)胞，并且回收僅用能夠?qū)虻那逗象w包膜蛋白包裹從病毒基因組中轉(zhuǎn)錄形成的病毒顆粒。
4.現(xiàn)在已經(jīng)制備了仙臺病毒的小基因組和通過把NP、P、L和F基因同時導(dǎo)入細(xì)胞僅用F蛋白包裝的小基因組的病毒顆粒(Leyer等，《基因病毒學(xué)雜志》79，683-687，1998)?，F(xiàn)在已經(jīng)報導(dǎo)了一種載體，其中由仙臺F蛋白把小鼠白血病病毒轉(zhuǎn)變成假型(Spiegel等，《病毒學(xué)雜志》72，5296-5302，1998)。至今為止也報導(dǎo)了對肝細(xì)胞特異性導(dǎo)向的胰蛋白酶切割的F蛋白可以通過ASG-R調(diào)節(jié)(Bitzer等，《病毒學(xué)雜志》71，5481-5486，1997)。在前面報導(dǎo)中的系統(tǒng)是瞬間形成顆粒的系統(tǒng)，它很難連續(xù)回收載體顆粒。盡管Spiegel等已經(jīng)報導(dǎo)了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被仙臺F蛋白轉(zhuǎn)化成假型，但是該方法存在本質(zhì)的問題，如逆轉(zhuǎn)錄病毒只能把基因?qū)胗薪z分裂的細(xì)胞。在本發(fā)明中所回收的含有FHN共缺陷SeV病毒基因組和僅有F蛋白包膜的病毒顆粒是有效的RNA載體，該載體能夠不考慮細(xì)胞分裂而在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制。它們是新的病毒顆粒，并且是容易大量生產(chǎn)的顆粒系統(tǒng)。
來自FHN-缺陷的SeV基因組的病毒重建和擴(kuò)增對許多單鏈負(fù)鏈RNA病毒如仙臺病毒、麻疹病毒來說，已經(jīng)建立了來自能夠克隆病毒基因組的cDNA的感染性病毒顆粒的重建技術(shù)。
在大多數(shù)系統(tǒng)中，重建是通過以下進(jìn)行的，即使用T7聚合酶、在T7啟動子的下游將導(dǎo)入有cDNA、NP、P和L基因的質(zhì)粒引入細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)cDNA和每個基因。為了提供T7聚合酶，主要使用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒。
表達(dá)T7的痘苗病毒能夠在大多數(shù)細(xì)胞中有效地表達(dá)T7聚合酶。但是，因?yàn)槎幻绮《緯T導(dǎo)細(xì)胞毒性、被感染的細(xì)胞僅能存活2或3天。在多數(shù)情況下，利福平用作抗疫苗藥物。在kato等的系統(tǒng)中(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1，569-579(1996))，AraC與利福平一起用于抑制痘苗病毒的增殖至最低水平，并且有益于仙臺病毒的重建。
盡管如此，由仙臺病毒所代表的最小負(fù)鏈RNA病毒的重建效率是1×105個細(xì)胞中有幾個顆粒或更少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒。痘苗病毒引起的細(xì)胞毒性和復(fù)雜的重建步驟(轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白分別與無修飾的RNA形成RNP樣結(jié)構(gòu)，之后，由聚合酶發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯)是這種重建低效率的原因。
除了痘苗病毒外，還按提供T7聚合酶的方法檢測了腺病毒系統(tǒng)，但是也沒有獲得好結(jié)果。痘苗病毒能夠編碼在細(xì)胞質(zhì)中起作用的RNA加帽酶作為除了T7聚合酶外其自身的酶，人們認(rèn)為該酶在細(xì)胞質(zhì)中通過加帽使之穩(wěn)定由T7啟動子轉(zhuǎn)錄的RNA促進(jìn)了翻譯效力。本發(fā)明試圖通過用補(bǔ)骨脂素-長波長-UV方法處理痘苗病毒提高仙臺病毒的重建效力來避免由痘苗病毒所引起的細(xì)胞毒性。
通過DNA與補(bǔ)骨脂素的交聯(lián)和長波長的紫外光，能夠達(dá)到這樣一種狀態(tài)，即抑制含有DNA基因組的病毒的復(fù)制，而尤其不會過早地影響基因的表達(dá)。在系統(tǒng)中病毒失活所看到的顯著效果歸因于具有長基因組的痘苗病毒(Tsung，K.等，《病毒學(xué)雜志》70，165-171(1996))。
在能夠自我增殖的野生型病毒的情況下，甚至是重建所形成的病毒的單一顆粒也可能通過接種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞到發(fā)育雞胚來增殖仙臺病毒。所以，人們不能不認(rèn)真考慮重建效率和剩余痘苗病毒。
但是，在用于研究病毒復(fù)制、顆粒形成機(jī)理等的各種突變體病毒的重建情況中，為了增殖病毒有時不得不使用表達(dá)來自于病毒等的蛋白的細(xì)胞系、而不是發(fā)育中的雞胚。而且，最大的可能是突變體病毒或缺陷病毒的增殖顯著性遲于野生型病毒的增殖。
為了用這種突變增殖仙臺病毒，應(yīng)當(dāng)把轉(zhuǎn)染的細(xì)胞涂在下一代細(xì)胞上并培養(yǎng)較長時間。在這種情況下，痘苗病毒的重建效率和剩余滴度可能是有問題的。在本發(fā)明的方法中，一方面提高重建效力，另一方面還要降低剩余痘苗病毒的滴度。
使用本發(fā)明的方法，在前述系統(tǒng)中使用未處理的痘苗病毒可能未曾獲得的突變體病毒通過重建(F、FHN-缺陷病毒)成功獲得。本系統(tǒng)對突變體病毒的重建是一個最好的工具，突變體病毒在將來可以得到更多。所以，本發(fā)明人檢測了補(bǔ)骨脂素和紫外光(UV)的量，并評價了痘苗病毒失活的條件。
<試驗(yàn)>
首先，用2分鐘的固定照射時間測定補(bǔ)骨脂素濃度。通過以下方法檢測失活，即通過噬斑形成測定痘苗病毒的滴度，并且通過pGEM-luci質(zhì)粒在T7啟動子和仙臺病毒的小基因組控制下測定T7聚合酶活性。仙臺病毒的小基因組的T7聚合酶活性的測定是一個系統(tǒng)，其中細(xì)胞被仙臺病毒的小基因組質(zhì)粒和pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L質(zhì)粒共同感染，它們由T7表達(dá)仙臺病毒的NP-、P-和L-蛋白，在形成核糖核酸蛋白復(fù)合體后通過仙臺病毒的RNA聚合酶測定熒光素酶蛋白的轉(zhuǎn)錄。
2分鐘紫外照射后，可以看到痘苗病毒的滴度隨著補(bǔ)骨脂素濃度而下降。但是，當(dāng)補(bǔ)骨脂素濃度達(dá)到0、0.3和1μg/ml時，T7聚合酶的活性不變，但在10μg/ml時，下降至大約十分之一(圖28)。
而且，固定補(bǔ)骨脂素濃度為0.3μg/ml時，測定紫外照射時間。隨著照射時間的增加，痘苗病毒的滴度會下降，然而發(fā)現(xiàn)達(dá)到30分鐘照射對T7聚合酶沒有作用。在這種情況下，在0.3μg/ml和30分鐘照射的條件下，滴度降低到1/1000不影響T7聚合酶的活性(圖29)。
但是，在降低滴度為1/1000的痘苗病毒中，以感染復(fù)數(shù)＝2感染后24小時換算為預(yù)處理滴度(感染復(fù)數(shù)＝0.002作為處理后剩余滴度)的CPE相同于以感染復(fù)數(shù)＝2感染的未處理的病毒(圖30)。
使用在上述條件下處理過的痘苗病毒，評價仙臺病毒的重建效力。通過修改上述Kato等方法進(jìn)行以下步驟的重建。以3×105細(xì)胞/孔把LLC-MK2細(xì)胞接種到6孔微型平板上，培養(yǎng)一夜后，在PLWUV處理之前把痘苗病毒稀釋到6×105pfu/100μl的校準(zhǔn)滴度，并且感染至PBS沖洗過的細(xì)胞。感染1小時后，向100μl分別加有1、0.5、1和4μg的質(zhì)粒pGEM-NP、P、L和cDNA的最適MEM再加入10μlSuperfect(QIAGEM)并在室溫放置15分鐘，加入1ml的最適MEM(GIBCO)(含有Rif.和AraC)后，將其涂在細(xì)胞上。
在轉(zhuǎn)染后2、3和4天，把細(xì)胞回收、離心并懸浮在300μl/孔的PBS中。在受精后10天，把100μl含有從懸浮液本身或通過稀釋懸浮液10或100倍制得的含有溶液的細(xì)胞接種到發(fā)育雞胚中，每種稀釋液接種至4個雞胚(分別為1×105、1×104和1×103個細(xì)胞)。3天后，從雞胚中回收尿囊液并通過HA試驗(yàn)檢測病毒的重建(表1)。對分別用1×105、1×104和1×103個細(xì)胞接種的雞胚來說，在接種105個細(xì)胞雞胚中有HA活性的雞胚為1分、104個細(xì)胞為10分、103個細(xì)胞為100分，計(jì)算重建效力(圖31)。公式如表1所示。
表1.紫外線處理痘苗病毒的時間對仙臺病毒的重建效率的作用

重建效力＝(a1+a2+a3)×b與轉(zhuǎn)染前所給定滴度相比，感染后2、3和4天所測定的痘苗病毒的殘余滴度更小(圖32)。
就PLWUV所失活的痘苗病毒而言，滴度可能會降低到1/1000，而不影響T7聚合酶的活性。但是，來自痘苗病毒的CPE與用顯微鏡觀察所發(fā)現(xiàn)的滴度高1000倍的未處理的病毒的CPE沒有不同。
對仙臺病毒的重建來說，使用上述條件處理的痘苗病毒，重建效率增加了幾十倍到上百倍(圖31)。同時，轉(zhuǎn)染后痘苗病毒的剩余滴度不是5pfu/105個細(xì)胞或更多。這樣，可復(fù)制的痘苗病毒的存活保持在0.005％或更低。
假型仙臺病毒的構(gòu)建<1>其中誘導(dǎo)了VSV-G基因產(chǎn)物的輔助細(xì)胞的制備因?yàn)閂SV-G基因產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性，使用質(zhì)粒pCALNdLG在LLC-MK2細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化(Arai T.等，《病毒學(xué)雜志》72(1998)p1115-1121)，其中VSV-G基因產(chǎn)物可以由Cre重組酶誘導(dǎo)。把質(zhì)粒引入LLC-MK2細(xì)胞是通過說明書中的磷酸鈣方法實(shí)現(xiàn)的(CalPhos TMM哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒，Clontech)。
在10cm培養(yǎng)平皿中把10微克質(zhì)粒pCALNdLG導(dǎo)入增殖為60％融合的LLC-MK2細(xì)胞中。在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃下用10ml MEM-FCS10％培養(yǎng)液把細(xì)胞培養(yǎng)24小時。24小時后，刮去細(xì)胞并懸浮在10ml培養(yǎng)液中，然后使用5個10cm培養(yǎng)平皿，1、2和2平皿分別用5ml、2ml和0.5ml接種。然后將它們在10ml含有1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)的MEM-FCS10％培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天，每隔一天改變培養(yǎng)液來選擇基因穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染系。用克隆環(huán)回收生長在培養(yǎng)基中的抗G418的28個克隆。在10cm培養(yǎng)平皿中將各克隆擴(kuò)展融合。
對每個克隆來說，在用含有Cre重組酶的重組腺病毒AxCANCre感染后，使用抗VSV-G單克隆抗體通過下列所述的蛋白質(zhì)印跡法檢測VSV-G的表達(dá)。
在6cm的培養(yǎng)平皿中使各克隆生長融合，之后，用Saito等的方法(見上述)以感染復(fù)數(shù)＝10感染腺病毒AxCANCre，并培養(yǎng)3天。除去培養(yǎng)物上清液后，用PBS沖洗細(xì)胞，并通過加入0.5ml含有0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)PBS將其從培養(yǎng)平皿上脫離并在37℃溫育5分鐘。把該細(xì)胞懸浮在3ml的PBS中后，以1500×g離心5分鐘回收細(xì)胞。把所得到的細(xì)胞再懸浮于2ml的PBS中，然后再以1500×g離心5分鐘來回收細(xì)胞。
把細(xì)胞儲存在-20℃下，并且能夠按照需要融化使用。把所回收的細(xì)胞溶解于100μl的細(xì)胞溶菌溶液(RIPA緩沖液，Boehringer Mannheim)，并且使用細(xì)胞的全部蛋白(1×105個細(xì)胞/泳道)，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法。把細(xì)胞裂解物溶于SDS聚酰胺凝膠電泳樣品緩沖液(含有6mM Tris-HCl(pH6.8)，2％SDS，10％丙二醇，5％2-巰基乙醇的緩沖液)并且使樣品在95℃加熱后電泳5分鐘。使用SDS-聚酰胺凝膠(Multigel 10/20，第一化學(xué)公司)通過電泳方法分離樣品，然后通過半干燥印跡法把所分離的蛋白轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移膜上(Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜，Millipore)。使用在100％甲醇浸泡過20秒并且在水中浸泡過1小時的轉(zhuǎn)移膜在1mA/cm2固定電流下進(jìn)行轉(zhuǎn)移1小時。
在40ml封閉溶液(Block-Ace，雪印奶產(chǎn)品公司)中把轉(zhuǎn)移膜振搖1小時并在PBS沖洗1次。
在乙烯袋中密封轉(zhuǎn)移膜和用含有10％封閉溶液的PBS稀釋成1/1000的抗VSV-G抗體(克隆P4D4，Sigma)并在4℃下放置。
把轉(zhuǎn)移膜在40ml的PBS-0.1％Tween 20中浸泡兩次5分鐘，沖洗后，在PBS中浸泡5分鐘以沖洗。
把轉(zhuǎn)移膜和5ml用過氧化酶標(biāo)記的并用含有10％封閉溶液的PBS稀釋成1/2500的抗小鼠IgG抗體(抗小鼠免疫球蛋白，Amersham)密封在乙烯袋中并在室溫下振蕩1小時。
振蕩后，把轉(zhuǎn)移膜在PBS-0.1％Tween 20中浸泡兩次5分鐘，沖洗后，在PBS中浸泡5分鐘以沖洗。
用發(fā)光方法(ECL蛋白質(zhì)印跡法測定試劑，Amesham)測定與抗VSV-G抗體交聯(lián)反應(yīng)的膜上蛋白。結(jié)果在圖33中顯示。這3種克隆表明AxCANCre感染特異性VSV-G表達(dá)，證實(shí)了能夠誘發(fā)VSV-G基因產(chǎn)物的LLC-MK2細(xì)胞的建立。
把命名為LLCG-L1的所得到的克隆中的一個克隆使用抗VSV抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(圖34)。結(jié)果，在LLCG-L1中檢測出對VSV-G基因誘導(dǎo)特異性的抗體的反應(yīng)性，證實(shí)在細(xì)胞表面表達(dá)了VSV-G蛋白。
<2>使用輔助細(xì)胞制備含有缺陷F基因的基因組假型仙臺病毒把含有缺陷F基因的基因組假型仙臺病毒感染到表達(dá)VSV-G基因的細(xì)胞，并且使用含有上述實(shí)施例中所述的GFP基因F型缺陷仙臺病毒檢測是否能夠看到用VSV-G作衣殼體的假型病毒的產(chǎn)生，并且把GFP基因的表達(dá)作為一個指標(biāo)。結(jié)果，在沒有感染含有Cre重組酶的重組腺病毒AxCANCre的LLCG-L1中，通過F缺陷型仙臺病毒的感染引入病毒基因并測定表達(dá)GFP的細(xì)胞，盡管表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目沒有增加。在VSV-G誘導(dǎo)的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)GFP的細(xì)胞隨著時間增加。當(dāng)再加入1/5的上清液至VSV-G誘導(dǎo)的新細(xì)胞時，在前面的上清液中沒有看到基因的轉(zhuǎn)染，同時在后面的上清液中發(fā)現(xiàn)表達(dá)GFP細(xì)胞的增加以及基因的轉(zhuǎn)染。在把后面的上清液加給沒有VSV-G誘導(dǎo)的LLCG-L1細(xì)胞時，盡管有轉(zhuǎn)染，但是也沒有看到表達(dá)GFP的細(xì)胞的增加。綜合起來，發(fā)現(xiàn)了病毒的增殖對表達(dá)VSV-G的細(xì)胞具有特異性，并且發(fā)現(xiàn)了具有VSV-G的假型F缺陷型病毒的形成。
<3>對生產(chǎn)含有F基因缺陷基因組的假型仙臺病毒條件的評價在改變AxCANCre感染量(感染復(fù)數(shù)＝0、1.25、2.5、5和10)的情況下，感染一定量的含有F基因缺陷基因組的假型仙臺病毒并且在第7天或第8天回收培養(yǎng)物上清液。然后，在用VSV-G誘導(dǎo)前后，把該上清液感染給細(xì)胞，5天后，比較表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)以觀察VSV-G基因表達(dá)量的作用。結(jié)果，在感染復(fù)數(shù)＝0沒有發(fā)現(xiàn)病毒產(chǎn)生而在感染復(fù)數(shù)＝10時產(chǎn)生量最大(圖35)。此外，當(dāng)分析隨著時間的增加病毒的生產(chǎn)量，產(chǎn)生量從第5天或之后開始增加并持續(xù)到第8天(圖36)。通過計(jì)算在病毒溶液(CIU)中感染給細(xì)胞的顆粒數(shù)，來完成病毒滴度的測定，通過在連續(xù)(每次10倍)稀釋的病毒溶液添加給VSV-G誘發(fā)前的細(xì)胞感染后第5天對表達(dá)GFP的細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)病毒產(chǎn)生的最大值是5×105CIU/ml。
<4>抗VSV抗體對含有F基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒感染性的作用就使用表達(dá)VSV-G細(xì)胞所獲得的含有F基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒是否在衣殼體中含有VSV-G蛋白而言，使用抗VSV抗體評價是否影響感染性的中和活性?；旌喜《救芤汉涂贵w并在室溫下放置30分鐘，然后感染給LLCG-L1細(xì)胞而沒有VSV-G誘導(dǎo)。在第5天，通過表達(dá)GFP細(xì)胞的存在來檢測基因的轉(zhuǎn)染能力。結(jié)果，用抗VSV抗體可以看到對感染的最好抑制，相反在含有帶原始衣殼體的F基因缺陷基因組的仙臺病毒中，沒有看到抑制(圖37)。所以，清楚地說明本發(fā)明所獲得的病毒是在其衣殼體中含有VSV-G蛋白的假型仙臺病毒，其中該病毒的感染能夠被抗體特異性地抑制。
<5>對假型仙臺病毒具有F缺陷的基因組的確認(rèn)對感染細(xì)胞的細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析以檢測在表達(dá)VSV-G基因的細(xì)胞中增殖的本發(fā)明病毒是否是F缺陷型。用上述方法完成蛋白質(zhì)印跡法分析。使用從兔中制備的抗仙臺病毒的多克隆抗體、從小鼠中制備的抗F蛋白的單克隆抗體和從小鼠中制備的抗HN蛋白的單克隆抗體作為第一抗體。在抗仙臺病毒多克隆抗體中，用過氧化酶標(biāo)記的抗-兔IgG抗體作第二抗體，并且在抗F蛋白的單克隆抗體和抗-HN蛋白的單克隆抗體中，用過氧化酶標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體作第二抗體。結(jié)果，沒有測定到F蛋白，相反測定到了來自仙臺病毒的蛋白和HN蛋白，證實(shí)了它是F缺陷型。
<6>使用輔助細(xì)胞制備含有F和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒使用作為指示劑的GFP基因表達(dá)和含有上述實(shí)施例中所述的GFP基因的F和HN基因缺陷的仙臺病毒按照上述實(shí)施例中所述的相似方法分析含F(xiàn)和HN基因缺陷基因組的仙臺病毒對表達(dá)VSV-G基因的LLCG-L1細(xì)胞的感染后，觀察了在其衣殼體中是否產(chǎn)生了含有VSV-G的假型病毒。結(jié)果，觀察到了病毒增殖對表達(dá)VSV-G的細(xì)胞具有特異性，并且觀察到了含有VSV-G的假型的F和HN缺陷的仙臺病毒的產(chǎn)生(圖38)。通過計(jì)算在病毒溶液(CIU)中感染給細(xì)胞的顆粒數(shù)，以測定病毒滴度，通過在連續(xù)(每次10倍)稀釋的病毒溶液添加給VSV-G誘發(fā)前的細(xì)胞感染后第5天對表達(dá)GFP的細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)病毒產(chǎn)生的最大值是1×106CIU/ml。
<7>對假型仙臺病毒具有F和HN缺陷的基因組的確認(rèn)對感染細(xì)胞的細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析以檢測在表達(dá)VSV-G基因的細(xì)胞中增殖的本發(fā)明病毒是否是F和HN缺陷型。結(jié)果，沒有測定到F和HN蛋白，相反測定到了來自仙臺病毒的蛋白，證實(shí)了它是F和HN缺陷型(圖39)。
病毒重建方法的分析<現(xiàn)有方法>
以5×106個細(xì)胞/平皿把LLC-MK2細(xì)胞接種到100mm培養(yǎng)平皿上。培養(yǎng)24小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗一次細(xì)胞，然后在室溫用表達(dá)重組痘苗病毒的T7 RNA的聚合酶感染(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126 1986)(vTF7-3)1小時(感染復(fù)數(shù)＝2)(感染復(fù)數(shù)＝2到3，優(yōu)選使用感染復(fù)數(shù)＝2)。把本文所用的病毒用3μg/ml補(bǔ)骨脂素和長波紫外光(365nm)處理5分鐘。用不含血清的MEM培養(yǎng)基把細(xì)胞沖洗兩次，分別以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比率把質(zhì)粒pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1，569-579(1996))懸浮在最適-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)中。然后，加入SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(1μgDNA/5μl，QIAGEN)并在室溫下放置15分鐘，并且加入3ml含有3％FBS的最適-MEM培養(yǎng)基。之后，加入DNA-SupeFect混合物。3小時培養(yǎng)后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基把細(xì)胞沖洗兩次，并且在含有40μg/ml的胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)70小時。收集細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液作各自為P0-d3樣品。把P0-d3的粒狀沉淀懸浮在最適-MEM培養(yǎng)基(107個細(xì)胞/ml)中。將其凍融三次，然后與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑DOSPER(Boehringer Mannheim)(106個細(xì)胞/25μlDOSPER)并將其在室溫放置15分鐘。然后，用該混合物(在24孔的平板中106個細(xì)胞/孔)轉(zhuǎn)染表達(dá)F的LLC-MK2/F7細(xì)胞，并用不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培養(yǎng)。在第3天和第7天回收培養(yǎng)物上清液并分別定義為P1-d3和P1-d7樣品。
<包膜質(zhì)粒+表達(dá)F的細(xì)胞的涂層方法>
類似于上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，不同的是加入4μg/平皿的包膜質(zhì)粒pGEM/FHN。培養(yǎng)3小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩次并在含有40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。除去培養(yǎng)物上清液后，用5ml的100mm平皿的懸浮于不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)的表達(dá)-F的LLC-MK2/F7細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液涂布細(xì)胞。48小時培養(yǎng)后，回收細(xì)胞和上清液并各自定義為P0-d4樣品。把P0-d4樣品的粒狀沉淀懸浮于最適-MEM培養(yǎng)基(2×107個細(xì)胞/ml)中并凍融三次。然后用該懸浮液(2×106個細(xì)胞/孔，24孔平板)涂布表達(dá)-F的LLC-MK2/F7細(xì)胞，并且在不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3天和第7天回收培養(yǎng)物上清液，分別定義為P1-d3和P1-d7樣品。作為對照組，用如上相同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但是沒有涂布只是加入包膜質(zhì)粒。
<通過對表達(dá)-GFP的細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定CIU(細(xì)胞感染單位)(GFP-CIU)>
以2×105個細(xì)胞/孔把LLC-MK2細(xì)胞接種到12孔平板上，培養(yǎng)24小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗一次孔。然后，用100μl/孔適當(dāng)稀釋的上述樣品(P0-d3或P0-d4、P1-d3和P1-d7)感染該細(xì)胞，其中樣品為在10cm2中稀釋至含有10到100陽性細(xì)胞數(shù)。15分鐘后，加入1ml/孔的不含血清的MEM培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞來計(jì)測表達(dá)-GFP的細(xì)胞數(shù)。
<CIU(細(xì)胞感染單位)的測定>
以2×105個細(xì)胞/孔把LLC-MK2細(xì)胞接種到12孔平板上，培養(yǎng)24小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗一次孔。然后，用100μl/孔上述樣品感染該細(xì)胞，其中把所含的病毒載體定義為SeV/ΔF-GFP。15分鐘后，加入1ml/孔不含血清的MEM培養(yǎng)基并再培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，用PBS(-)把細(xì)胞沖洗三次并通過放置在室溫下大約10分鐘到15分鐘來干燥。為了固定細(xì)胞，加入1ml/孔丙酮并迅速除去，然后再將其在室溫下放置10分鐘到15分鐘來干燥細(xì)胞。以300μl/孔向細(xì)胞中加入用PBS(-)稀釋100倍的從兔制備的抗SeV多克隆抗體(DN-1)并在37℃溫育45分鐘。然后，用PBS(-)將其沖洗三次并且以300μl/孔加入用PBS(-)稀釋200倍的抗兔IgG(H+L)熒光標(biāo)記的第二抗體(AlexaTM568，分子探針)并在37℃溫育45分鐘。再用PBS(-)沖洗三次后，在熒光顯微鏡(發(fā)射560nm，吸收645nm濾膜，Leica)下觀察熒光細(xì)胞(圖40)。
作為對照組，以100μl/孔感染上述樣品(SeV/ΔF-GFP)，15分鐘后，加入1ml/孔的不含血清的MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后，不進(jìn)行后序步驟，在熒光顯微鏡(發(fā)射360nm，吸收470nm濾膜，Leica)下觀察表達(dá)-GFP的細(xì)胞。
對痘苗病毒(vTF7-3)增加缺陷型仙臺病毒載體的重建效率所最適合的PLWUV(補(bǔ)骨脂素和長波紫外光)處理?xiàng)l件的評價以5×106個細(xì)胞/平皿把LLC-MK2細(xì)胞接種到100mm培養(yǎng)平皿上。培養(yǎng)24小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗一次細(xì)胞，然后在室溫用表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒(vTF7-3)(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))感染細(xì)胞1小時(感染復(fù)數(shù)＝2)(感染復(fù)數(shù)＝2到3，優(yōu)選使用感染復(fù)數(shù)＝2)。把本文所用的病毒用0.3到3μg/ml補(bǔ)骨脂和長波紫外光(365nm)處理2到20分鐘。分別以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比率把質(zhì)粒pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1，569-579(1996))懸浮在最適MEM培養(yǎng)基(GIBCO)。然后，加入SuperFect轉(zhuǎn)染試劑(1μgDNA/5μl，QIAGEN)并在室溫下放置15分鐘并且最后加入3ml含有3％FBS的最適MEM培養(yǎng)基。之后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基把細(xì)胞沖洗兩次，然后加入DNA-SuperFect混合物。3小時培養(yǎng)后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基把細(xì)胞沖洗兩次，并且在含有40μg/ml的胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。用熒光顯微鏡觀察100mm培養(yǎng)平皿中大約1/20視野，并對表達(dá)GFP的細(xì)胞計(jì)數(shù)。為了檢測痘苗病毒(vTF7-3)的失活，通過噬斑形成(YoshiyukiNaqai等，《病毒實(shí)驗(yàn)手冊》，第291-296頁，1995)進(jìn)行滴度測定。
進(jìn)一步，把轉(zhuǎn)染后回收的時間固定到3天，測定補(bǔ)骨脂和紫外照射時間。使用用各種PLWUV處理痘苗病毒(vTF7-3)，測定仙臺病毒的重建效率。重建過程通過修改Kato等的方法(如上所述)，也就是通過以下所述的步驟。以5×105個細(xì)胞/孔把LLC＝MK2細(xì)胞接種到6孔微型平板上，過夜培養(yǎng)后(認(rèn)為細(xì)胞增殖到1×106個細(xì)胞/孔)，在PLWUV處理前在2×106pfu/100μl的滴度校正用稀釋的痘苗病毒(vTF7-3)感染PBS沖洗過的細(xì)胞。感染1小時后，分別把1、0.5、1和4μg的質(zhì)粒pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和另外類型的SeV cDNA(pSeV18+b(+))加入50μl的最適MEM培養(yǎng)基(GIBCO)(Hasan，M.K.等，J.General Virology 782813-2820，1997)。再加入10μlSuperFect(QIAGEN)并在室溫下放置15分鐘。然后，加入1ml的最適MEM(含有40μg/ml的AraC)并涂在細(xì)胞上。在轉(zhuǎn)染后3天回收細(xì)胞，然后將其離心并懸浮于100μl/孔PBS中。把懸浮液稀釋10、100、和1000倍并且把稀釋的100μl所得到的細(xì)胞溶液接種到受精后10天的發(fā)育雞胚中，每種稀釋液使用3個雞胚(分別是1×105、1×104和1×103個細(xì)胞)。3天后，從雞胚中回收絨毛尿囊液并且通過HA試驗(yàn)測定病毒的重建。分別用1×105、1×104和1×103個細(xì)胞接種的顯示HA活性的雞胚打分為1、10和100分，以來計(jì)算重建效率。
<結(jié)果>
實(shí)施例12和13的結(jié)果在圖40到43中和表2中顯示。表達(dá)質(zhì)粒的包膜和細(xì)胞涂布的組合增加了SeV/ΔF-GFP的重建效率。在P0(繼代培養(yǎng)前)的d3到d4(第3天到第4天)得到顯著改善(圖41)。在表2中，在轉(zhuǎn)染后3天用細(xì)胞接種雞胚。當(dāng)用0.3μg/ml補(bǔ)骨脂處理20分鐘時在第3天達(dá)到最高重建效率。這樣，把這些條件看作是最適條件(表2)。
表2痘苗病毒的PLWUV處理對仙臺病毒的重建的作用(轉(zhuǎn)染后3天用細(xì)胞接種卵)

重建效力＝(a1+a2+a3)×b[實(shí)施例14]攜帶不含GFP的LacZ、F-缺陷型仙臺病毒載體的制備<含LacZ基因的F-缺陷型SeV載體cDNA的構(gòu)建>
為了構(gòu)建實(shí)施例1中所述的pSeV18+/ΔF的NP基因的上游區(qū)存在的NotI限制位點(diǎn)上含有LacZ基因的cDNA(pSeV(+18LacZ)/ΔF)，進(jìn)行PCR以擴(kuò)增LacZ基因。通過以下進(jìn)行PCR，即通過把LacZ基因調(diào)整到6的多倍(Hausmann，S等，RNA 2，1033-1045(1996))并且使用含有5′端的Not I限制位點(diǎn)的引物(5′-GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTACTTTGACCAA-3′/SEQ ID NO17)和含有SeV(E)的轉(zhuǎn)錄終止信號、間插序列(I)、轉(zhuǎn)錄起始信號(S)和3′端的Not I限制位點(diǎn)的引物(5′-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGCTATTACTTCTGACACCAGACCAACTGGTA-3′/SEQ ID NO18)，使用pCMV-β(Clontech)作模板。反應(yīng)條件如下。把50ng pCMV-β、200μMdNTP(Pharmacia Biotech)、100pM引物、4U Vent聚合酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)與伴隨的緩沖液混合，并且使用25個反應(yīng)溫度循環(huán)即94℃30秒、50℃1分鐘、72℃2分鐘。所得到的產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳進(jìn)行電泳。然后，切割3.2kb的片段并在純化后用Not I消化。連接Not I消化過的pSeV18+/ΔF的片段得到pSeV(+18LacZ)/ΔF。
<常規(guī)方法>
以5×106個細(xì)胞/平皿把LLC-MK2細(xì)胞接種到100mm培養(yǎng)平皿上，在培養(yǎng)24小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗一次細(xì)胞。然后，用表達(dá)T7 RNA的聚合酶的重組痘苗病毒(vTF7-3)(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))在室溫下感染該細(xì)胞1小時(感染復(fù)數(shù)＝2)(感染復(fù)數(shù)＝2到3，優(yōu)選使用感染復(fù)數(shù)＝2)。本文所用的病毒用3μg/ml補(bǔ)骨脂和長波長紫外光(365nm)預(yù)處理5分鐘。分別以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比率把含有LacZ的F-缺失型的仙臺病毒載體cDNA(pSeV(+18LacZ)/ΔF)、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A等，《基因細(xì)胞》，569-579(1996))懸浮于最適MEM培養(yǎng)基(GIBCO)中，加入4μg/平皿包膜質(zhì)粒pGEM/FHN和SuperFect的轉(zhuǎn)染試劑(1μg DNA/5μl，QIAGEN)，并在室溫下放置15分鐘。然后，加入3ml的含有3％FBS的最適-MEM培養(yǎng)基，并用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩次，然后加入DNA-SuperFect混合物。培養(yǎng)3小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩次，并且在含有40μg/ml的胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。除去培養(yǎng)物上清液并把不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中表達(dá)F的LLC-MK2/F7的細(xì)胞100mm培養(yǎng)平皿的5ml懸浮液涂在細(xì)胞上。再培養(yǎng)48小時，回收細(xì)胞和上清液并定義為P0-d3樣品。把P0-d3粒狀沉淀懸浮于最適MEM培養(yǎng)基(2×107個細(xì)胞/ml)并在3次凍融后，與脂質(zhì)試劑DOSPER(BoehringerMannheim)(106個細(xì)胞/25μl)混合并在室溫下放置15分鐘。然后，用混合物(106個細(xì)胞/孔，24-孔平板)轉(zhuǎn)染表達(dá)F的LLC-MK2/F7細(xì)胞并用不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培養(yǎng)。在第7天回收培養(yǎng)上清液并定義為P1-d7樣品。而且，在37℃把全部的上清液都感染給接種到12孔平板上的表達(dá)F的LLC-MK2/F7細(xì)胞1小時。然后，用MEM培養(yǎng)基沖洗一次后，在不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中培養(yǎng)細(xì)胞。在第7天回收培養(yǎng)物上清液并定義為P2-d7樣品。另外，在37℃把全部的上清液都感染給接種到6孔平板上的表達(dá)F的LLC-MK2/F7細(xì)胞1小時。然后，用MEM培養(yǎng)基沖洗一次后，在不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有7.5μg/ml胰蛋白酶)中培養(yǎng)細(xì)胞。在第7天回收培養(yǎng)物上清液并定義為P3-d7樣品。進(jìn)一步，在37℃把全部的上清液都感染給接種到10cm平板上的表達(dá)F的LLC-MK2/F7細(xì)胞1小時。然后，用MEM培養(yǎng)基沖洗一次后，在不含血清的MEM培養(yǎng)基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中培養(yǎng)細(xì)胞。在第7天回收培養(yǎng)物上清液并定義為P4-d7樣品。
<通過給表達(dá)LacZ的細(xì)胞的計(jì)數(shù)來測定CIU(LacZ-CIU)>
以2.5×106個細(xì)胞/孔把LLC-MK2細(xì)胞接種到6孔平板上，培養(yǎng)24小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗一次細(xì)胞并且在37℃用MEM培養(yǎng)基連續(xù)稀釋1/10倍的P3-d7感染1小時。然后，用MEM培養(yǎng)基把這些細(xì)胞沖洗一次并加入1.5ml的含有10％血清的MEM培養(yǎng)基。在37℃培養(yǎng)3天后，用β-Gal染色試劑盒(Invitrogen)染色該細(xì)胞。圖44顯示了重復(fù)三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于對LacZ染色陽性的細(xì)胞計(jì)數(shù)，在任何情況下在P3-d7樣品中都得到1×106CIU/ml病毒。
用仙臺病毒中的極性作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)量<SeV基因組cDNA的構(gòu)建>
在各基因的起始信號和ATG翻譯起始信號之間，把另外新的NotI位點(diǎn)引入仙臺病毒(SeV)全長基因組cDNA，即pSeV(+)中(Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1569-579，1996)。尤其是，用瓊脂凝膠電泳分離用SphI/SalI消化的pSeV(+)的片段(2645bp)、ClaI消化的pSeV(+)的片段(3246bp)和ClaI/EcoRI消化的pSeV(+)的片段(5146bp)并且切取相應(yīng)的條帶，然后將其回收并用QIAEXII凝膠提取系統(tǒng)(QIAGEN)純化，如圖45(A)所示。為了亞克隆，把SphI/SalI消化的片段、ClaI消化的片段和ClaI/EcoRI消化的片段分別連接于LITMUS38(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)、pBluescriptII KS+(STRATAGENE)和pBluescriptII KS+(STRATAGENE)。使用快速變化的位點(diǎn)指示誘變試劑盒(STRATAGENE)以引入NotI位點(diǎn)。對每次引入所合成和使用的引物，對NP-P來說，為有義鏈5′-ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3′(SEQ IDNO19)，反義鏈5′-ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3′(SEQ IDNO20)，對P-M來說，有義鏈為5′-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcaga tatctatag-3′(SEQ ID NO21)，反義鏈為5′-ctatagatatctgccattgcggccgcttaggtg aaatttc-3′(SEQID NO22)，對M-F來說，有義鏈為5′-gggataaagtcccttgcggccgcttggttgcaaaactctccc-3′(SEQ ID NO23)，反義鏈為5′-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3′(SEQ ID NO24)，對F-HN來說，有義鏈為5′-ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3′(SEQ ID NO25)，反義鏈為5′-ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3′(SEQ ID NO26)，對HN-L來說，有義鏈為5′-cctgcccatccatgacctagcggccgcttcccattcaccctggg-3′(SEQID NO27)，反義鏈為5′-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3′(SEQ ID NO28)。
使用SalI/SphI片段作NP-P的模板，ClaI片段作P-M和M-F的模板并且用ClaI/EcoRI片段作F-HN和HN-L的模板，如上所述將其亞克隆，并且按照可快速變化的位點(diǎn)指示誘變試劑盒所附的說明進(jìn)行引入。用亞克隆所用的相同酶再消化所得物、回收并純化。然后，將它們裝配成仙臺病毒基因組cDNA。結(jié)果，如圖45(B)所示構(gòu)建了5種仙臺病毒的基因組cDNA(pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FHN和pSeV(+)HNL)，其中把NotI位點(diǎn)引入每個基因之間。
作為測試基因表達(dá)量的報道基因，通過PCR亞克隆人分泌型的堿性磷酸酶(SEAP)。作為引物，合成了加有AscI限制酶位點(diǎn)的5′引物5′-gcggcgcgccatgctgctgctgctgctgctgctgggcctg-3′(SEQ ID NO29和3′引物5′-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagcggccggccg-3′(SEQ ID NO30)，并進(jìn)行PCR。用pSEAP-Basic(CLONTENCH)作模板并用Pfu tourbo DNA聚合酶(STRATAGENE)作酶。PCR之后，用AscI消化所得物，然后回收并用電泳法純化。構(gòu)建了在其NotI位點(diǎn)摻有含多克隆位點(diǎn)(PmeI-AscI-SwaI)和終止信號-間插序列-起始信號的合成雙鏈DNA[有義鏈5′-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3′(SEQ ID NO31，反義鏈5′-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggatttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3′(SEQ ID NO32]的pBluescriptII KS+作為亞克隆的質(zhì)粒(圖46)。把回收和純化的PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒的AscI位點(diǎn)并克隆。用NotI消化所得物并回收SEAP基因片段，通過電泳法純化以分別連接到5種類型的仙臺病毒基因組的cDNA和pSeV18+的NotI位點(diǎn)。把所得到的病毒載體分別命名為pSeV(+)NPP/SEAP、pSeV(+)PM/SEAP、pSeV(+)MF/SEAP、pSeV(+)FHN/SEAP、pSeV(+)HNL/SEAP和pSeV18(+)/SEAP。
<病毒的重建>
以2×106個細(xì)胞/平皿把LLC-MK2細(xì)胞接種到100cm的培養(yǎng)平皿上，培養(yǎng)24小時后，在室溫下用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒(PLWUV-VacT7)(Fuerst，T.R.等，Pro.Natl.Acad.Sci.美國838122-8126，1986，Kato，A.等，《基因細(xì)胞》1569-579，1996)感染該細(xì)胞1小時(感染復(fù)數(shù)＝2)。其中把病毒用補(bǔ)骨脂和UV預(yù)處理。分別以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比例把每種摻有SEAP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L的仙臺病毒cDNA懸浮于最適MEM培養(yǎng)基(GIBCO)中，加入110μlSuperfect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)，將其在室溫下放置15分鐘并加入3ml含有3％FBS的最適MEM。然后，沖洗細(xì)胞并加入DNA-SuperFect混合物。培養(yǎng)3到5小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基把這些細(xì)胞沖洗兩次，并在含有胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖甙(AraC)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時?；厥者@些細(xì)胞并將粒狀沉淀懸浮于1mlPBS中，凍融三次。把100μl所得物接種到雞胚中，該雞胚預(yù)接種了10天，再在35℃溫育3天，然后回收絨毛尿囊液。把所收集的絨毛尿囊液稀釋到10-5到10-7并給雞胚再接種使其成為不含病毒的疫苗，然后同樣地回收并在-80℃儲存一小份。將該病毒載體命名為SeVNPP/SEAP、SeVPM/SEAP、SeVMF/SEAP、SeVFHN/SEAP、SeVHNL/SEAP和SeV18/SEAP。
<用噬斑測定法進(jìn)行滴度測定>
以5×105個細(xì)胞/孔把CV-1細(xì)胞接種到6孔平板上并培養(yǎng)24小時。用PBS沖洗后，用BSA/PBS(PBS中含1％BSA)稀釋為10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的重組SeV給細(xì)胞接種1小時，再用PBS沖洗，然后以3ml/孔的BSA/MEM/瓊脂(0.2％BSA+2×MEM，混有等體積的2％瓊脂)涂布并在37℃0.5％二氧化碳下培養(yǎng)6天。培養(yǎng)后，加入3ml乙醇/醋酸(乙醇∶醋酸＝1∶5)并放置3小時，然后用瓊脂去除。用PBS沖洗三次后，在室溫用稀釋100倍的兔抗仙臺病毒抗體溫育細(xì)胞1小時。然后，用PBS沖洗三次后，在室溫用稀釋了200倍的Alexa FlourTM標(biāo)識的山羊抗兔Ig(G+H)(分子探針)把細(xì)胞接種1小時。用PBS沖洗三次后，通過熒光圖象分析儀LAS1000(富士膠片)得到熒光圖象并測定噬斑。結(jié)果顯示在圖47中。另外，所得到的滴度結(jié)果顯示在表3中。
表3從噬斑測定法測得的各重組仙臺病毒的滴度結(jié)果

<報導(dǎo)基因表達(dá)的比較>
分別以1-5×105個細(xì)胞/孔把LLC-MK2細(xì)胞接種到6孔平板上并培養(yǎng)24小時，在感染復(fù)數(shù)＝2感染各病毒載體。24小時后，回收100μl培養(yǎng)物上清液并進(jìn)行SEAP測定。用報導(dǎo)測定試劑盒-SEAP-(東洋紡)完成檢測并用熒光圖象分析儀LAS1000(富士膠片)測定。通過把SeV18+/SEAP的值指定為100，以相對值來顯示所測值。結(jié)果，如圖48中所示，不管插入SEAP基因的位置如何都測定到了SEAP的活性。發(fā)現(xiàn)趨于基因組的下游SEAP的活性下降，即表達(dá)量下降。另外，當(dāng)把SEAN基因插入NP和P基因之間時，與當(dāng)把SEAP插入NP基因上游時并且把SEAP基因插入P和M基因之間時相比，測定到中等表達(dá)量。
用雙倍缺陷的ΔF-HN的涂布方法增加缺陷SeV的增殖效率由于現(xiàn)在所用的SeV病毒重建方法使用了表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組痘苗蛋白(vTF7-3)，痘苗病毒的細(xì)胞毒性殺滅了部分感染的細(xì)胞。另外，病毒增殖可能僅僅在部分細(xì)胞中并且如果在更多細(xì)胞中有效和持久地進(jìn)行病毒增殖這是優(yōu)選的。但是，在副粘病毒情況中，當(dāng)相同類型病毒的F和HN蛋白同時存在于細(xì)胞表面時，會發(fā)生合胞體形成(Lamb和Kolakofsky，1996，F(xiàn)ields virology，第1189頁)。因此，難以對FHN共表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。所以，本發(fā)明人考慮到了缺陷病毒的回收效率可以通過在重建細(xì)胞上涂布表達(dá)缺陷蛋白(F和HN)輔助細(xì)胞的方法來增加。通過檢測具有不同F(xiàn)HN表達(dá)時間的涂布細(xì)胞，F(xiàn)HN共缺陷病毒的病毒回收效率顯著增加。
在室溫用PLWUV處理的痘苗病毒在感染復(fù)數(shù)＝2感染在10cm培養(yǎng)基平皿上生長成100％融合的LLC-MK2細(xì)胞(1×107個細(xì)胞/平皿)1小時。之后，分別(3ml/10cm平皿作最終體積)混合12μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿、2μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿的含有d2EGFP FHN缺陷的cDNA(pSeV18/ΔFHN-d2GFP(實(shí)施例8))、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN，并且使用基因?qū)朐噭㏒uperFect(QIAGEN)，采用類似于重建F缺陷病毒的上述方法用基因引入LLC-MK2細(xì)胞中。3小時后，用不含血清的培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞三次，然后，低速離心(1000rpm/2分鐘)回收脫離細(xì)胞并懸浮于含有40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷的AraC(Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的無血清的MEM培養(yǎng)基中，并加到細(xì)胞中培養(yǎng)一夜。將分離制備的FHN共表達(dá)的細(xì)胞，它們在10cm培養(yǎng)平皿中為100％融合，在感染復(fù)數(shù)＝10用腺病毒AxCANCre誘導(dǎo)，并且用5ml的PBS(-)在第4小時、第6小時、第8小時、第2天和第3天分別對細(xì)胞沖洗一次，并用細(xì)胞解離溶液(Sigma)剝離。通過低速離心(1000rpm/2分鐘)回收細(xì)胞并懸浮于含有40μg/ml的AraC(Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的無血清的MEM培養(yǎng)基中。然后將其加給重建了FHN共缺陷病毒(P0)的細(xì)胞中并培養(yǎng)一夜。細(xì)胞涂布后兩天，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞以確認(rèn)通過細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)的病毒的擴(kuò)散。結(jié)果顯示在圖49中。當(dāng)與沒有細(xì)胞涂布的通常情況(左邊平面)相比，當(dāng)細(xì)胞涂布在細(xì)胞上(右邊)時觀察到明顯多的表達(dá)GFP的細(xì)胞。回收這些細(xì)胞，將其懸浮于107個細(xì)胞/ml的最適MEM培養(yǎng)基(GIBCO)中并且凍融三次來制備細(xì)胞裂解物。然后，用該裂解物以106個細(xì)胞/100μl/孔感染誘導(dǎo)后2天的FHN共表達(dá)的細(xì)胞，并且在37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中在含有40μg/ml的AraC(Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的無血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，通過CIU-GFP測定P1細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液的病毒滴度(表4)。結(jié)果，F(xiàn)HN感染后4小時，沒有測定到病毒擴(kuò)增的作用，并且由于細(xì)胞的涂布在感染后6小時或更長時間測定到顯著的擴(kuò)增作用。尤其是，在進(jìn)行細(xì)胞涂布6小時后釋放到P1細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的病毒比沒有進(jìn)行細(xì)胞涂布時多10倍。
表4用雙倍缺陷的ΔF-HN的細(xì)胞涂布方法擴(kuò)增缺陷SeVGFP-CIU×103/mlFHNccll+ad/creFIIN細(xì)胞4小時6小時8小時2天3天8-106-980-10070-10060-10020-50[實(shí)施例17]對假型仙臺病毒具有F缺陷的基因組的確認(rèn)對感染細(xì)胞的細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析以證實(shí)通過上述表達(dá)VSV-G基因增殖的病毒是否是F缺陷型。結(jié)果，測定到了來自仙臺病毒的蛋白，相反沒有測定到F蛋白，證實(shí)了它是F缺陷型(圖50)。
抗VSV抗體對含有F和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒感染性的作用為了發(fā)現(xiàn)通過VSV-G表達(dá)系所獲得的含有F和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒是否在其衣殼體中含有VSV-G蛋白，使用抗VSV抗體檢測是否影響感染性的中和活性。把病毒溶液和抗體混合并在室溫下放置30分鐘。然后，用該混合物感染沒有誘導(dǎo)VSV-G表達(dá)的LLCG-L1細(xì)胞，并且通過表達(dá)GFP細(xì)胞是否存在分析第4天的基因?qū)肽芰?。結(jié)果，通過在含有F和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒(在圖中VSV-G)中的抗VSV抗體看到對感染性的顯著抑制，相反在含有衣殼體的仙臺病毒(在圖中F、HN)中沒有測定到抑制(圖51)。這樣，證實(shí)了本發(fā)明實(shí)施例所得到的病毒是含有VSV-G蛋白作為其衣殼體的假型仙臺病毒，并且抗體能夠特異性抑制其感染。
采用密度梯度超離心法純化含有F基因缺陷的和F和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒使用病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行蔗糖密度梯度超離心，以分級分離和純化含有F基因和F和HN基因的缺陷基因組的假型仙臺病毒。用20到60％的梯度把病毒溶液加到蔗糖溶液之上，然后使用SW41轉(zhuǎn)頭(Beckman)以29000rpm超離心15到16小時。超離心后，在試管底部作孔，然后使用分級收集器收集300μl餾分。對每個餾分，進(jìn)行Western分析以試驗(yàn)病毒是含有缺陷F基因或F和HN基因的基因組的假型仙臺病毒，并且用VSV-G蛋白作衣殼體。用上述方法完成Western分析。結(jié)果，在F缺陷的假型仙臺病毒中的相同餾分里測得源自仙臺病毒的蛋白、HN蛋白和VSV-G蛋白，但沒有測得F蛋白，這證實(shí)了它是F缺陷的假型仙臺病毒。另一方面，在F和HN缺陷的假型仙臺病毒中，在相同餾分里測得了源于仙臺病毒的蛋白和VSV-G蛋白，相而沒有測得F和HN蛋白，這證實(shí)了它是F和HN缺陷的假型仙臺病毒(圖52)。
通過含有F基因缺陷的以及F和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒來克服血細(xì)胞凝集作用或者用含有F基因缺陷的和F或HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒或者用含有正常衣殼體的仙臺病毒感染LLC-MK2細(xì)胞，并在第3天，加入1％雞紅血細(xì)胞懸浮液，并在4℃放置30分鐘。之后，觀察感染的表達(dá)GFP細(xì)胞的細(xì)胞表面。結(jié)果，對含有F基因缺陷的基因組的病毒和F缺陷的假型仙臺病毒(Sev/ΔF和帶SVS-G的假型Sev/ΔF(VSV-G))來說，在感染的細(xì)胞表面觀察到了凝集反應(yīng)，對含有原始衣殼體的仙臺病毒也是一樣。另一方面，對含有F和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒(Sev/ΔF-HN(VSV-G))來說，在感染細(xì)胞表面沒有觀察到凝集反應(yīng)(圖53)。
含有F基因缺陷基因組的VSV-G假型仙臺病毒對培養(yǎng)的細(xì)胞的感染特異性通過用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)感染后3天的存活細(xì)胞中的表達(dá)GFP的程度來測定含有F基因缺陷基因組的VSV-G假型仙臺病毒對培養(yǎng)的細(xì)胞的感染特異性。使用在含有F基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒的LLC-MK2細(xì)胞中幾乎顯示出相同感染效率，含原始衣殼體的仙臺病毒用作對照組。結(jié)果，在人卵巢癌HRA細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)感染效率的差異，而相對于對照組，在T細(xì)胞譜系中的Jurkat細(xì)胞中含有F基因缺陷的基因組的VSV-G假型仙臺病毒的感染效率增加了約2倍(圖54)。
含有NGF的F缺陷型仙臺病毒載體的構(gòu)建<NGF/SeV/ΔF的重建>
按照上述“包膜質(zhì)粒+表達(dá)F的細(xì)胞涂布方法”完成NGF/SeV/ΔF的重建。通過使用抗SeV多克隆抗體的方法完成滴度的測定。
<NGF/SeV/ΔF病毒基因組的確認(rèn)(RT-PCR)>
為了證實(shí)NGF/SeV/ΔF(RT-PCR)病毒基因組(圖55，較上平面)，離心從LLC-MK2/F7細(xì)胞中回收的培養(yǎng)物上清液，并按照廠商手冊用QIAamp病毒RNA微型試劑盒(QIAGEN)提取RNA。使用RNA模板，用SUPERSCRIPTTMONE-STEPTMRT-PCR系統(tǒng)(GIBCO BRL)進(jìn)行RT-PCR的合成和PCR。使用另外類型的SeV cDNA(pSeV18+b(+))(Hasan，M.K.等，J.GeneralVirology782813-2820，1997)作為對照組。把NGF-N和NGF-C用作PCR引物。對NGF-N來說，使用正向ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG(SEQ ID NO33)，并且對NGF-C來說，使用反向ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC(SEQ ID NO34)。結(jié)果，當(dāng)使用NGF-N和NGF-C作引物時，在RT條件下對NGF/SeV/ΔF測定NGF特殊條帶。對對照組來說，沒有測得條帶(圖55，底部平面)。
NGF蛋白定量和感染含有NGF基因的F缺陷型SeV后體外表達(dá)活性的測定使用在直徑為10cm或6cm的培養(yǎng)平板上生長至幾乎融合的LLC-MK2/F或LLC-MK2細(xì)胞完成感染和NGF蛋白的表達(dá)。在感染復(fù)數(shù)為0.01時，把NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染給LLC-MK2/F細(xì)胞，并且把NGF/SeV和GFP/SeV感染給LLC-MK2細(xì)胞，用不含血清含有7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后，其中幾乎100％的細(xì)胞被感染，把培養(yǎng)基更換成不含胰蛋白酶和血清的MEM培養(yǎng)基并且再培養(yǎng)3天。然后，回收每個培養(yǎng)物上清液并在48,000×g離心60分鐘。然后，進(jìn)行NGF蛋白定量和感染含有NGF基因的F缺陷型SeV后體外表達(dá)活性的測定。盡管在本實(shí)施例中，把F缺陷型SeV(NGF/SeV/ΔF，NGF/SeV/ΔF-GFP)(見圖55)感染給LLC-MK2/F細(xì)胞，如果用較高的感染復(fù)數(shù)(如1或3)感染，即，從開始幾乎感染了100％細(xì)胞，也能用不表達(dá)F的細(xì)胞進(jìn)行得出相似結(jié)果的試驗(yàn)。
對NGF蛋白定量來說，使用ELISA試劑盒NCF Emax免疫測定系統(tǒng)(Promega)和所附的手冊。分別在NGF/SeV/ΔF、NGF/SeV/ΔF-GFP和NGF/SeV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中測得32.4μg/ml、37.4μg/ml和10.5μg/ml的NGF蛋白。在NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中，存在高濃度的NGF蛋白，類似于NGF/SeV感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，證實(shí)了F缺陷型SeV能夠表達(dá)足夠的NGF。
完成NGF蛋白體外活性的測定是通過使用雞背部根神經(jīng)節(jié)的解離培養(yǎng)物(DRG；雞的感覺神經(jīng)元)，該神經(jīng)節(jié)是雞的感覺神經(jīng)元，并且使用維持存活活性作指標(biāo)(神經(jīng)生長因子(Wiley，紐約)，第95-109頁(1989))。從第10天的雞胚胎中取出背根部神經(jīng)節(jié)，并在37℃0.25％胰蛋白酶(GIBCO)處理20分鐘后將其分散。使用含有100單位/ml青霉素(GIBCO)、100單位/ml鏈霉素(GIBCO)、250ng/ml的兩性霉素B(GIBCO)、20μM 2-脫氧尿苷(Nakarai)、20μM5-氟脫氧尿苷(Nakarai)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)和5％血清的高葡萄糖D-MEM培養(yǎng)基，以大約5000個細(xì)胞/孔把細(xì)胞接種到96孔平板上。使用前再用層粘素(Sigma)包被已用聚賴氨酸預(yù)包被的96孔平板(Iwaki)。在開始培養(yǎng)時，加入對照的NGF蛋白或提前制備好的SeV感染后培養(yǎng)物上清液。3天后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞以及通過加入Alamer蘭(CosmoBio)并使用線粒體的還原活性作指標(biāo)(測定590nm熒光，具有530nm激發(fā))進(jìn)行存活細(xì)胞的定量。在對照組(沒有加入NGF)中得到等價熒光信號，并且加入用SeV/附加型GFP(GFP-SeV)感染的稀釋1/1000的培養(yǎng)物上清液，而用NGF/SeV/ΔF、NGF/SeV/ΔF-GFP和NGF/SeV感染的細(xì)胞的1/1000稀釋的培養(yǎng)物上清液引起顯著的熒光密度的增加，并且判斷為含有較高數(shù)量的存活細(xì)胞和存活活性(圖56)。作用值與從ELISA中計(jì)算出的NGF蛋白的加入量具有可比性。在顯微鏡下的觀察證實(shí)了相似作用。即，通過加入用NGF/SeV/ΔF、NGF/SeV/ΔF-GFP和NGF/SeV感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，能夠觀察到存活細(xì)胞的增長和顯著的軸突延伸(圖57)。這樣，證實(shí)了感染含有NGF的F缺陷型SeV后所表達(dá)的NGF是具有活性。
表達(dá)F細(xì)胞的詳細(xì)分析1.Adeno-Cre的感染復(fù)數(shù)和誘導(dǎo)時間通過使用Adeno-Cre的不同感染復(fù)數(shù)、感染LLC-MK2/F細(xì)胞并在F蛋白誘導(dǎo)后，分析蛋白表達(dá)的量和細(xì)胞形狀的變化。
在感染復(fù)數(shù)＝10的表達(dá)量微微高于感染復(fù)數(shù)＝1(圖58)的量。當(dāng)在誘導(dǎo)后6小時、12小時、24小時和48小時分析表達(dá)量時，在所有情況下都測定到在誘導(dǎo)后48小時F蛋白的高表達(dá)量。
此外，當(dāng)用感染復(fù)數(shù)＝1、3、10、30和100感染細(xì)胞時，一直監(jiān)控細(xì)胞形狀的變化。盡管細(xì)胞在達(dá)到感染復(fù)數(shù)＝10發(fā)現(xiàn)顯著差異，但在感染復(fù)數(shù)＝30或更高時觀察到細(xì)胞毒性(圖59)。
2.傳代數(shù)用Adeno-Cre把F蛋白誘導(dǎo)入LLC-MK2/F后，將細(xì)胞傳代7次，用顯微鏡觀察分析F蛋白的表達(dá)和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。另一方面，在傳代到第20代的細(xì)胞中的F蛋白誘導(dǎo)后，使用激光顯微鏡來分析細(xì)胞內(nèi)F蛋白的定位。
用于激光顯微鏡的觀察，把用F蛋白表達(dá)誘導(dǎo)的LLC-MK2/F細(xì)胞倒入玻璃室內(nèi)并且在培養(yǎng)一夜后，除去培養(yǎng)基并用PBS沖洗一次，然后用3.7％福爾馬林-PBS固定5分鐘。再用PBS沖洗細(xì)胞一次后，用0.1％TritonX100-PBS把細(xì)胞處理5分鐘，并用抗F蛋白單克隆抗體(γ-236)(稀釋100倍)和FITC所標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(稀釋200倍)依次處理，最后用PBS沖洗并用激光顯微鏡觀察。
結(jié)果，在傳代7次的細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)F蛋白表達(dá)量的差異(圖60)。在形態(tài)學(xué)上、sev感染性和生產(chǎn)率方面也沒有觀察的顯著差異。另一方面，當(dāng)使用免疫-抗體方法分析細(xì)胞傳代到20次的細(xì)胞F蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位時，到第15代未發(fā)現(xiàn)大的差異，但在傳代多于15次的細(xì)胞中觀察到F蛋白的定位趨向(圖61)。
總之，我們認(rèn)為在15代前的細(xì)胞對F缺陷SeV的生產(chǎn)是理想的。
GFP-CIU與抗-SeV-CIU之間的聯(lián)系分析兩種方法測定的感染細(xì)胞的單位(CIU)結(jié)果之間的關(guān)系。以2×105個細(xì)胞/平皿把LLC-MK2細(xì)胞接種到12孔平板上，培養(yǎng)24小時后，用不含血清的MEM培養(yǎng)基沖洗一次細(xì)胞并且用100μl/孔SeV/ΔF-GFP感染。15分鐘后，以1ml/孔加入不含血清的MEM培養(yǎng)基并且再培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，用PBS(-)沖洗三次細(xì)胞并干燥(在室溫下放置大約10到15分鐘)并加入1ml/孔丙酮以固定細(xì)胞，并立刻去除。把細(xì)胞再干燥(在室溫下放置10到15分鐘)。然后，以300μl/給細(xì)胞加入從兔制備并用PBS(-)稀釋100倍的抗SeV多克隆抗體(DN-1)并在37℃溫育45分鐘，并用PBS(-)沖洗三次。然后，以300μl/孔向細(xì)胞中加入用PBS(-)稀釋了200倍的熒光標(biāo)記的第二抗體抗兔IgG(H+D)(AlexTM568，分子探針)，在37℃溫育45分鐘并用PBS(-)沖洗三次。然后，在熒光顯微鏡下觀察帶熒光的細(xì)胞(發(fā)射560nm，吸收645nm，濾膜Leica)。
作為對照組，用100μl/孔的SeV/ΔF-GFP感染細(xì)胞，并在15分鐘后，以1ml/孔加入不含血清的MEM。再培養(yǎng)24小時后，在熒光顯微鏡下觀察表達(dá)GFP的細(xì)胞(發(fā)射360nm，吸收470nm，濾膜Leica)。
通過定量評價熒光密度得出良好的關(guān)系(圖62)。
多克隆位點(diǎn)的構(gòu)建把多克隆位點(diǎn)加到SeV載體中。如下是所使用的兩種方法。
1.破壞仙臺病毒(SeV)全長基因組cDNA和pSeV18+的基因組cDNA上的幾個限制位點(diǎn)，把含有所破壞的限制酶位點(diǎn)的其他新的限制酶位點(diǎn)引入每個基因的起始信號和ATG翻譯起始信號之間。
2.向已經(jīng)構(gòu)建好的SeV載體cDNA中加入多克隆位點(diǎn)序列和轉(zhuǎn)錄起始信號-間插序列-終止信號并摻入NotI位點(diǎn)。
在作為引入方法的方法1中，通過瓊脂電泳分離pSeV18+的EagI-消化的片段(2644bp)、ClaI-消化的片段(3246bp)、ClaI/EcoRI-消化的片段(5146bp)和EcoRI-消化的片段(5010bp)并截取相應(yīng)的條帶，然后將其回收并用QIAEXII凝膠提取系統(tǒng)(QIAGEN)純化。連接EagI-消化的片段并亞克隆到LITMUS38(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)中，并且把ClaI-消化的片段、ClaI/EcoRI-消化的片段和EcoRI-消化的片段連接并亞克隆到pBluescriptIIKS+(STRATAGENE)中。使用快速變化的位點(diǎn)指示誘變試劑盒(STRATAGENE)來破壞并引入限制位點(diǎn)。
對破壞限制酶位點(diǎn)來說，合成Sal I(有義鏈)5′-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3′(SEQ ID NO35)，(反義鏈)5′-ctgatcgattatcttgggtggacggtgttgagacttctcc-3′(SEQ ID NO36)，Nhe I(有義鏈)5′-gtatatgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3′(SEQ ID NO37)，(反義鏈)5′-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3′(SEQ ID NO38)，Xho I(有義鏈)5′-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3′(SEQ ID NO39)，(反義鏈)5′-ccaggtaactctttagtgactccagcctctctagagagttcattg-3′(SEQ ID NO40)，并且為了導(dǎo)入限制酶，合成NP-P(有義鏈)5′-gtgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3′(SEQ ID NO41)，(反義鏈)5′-cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3′(SEQ IDNO42)，P-M(有義鏈)5′-cttagggtgaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3′(SEQ ID NO43)，(反義鏈)5′-gatatctgccattgcgccgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3′(SEQ ID NO44)，M-F(有義鏈)5′-cttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaaactctcccc-3′(SEQ ID NO45)，(反義鏈)5′-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3′(SEQ ID NO46)，F(xiàn)-FH(有義鏈)5′-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcacagatcatgg-3′(SEQ ID NO47)，(反義鏈)5′-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3′(SEQ ID NO48)，HN-L(有義鏈)5′-cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-3′(SEQ ID NO49)，(反義鏈)5′-ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3′(SEQ ID NO50)，并用于反應(yīng)。引入后，回收各片段并如上類似地純化，并裝配cDNA。
在用方法2時，合成(有義鏈)5′-ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3′(SEQ ID NO51)和(反義鏈)5′-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactgttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3′(SEQ ID NO52)，磷酸化后，通過85℃退火2分鐘、65℃退火15分鐘、37℃退火15分鐘和室溫退火15分鐘來摻入SeV cDNA?；蛘撸褂煤薪K止信號-間插序列-起始信號的引物通過PCR亞克隆pUC18或pBluescriptII等的多克隆位點(diǎn)，然后把所得物摻入SeV cDNA。如上所述通過重組cDNA進(jìn)行病毒重建。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了副粘病毒科的包膜基因缺陷型病毒載體。本發(fā)明首次建立了新的實(shí)用的基于負(fù)鏈RNA病毒的包膜基因缺陷型載體系統(tǒng)。利用仙臺病毒的優(yōu)異特性，使用輔助細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了從F基因缺陷型、FHN基因缺陷型基因組cDNA中回收感染缺陷型病毒顆粒，為研究和開發(fā)基因治療的新載體鋪平了道路。本發(fā)明的缺陷型仙臺病毒載體能夠高效地把基因引入各種類型的細(xì)胞中，并非凡地高水平表達(dá)外源基因。而且，在持續(xù)感染細(xì)胞中能夠表達(dá)這種載體，并且由于該載體不能釋放二級感染病毒的顆粒，所以它是一個完全失去了引起病毒增殖的能力的高度安全的載體。
序列表<110>株式會社載體研究所(DNAVEC Research Inc.)<120>副粘病毒科的包膜基因缺陷型病毒載體<130>D3-103PCT<140><141><150>JP 1999-200739<151>1999-05-18<160>52<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>1atgcatgccg gcagatga18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>2gttgagtact gcaagagc 18<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>3tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc42<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>4atgcatgccg gcagatga 18<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>5tgggtgaatg agagaatcag c 21<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>6atgcatatgg tgatgcggtt ttggcagtac 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>7tgccggctat tattacttgt acagctcgtc 30<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>8atcagagacc tgcgacaatg c 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>9aagtcgtgct gcttcatgtg g 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41<210>20<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>20ccgaagccgt ggctgtcgcg gccgctgggt gtggtcggtg g41<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>21gaaatttcac ctaagcggcc gcaatggcag atatctatag 40<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>22ctatagatat ctgccattgc ggccgcttag gtgaaatttc 40<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>23gggataaagt cccttgcggc cgcttggttg caaaactctc ccc 43<210>24<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>24ggggagagtt ttgcaaccaa gcggccgcaa gggactttat ccc 43<210>25<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>25ggtcgcgcgg tactttagcg gccgcctcaa acaagcacag atcatgg 47<210>26<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>26ccatgatctg tgcttgtttg aggcggccgc taaagtaccg cgcgacc 47<210>27<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>27cctgcccatc catgacctag cggccgcttc ccattcaccc tggg 44<210>28<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>28cccagggtga atgggaagcg gccgctaggt catggatggg cagg 44<210>29<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>29gcggcgcgcc atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg40<210>30<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>30gcggcgcgcc cttatcatgt ctgctcgaag cggccggccg40<210>31<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>31gcggccgcgt ttaaacggcg cgccatttaa atccgtagta agaaaaactt agggtgaaag 60ttcatcgcgg ccgc 74<210>32<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>32gcggccgcga tgaactttca ccctaagttt ttcttactac ggatttaaat ggcgcgccgt 60ttaaacgcgg ccgc 74<210>33<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>33acttgcggcc gccaaagttc agtaatgtcc atgttgttct acactctg 48<210>34<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>34atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag cctcttcttg 60tagccttcct gc 72<210>35<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>35ggagaagtct caacaccgtc cacccaagat aatcgatcag 40<210>36<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>36ctgatcgatt atcttgggtg gacggtgttg agacttctcc 40<210>37<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>37gtatatgtgt tcagttgagc ttgctgtcgg tctaaggc38<210>38<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>38gccttagacc gacagcaagc tcaactgaac acatatac38<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>39caatgaactc tctagagagg ctggagtcac taaagagtta cctgg45<210>40<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>40ccaggtaact ctttagtgac tccagcctct ctagagagtt cattg45<210>41<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>41gtgaaagttc atccaccgat cggctcactc gaggccacac ccaaccccac cg52<210>42<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>42cggtggggtt gggtgtggcc tcgagtgagc cgatcggtgg atgaactttc ac52<210>43<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>43cttagggtga aagaaatttc agctagcacg gcgcaatggc agatatc 47<210>44<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>44gatatctgcc attgcgccgt gctagctgaa atttctttca ccctaag 47<210>45<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>45cttagggata aagtcccttg tgcgcgcttg gttgcaaaac tctcccc 47<210>46<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>46ggggagagtt ttgcaaccaa gcgcgcacaa gggactttat ccctaag 47<210>47<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>47ggtcgcgcgg tactttagtc gacacctcaa acaagcacag atcatgg 47<210>48<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>48ccatgatctg tgcttgtttg aggtgtcgac taaagtaccg cgcgacc 47<210>49<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>49cccagggtga atgggaaggg ccggccaggt catggatggg caggagtcc49<210>50<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>50ggactcctgc ccatccatga cctggccggc ccttcccatt caccctggg 49<210>51<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>51ggccgcttaa ttaacggttt aaacgcgcgc caacagtgtt gataagaaaa acttagggtg 60aaagttcatc ac 72<210>52<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>52ggccgtgatg aactttcacc ctaagttttt cttatcaaca ctgttggcgc gcgtttaaac 60cgttaattaa gc 7權(quán)利要求
1.一種含有復(fù)合體的副粘病毒科病毒載體，所述復(fù)合體包含(a)副粘病毒衍生的負(fù)鏈單鏈RNA，其已被修飾為不表達(dá)副粘病毒科的病毒的至少一種包膜蛋白，和(b)與該負(fù)鏈單鏈RNA結(jié)合的蛋白。
2.權(quán)利要求1的載體，其中所述負(fù)鏈單鏈RNA表達(dá)NP蛋白、P蛋白和L蛋白，并且已被修飾為不表達(dá)F蛋白和/或HN蛋白。
3.權(quán)利要求1或2的載體，它至少含有一種包膜蛋白，該蛋白的表達(dá)在修飾的負(fù)鏈單鏈RNA中受到抑制。
4.權(quán)利要求1到3中任何一項(xiàng)的載體，其含有VSV-G蛋白。
5.權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)的載體，其中所述負(fù)鏈單鏈RNA源于仙臺病毒。
6.權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的載體，其中所述負(fù)鏈單鏈RNA還編碼一種外源基因。
7.一種DNA，其編碼權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)的載體中所含的負(fù)鏈單鏈RNA或其互補(bǔ)鏈。
8.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)所述載體的方法，該方法含有下列步驟(a)通過將載體DNA導(dǎo)入細(xì)胞而使其表達(dá)，其中所述載體編碼副粘病毒衍生的負(fù)鏈單鏈RNA或其互補(bǔ)鏈且經(jīng)修飾而不表達(dá)副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白，而所述細(xì)胞則表達(dá)所述包膜蛋白，(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞，并且(c)從培養(yǎng)上清中回收病毒顆粒。
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1到6中任何一項(xiàng)所述載體的方法，該方法含有下列步驟(a)將一種復(fù)合體導(dǎo)入細(xì)胞，其中所述復(fù)合體含有經(jīng)修飾不表達(dá)副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白的副粘病毒衍生性負(fù)鏈單鏈RNA和能與所述負(fù)鏈單鏈RNA結(jié)合的蛋白，而所述細(xì)胞能表達(dá)所述包膜蛋白，(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞，并且(c)從培養(yǎng)上清中回收病毒顆粒。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中步驟(b)的細(xì)胞培養(yǎng)是與表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞共培養(yǎng)。
11.權(quán)利要求8或9的方法，其中在步驟(b)的細(xì)胞培養(yǎng)中將表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞置于所述細(xì)胞的上層。
12.權(quán)利要求8到11中任何一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞所表達(dá)的至少一種包膜蛋白與在上述負(fù)鏈單鏈RNA中表達(dá)受到抑制的至少一種包膜蛋白相同。
13.權(quán)利要求8到12中任何一項(xiàng)所述的方法，其中由細(xì)胞表達(dá)的至少一種包膜蛋白是VSV-G蛋白。
全文摘要
通過使用F基因缺陷型仙臺病毒基因組cDNA成功地回收了F基因缺陷型病毒的病毒顆粒。而且,通過使用表達(dá)F的細(xì)胞作輔助細(xì)胞成功地構(gòu)建了F基因缺陷型感染性病毒顆粒。通過使用F基因和HN基因均有缺陷的病毒基因組cDNA也成功地回收了F基因和HN基因缺陷型病毒的病毒顆粒。而且,通過使用表達(dá)F和HN的細(xì)胞作輔助細(xì)胞成功地生產(chǎn)了F基因和HN基因缺陷型感染性病毒顆粒。通過使用表達(dá)F的細(xì)胞作輔助細(xì)胞構(gòu)建了F基因和HN基因有缺陷且含有F蛋白的病毒。而且,使用表達(dá)VSV－G的細(xì)胞成功地構(gòu)建了VSV－G假型病毒。構(gòu)建這些缺陷型病毒的技術(shù)可用于開發(fā)基因治療中所用的副粘病毒科的載體。
文檔編號C12N15/86GK1355851SQ00805673
公開日2002年6月26日 申請日期2000年5月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月18日
發(fā)明者北里海雄, 朱亞峰, 上田泰次, 長谷川護(hù), 飯?zhí)镎虏? 時任文乃, 平田隆洋, 德炭剛, 隈秀和, 淺川誠 申請人:株式會社載體研究所