專利名稱：純化病毒包膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒(例如日本血凝病毒，下文中稱為HVJ)包膜的工業(yè)純化方法。純化的病毒包膜可用作導(dǎo)入生物聚合物如基因等到細(xì)胞和活生物內(nèi)的載體。
背景技術(shù)：
為了引入基因到培養(yǎng)的細(xì)胞和活組織內(nèi)用于進(jìn)行基因功能分析和基因治療，已開發(fā)了多種病毒方法和非病毒方法(MUlligan，Science，260，926-932，1993，和Ledley，Human Gene Therapy，vol.6，1129-1144，1995)。為了導(dǎo)入基因到細(xì)胞內(nèi)，病毒方法通常是有效的。但是，使用病毒載體的方法存在安全性問題，因?yàn)榇嬖谟H代病毒派生的基因?qū)爰捌浔磉_(dá)的可能性、免疫原性和宿主基因組結(jié)構(gòu)修飾的可能性。另一方面，使用脂質(zhì)體等的大多數(shù)非病毒方法表現(xiàn)出比病毒方法低的細(xì)胞毒性和低的免疫原性。但是，基因?qū)氲脚囵B(yǎng)的細(xì)胞和活組織內(nèi)的效率往往低于用病毒載體。
HVJ為屬于副粘病毒屬(Paramyxoviridae)的病毒，其具有包膜以及在包膜表面上的血凝素和神經(jīng)氨酸苷酶。HVJ引起了對融合Ehrlich腫瘤細(xì)胞的關(guān)注(Okada，Biken Journal，1，103-110，1958)，已進(jìn)行了細(xì)胞膜融合活性(下文中稱為融合活性)的分析，并研究了它作為轉(zhuǎn)基因載體的用途。HVJ具有高的免疫原性，并已知能誘導(dǎo)CTL，尤其當(dāng)大量產(chǎn)生NP蛋白時(shí)(Cole G.A.等，Journal of ImmUnology158，4301-4309，1997)。此外，擔(dān)心宿主抑制蛋白質(zhì)合成。因此，設(shè)計(jì)了一種通過用預(yù)先經(jīng)紫外輻射滅活的HVJ融合包括基因或蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體制備融合顆粒(HVJ-脂質(zhì)體)的方法，通過這種方法，使到細(xì)胞或活生物內(nèi)的非侵入性基因?qū)氤蔀榭赡?美國專利5631237，Dzau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93,11421-11425,1996，和Kaneda等，Molecular Medicine Today，5,298-303,1999)。但是，這種方法是復(fù)雜的，因?yàn)樾枰苽洳《竞椭|(zhì)體兩種不同的小泡。另外，已闡明HVJ-脂質(zhì)體的平均直徑為HVJ顆粒的平均直徑的1.3倍，并表現(xiàn)出降低到不超過單獨(dú)HVJ十分之一的融合活性。
Kaneda開發(fā)了能高效率導(dǎo)入基因到細(xì)胞內(nèi)并表現(xiàn)出高安全性的HVJ載體(WO01/57204)。具體地說，包括HVJ的有包膜病毒的基因組被滅活，生物聚合物如基因等被包括在其包膜內(nèi)，并使用病毒作為被導(dǎo)入到細(xì)胞或活生物內(nèi)的載體。但是，在這個(gè)階段，還沒有確立HVJ包膜的有效純化方法。
此外，Kaneda開發(fā)了一種方法，包括在雞蛋中產(chǎn)生HVJ，和通過過濾、膜濃縮、超濾、離子交換色譜分離和超濾步驟純化HVJ(WO03/014338)。但是，由于這種方法在柱之前包括過濾和膜濃縮兩個(gè)處理步驟，因此物理刺激降低了HVJ的活性，并且因這個(gè)階段的捕獲造成的回收率降低是不可避免的。
作為病毒純化方法，WO96/27677中已開發(fā)了使用離子交換樹脂和固定化金屬親和樹脂的腺病毒純化方法。但是，由于腺病毒沒有包膜，因此這種方法作為有包膜病毒純化方法不適用。盡管提出了聯(lián)合使用離子交換樹脂和疏水樹脂的方法作為腺病毒的純化方法，但沒有公開具體的例子。
盡管WO91/00104公開了通過親和色譜法純化有包膜病毒的HN蛋白和F蛋白的方法，但該方法不適用于純化病毒包膜的方法，病毒包膜為多種蛋白質(zhì)的集合體。
因此，需要開發(fā)能解決上述問題并表現(xiàn)出較高回收率同時(shí)保持HVJ活性的有效產(chǎn)生病毒包膜的純化方法。
發(fā)明公開本發(fā)明的挑戰(zhàn)在于開發(fā)一種以較高回收率純化病毒包膜同時(shí)保持病毒融合活性的方法。
包括HVJ的包膜病毒為由幾種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖鏈組成的結(jié)合蛋白質(zhì)，并通常是粒度為幾百納米的大顆粒。因此，預(yù)計(jì)它們具有復(fù)雜的表面電荷和非常高的疏水性。因此，據(jù)說具有高分離能力的最近的色譜法載體由于具有較小的孔尺寸(載體表面上許多孔中一個(gè)的孔徑)和每個(gè)載體小的表面積并被設(shè)計(jì)來分離相對小的分子，因此不能充分利用HVJ和載體表面之間的各種相互作用。換句話說，為了分離大的強(qiáng)疏水分子如HVJ，需要能允許HVJ在載體內(nèi)部分布的寬松孔尺寸或足夠表面積、允許HVJ結(jié)合的官能團(tuán)之間的足夠距離和與足夠的結(jié)合常數(shù)和適宜的離解常數(shù)的相互作用。
培養(yǎng)物上清液含各種除HVJ之外的雜質(zhì)。但是，它們中的大多數(shù)為比HVJ小的分子或粒子。由于目前大多數(shù)色譜法載體具有對小尺寸分子側(cè)的選擇性，因此它們不能適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)物上清液中分離HVJ。因此，需要考慮適用于HVJ的純化方法。本發(fā)明人在嘗試解決上述問題中進(jìn)行了廣泛研究。結(jié)果，建立了包括疏水色譜法、優(yōu)選疏水色譜法和陰離子交換色譜法和/或凝膠過濾色譜法聯(lián)合的純化方法。
也就是說，作為解決問題的手段，本發(fā)明提供一種具有高回收率并同時(shí)保持病毒包膜的細(xì)胞融合活性的有效純化病毒包膜的方法。本發(fā)明的主題涉及(1)一種純化病毒包膜的方法，包括使用疏水色譜法，(2)(1)的方法，其中上述疏水色譜法的官能團(tuán)為弱疏水基，(3)(1)或(2)的方法，其中上述疏水色譜法的官能團(tuán)為低聚乙二醇基或苯基，(4)(1)-(3)的方法，其中上述疏水色譜法的官能團(tuán)為低聚乙二醇基，(5)(1)-(4)的方法，其中上述疏水色譜法與離子交換樹脂色譜法和/或凝膠過濾色譜法聯(lián)合，(6)(5)的方法，其中離子交換色譜法和疏水色譜法聯(lián)合，(7)(5)或(6)的方法，其中離子交換樹脂用于第一次色譜法，疏水樹脂用于第二次色譜法，(8)(5)-(7)的方法，其中離子交換色譜法為陰離子交換色譜法，(9)(5)-(8)的方法，其中離子交換色譜法為弱陰離子交換色譜法，(10)(5)-(9)的方法，其中離子交換色譜法的官能團(tuán)為二乙基氨基丙基(DEAP)，(11)(5)-(10)的方法，其中離子交換色譜法的官能團(tuán)被低密度取代(Low Sub)，(12)(1)-(11)的方法，其中色譜法的緩沖液具有7-9的pH，
(13)(1)-(12)的方法，其中色譜法的緩沖液具有7.8-8.5的pH，(14)(5)-(13)的方法，其中離子交換色譜法的緩沖液含氯化鈉或氯化鉀，(15)(5)-(14)的方法，其中離子交換色譜法中的樣品吸收用緩沖液含0.01-150mM的氯化鈉，(16)(5)-(15)的方法，其中離子交換色譜法中的樣品吸收用緩沖液含30-70mM的氯化鈉，(17)(5)-(16)的方法，其中離子交換色譜法中的沖洗用緩沖液含150mM-250mM的氯化鈉，(18)(5)-(17)的方法，其中離子交換色譜法中的沖洗用緩沖液含190-230mM的氯化鈉，(19)(5)-(18)的方法，其中離子交換色譜法中的洗脫用緩沖液含100mM-1000mM的氯化鈉，(20)(5)-(19)的方法，其中離子交換色譜法中的洗脫用緩沖液含290-330mM的氯化鈉，(21)(1)-(20)的方法，其中疏水色譜法的緩沖液含硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉，(22)(1)-(21)的方法，其中疏水色譜法中的吸收用緩沖液含1.0M-2.5M的硫酸銨，(23)(1)-(22)的方法，其中疏水色譜法中的吸收用緩沖液含1.8-2.2M的硫酸銨，(24)(1)-(23)的方法，其中疏水色譜法中的沖洗用緩沖液含1.0-1.6M的硫酸銨，(25)(1)-(24)的方法，其中疏水色譜法中的沖洗用緩沖液含1.2-1.5M的硫酸銨，(26)(1)-(25)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.01-1.5M的硫酸銨，(27)(1)-(26)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.6-1.0M的硫酸銨，(28)(1)-(27)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含親水性有機(jī)溶劑，
(29)(28)的方法，其中親水性有機(jī)溶劑為多元醇或低級醇，(30)(28)或(29)的方法，其中多元醇為乙二醇，(31)(28)-(30)的方法，其中乙二醇的濃度為0.01-50％，(32)(28)-(31)的方法，其中乙二醇的濃度為2-10％，(33)(28)-(32)的方法，其中乙二醇的濃度為3-7％，(34)(1)-(33)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含表面活性劑，(35)(1)-(34)的方法，其中上述表面活性劑為Tween 80或Triton X，(36)(1)-(35)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.001-1％的Tween 80，(37)(1)-(36)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.01-0.1％的Tween 80，(38)(1)-(37)的方法，其中在疏水色譜法中，通過從吸收過程中的溫度降低溫度不小于5℃來引起樣品吸收后的洗脫，(39)(38)的方法，其中洗脫過程中的溫度在(室溫-5)℃-4℃的范圍內(nèi)，(40)(1)-(39)的方法，其中在疏水色譜法中，通過升高吸收用緩沖液的pH不小于0.5來引起樣品吸收后的洗脫，(41)(40)的方法，其中洗脫過程中的pH在6-10的范圍內(nèi)，(42)(1)-(41)的方法，其中在疏水色譜法后進(jìn)行凝膠過濾色譜法，(43)(1)-(42)的方法，其中凝膠過濾色譜法的載體為瓊脂糖，(44)(1)-(43)的方法，其包括加入二價(jià)金屬離子到用于凝膠過濾色譜法的緩沖液內(nèi)，(45)(44)的方法，其中二價(jià)金屬離子為鈣或鎂，(46)(44)或(45)的方法，其中二價(jià)金屬離子的濃度為0.1-10mM，(47)(44)-(46)的方法，其中二價(jià)金屬離子的濃度為1-2mM，(48)(1)-(47)的方法，其中病毒隸屬于選自線狀病毒科、布尼病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、正粘病毒科、反錄病毒科、嗜肝DNA病毒科、呼腸病毒科和δ病毒科中的科，
(49)(1)-(48)的方法，其中病毒選自埃博拉出血熱病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、單純皰疹病毒、EB病毒、天花病毒、牛痘病毒、風(fēng)疹病毒、SARS病毒(人冠狀病毒)、丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、俄羅斯春夏季腦炎病毒、豬瘟病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、日本血凝病毒(HVJ)、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、腮腺炎病毒、RS病毒、拉沙病毒、流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、1型人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、呼腸病毒和丁型肝炎病毒，(50)(1)-(49)的方法，其中病毒為HVJ，(51)(1)-(50)的方法，其中病毒包膜為減毒或滅活病毒包膜，(52)(1)-(51)的方法，其中病毒包膜為滅活病毒包膜。
另外，通過本發(fā)明純化的病毒包膜可廣泛用作導(dǎo)入低分子或高分子化合物到細(xì)胞或活生物內(nèi)的載體。例如，如WO2004/039406中公開，包括化療藥，并可使用包膜作為抗癌藥。此外，如WO2004/046353所示，任何核酸可被包裹，并且包膜可用于篩選目標(biāo)基因或蛋白質(zhì)。
附圖簡述

圖1顯示了柱1的陰離子交換色譜圖(實(shí)施例1)。
圖2顯示了柱2的疏水色譜圖(實(shí)施例1)。
圖3顯示了柱3的凝膠過濾色譜圖(實(shí)施例1)。
圖4顯示了純化的HVJ包膜的SDS聚丙烯酰胺電泳圖(實(shí)施例3)。
道1分子量標(biāo)記，道2來自細(xì)胞的HVJ(還原)，道3來自雞蛋的HVJ(還原)，道4細(xì)胞衍生的HVJ(未還原)，道5雞蛋衍生的HVJ(未還原)。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式當(dāng)用在本說明書中時(shí)，“基因?qū)搿笔侵敢詫?dǎo)入的基因可保持其功能的方式導(dǎo)入所需的天然、合成或重組基因或基因片段到活生物中或體外的靶細(xì)胞內(nèi)。在本發(fā)明中導(dǎo)入的基因或基因片段包括DNA、RNA或核酸，其為它們的合成類似物，具有特定的序列。此外，當(dāng)用在本說明書中時(shí)，基因轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)染用于表示相同的含義(概念)。
當(dāng)用在本說明書中時(shí)，“基因載體”、“轉(zhuǎn)基因載體”和“病毒包膜載體”是指在病毒包膜中具有被包裹的外源基因的載體。用于轉(zhuǎn)基因載體制備的病毒可為野生型病毒或重組病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，要使用的病毒隸屬于選自線狀病毒科、布尼病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、正粘病毒科、反錄病毒科、嗜肝DNA病毒科、呼腸病毒科和δ病毒科中的科。
優(yōu)選地，病毒選自埃博拉出血熱病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、單純皰疹病毒、EB病毒、天花病毒、牛痘病毒、風(fēng)疹病毒、SARS病毒(人冠狀病毒)、丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、俄羅斯春夏季腦炎病毒、豬瘟病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、日本血凝病毒(HVJ)、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、腮腺炎病毒、RS病毒、拉沙病毒、流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、1型人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、呼腸病毒和丁型肝炎病毒。
更優(yōu)選地，病毒為HVJ。
當(dāng)用在本說明書中時(shí)，“滅活的病毒”是指具有滅活的基因組的病毒。滅活的病毒是缺陷性的。優(yōu)選地，通過UV處理或用烷基化試劑的處理進(jìn)行滅活。
當(dāng)用在本說明書中時(shí)，“減毒的病毒”是指即使在感染宿主后也不會表現(xiàn)或很難表現(xiàn)致病性的病毒。
當(dāng)用在本說明書中時(shí)，“外源基因”是指包括在轉(zhuǎn)基因載體中的核酸序列，其來源于病毒之外的來源。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，外源基因可操作地連接到適合于表達(dá)由轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入的基因的調(diào)節(jié)基因(例如轉(zhuǎn)錄所需的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和多腺苷酸化(Poly A)附加信號以及翻譯所需的脂質(zhì)體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、終止密碼子等)上。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，外源基因不合用于表達(dá)外源基因的調(diào)節(jié)序列。在本發(fā)明的又一個(gè)方面中，外源基因?yàn)楣押塑账峄蛘T餌(decoy)核酸。盡管轉(zhuǎn)基因載體中含的外源基因用DNA或RNA的核酸分子表示，但要被導(dǎo)入的核酸分子可含核酸類似物分子。轉(zhuǎn)基因載體中包括的分子種類可為單基因分子種類或多于一個(gè)的不同基因分子種類。
在本說明書中，“HVJ”和“日本血凝病毒”用于指相同的含義(概念)。
在本說明書中，“HAU”指能聚集雞紅細(xì)胞0.5％的病毒活性，其中1 HAU相當(dāng)于差不多24百萬個(gè)病毒粒子(Okada，Y等，BikenJournal 4，209-213，1961)。
可單獨(dú)用疏水色譜法進(jìn)行本發(fā)明的純化方法。優(yōu)選地，使用疏水色譜法和離子交換色譜法和/或凝膠過濾色譜法。具體地，包括以下組合中的任何一種。
(1)疏水色譜法(2)疏水色譜法和離子交換色譜法的組合(沒有特定的順序)(3)疏水色譜法和凝膠過濾色譜法的組合(沒有特定的順序)(4)疏水色譜法、離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法的組合(沒有特定的順序)最優(yōu)選地，使用三步驟柱色譜法。由于第三步驟旨在脫鹽和濃縮，因此該步驟可根據(jù)需要應(yīng)用。用于色譜法的緩沖液的pH通常為7-9。pH優(yōu)選為7.8-8.5。
通常，陰離子交換色譜法可用于柱1。理論上，幾乎任何陰離子交換劑(DEAP、Q、QAE、DEAE等)都可使用(DEAP；二乙基氨基丙基，Q；季胺，QAE；季氨基乙基，DEAE；二乙基氨基乙基)。優(yōu)選的具體例子包括具有DEAP的ANX-瓊脂糖4FF(GE AmershamBiosciences K.K.，Cat.No.17-1286-01)。這種交換劑為專用于捕獲高分子的載體，因?yàn)樗哂休^大的孔尺寸，DEAP基團(tuán)的丙基變成間隔基，載體和官能團(tuán)之間的距離被伸長。通過實(shí)現(xiàn)ANX-瓊脂糖4FF LowSub的官能團(tuán)的低密度，具有對大分子而不是小分子的選擇性。這是因?yàn)閺?fù)合官能團(tuán)通常通過色譜法的相互作用結(jié)合到蛋白質(zhì)的一個(gè)分子上。由于通常的色譜法載體結(jié)合有大量過量的官能團(tuán)，因此產(chǎn)生極高的密度環(huán)境。由于載體具有纏繞串結(jié)構(gòu)，因此它能提供對可在空間上結(jié)合到更大數(shù)量點(diǎn)上的低分子有利的環(huán)境。換句話說，ANX-瓊脂糖4FF具有對于高分子得到改善的官能團(tuán)位空間。對于用于離子交換色譜法的緩沖液，可使用pH為6-9的緩沖液，例如，可提到Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液等。
對于柱2，通常可使用疏水色譜法。用于疏水色譜法的優(yōu)選載體的例子包括具有弱疏水性的市售疏水載體，例如，可使用具有醚基、烷基等的疏水載體。尤其是具有醚基的載體是優(yōu)選的。優(yōu)選載體的具體例子包括TOSOH CORPORATION制造的醚-TOYOPEARL650M(Cat.No.16173)，其具有低聚乙二醇基作為它的官能團(tuán)。低聚乙二醇基被認(rèn)為表現(xiàn)出弱疏水性，因?yàn)樗谔兼溨芯哂蠴H基側(cè)鏈。通常用于疏水色譜法的載體的丁基和苯基表現(xiàn)出對蛋白質(zhì)太強(qiáng)的結(jié)合力，具有高的疏水性。因此，它們防止了蛋白質(zhì)的充分分離，并降低了回收率。開發(fā)這種載體以防止回收率的這種降低。另外，假定TOYOPEARL的疏水性低于其他公司產(chǎn)品的疏水性，因?yàn)楣倌軋F(tuán)是通過沒有間隔基的方法結(jié)合。這從苯基-瓊脂糖(有間隔基)和苯基-TOYOPEARL的比較數(shù)據(jù)可預(yù)知。通常，通過具有丁基、苯基等的疏水色譜法純化病毒是困難的。但是，當(dāng)官能團(tuán)具有比通常產(chǎn)品(市售產(chǎn)品)的密度低的密度時(shí)，可純化甚至更小的病毒。對于用于疏水色譜法的緩沖液，可使用pH為6-9的那種，例如，可提到Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、Bis-Tris/HCl、Bis-Tris丙烷/HCl、三乙醇胺/HCl、三乙醇胺/乙酸、N-甲基二乙醇胺/HCl、N-甲基二乙醇胺/乙酸、二乙醇胺/HCl、1，3-二氨基丙烷/HCl、哌嗪/HCl、三甲胺/HCl、乙醇胺/HCl、n-甲基嗎啉/HCl等?？赏ㄟ^降低緩沖液中硫酸銨的濃度來洗脫結(jié)合到低聚乙二醇基上的HVJ。但是，只利用這種洗脫，峰是不尖銳的，需要相當(dāng)大的液體量以完成洗脫。因此，為了提高溶液的極性，加入親水性有機(jī)溶劑是有效的?？杉尤胗H水性有機(jī)溶劑在0.01-50％的范圍內(nèi)。盡管對濃度沒有限制，但通常為2％-10％，優(yōu)選3-7％，最優(yōu)選5％。對于親水性有機(jī)溶劑，優(yōu)選使用多元醇或低級醇。對本發(fā)明中的低級醇沒有限制，只要它為加有一個(gè)羥基的C1-6低級烴即可。具體地說，例如，可提到甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇等。另外，對多元醇沒有限制，只要它為加有不少于2個(gè)羥基的C2-6烴即可。具體地說，例如，可提到乙二醇、丙二醇、1，3-丙二醇、甘油等。更優(yōu)選使用多元醇。最優(yōu)選使用乙二醇?？杉尤胍叶荚?.01-50％的范圍內(nèi)。盡管對濃度沒有限制，但通常為2％-10％，優(yōu)選3-7％，最優(yōu)選5％。乙二醇的加入使峰變尖，洗脫體積變?yōu)橹w積的約一半，并且可同時(shí)進(jìn)行純化和濃縮。此外，在該步驟中，由于在高的硫酸銨濃度下純化，因此HVJ可彼此結(jié)合。為了防止這種結(jié)合，向洗脫緩沖液中加入表面活性劑是有效的。可加入表面活性劑在0.001-1％的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.01-0.1％。對于表面活性劑，可使用Tween和Triton X。更優(yōu)選使用Tween 80。可加入Tween 80在0.001-1％的范圍內(nèi)。優(yōu)選加入0.01-0.1％的Tween 80。最優(yōu)選加入0.05％的Tween 80。
此外，凝膠過濾色譜法可通常用于柱3。由于進(jìn)行該步驟是為了濃縮和脫鹽，因此可使用廣泛應(yīng)用的凝膠過濾色譜法。例如，可使用GEAmersham Biosciences K.K.的瓊脂糖4FF(Cat.No.17-0149-01)和瓊脂糖6FF(Cat.No.17-0159-01)。對于用于凝膠過濾的緩沖液，可使用pH為6-9的緩沖液，例如，可提到Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、Bis-Tris/HCl、Bis-Tris丙烷/HCl、三乙醇胺/HCl、三乙醇胺/乙酸、N-甲基二乙醇胺/HCl、N-甲基二乙醇胺/乙酸、二乙醇胺/HCl、1，3-二氨基丙烷/HCl、哌嗪/HCl、三甲胺/HCl、乙醇胺/HCl、n-甲基嗎啉/HCl等。該緩沖液可含親水性有機(jī)溶劑，作為可加入的親水性有機(jī)溶劑，可使用類似于上述的那些。
此外，向用于凝膠過濾色譜法的緩沖液中和/或最終純化的制劑中加入二價(jià)金屬離子作為神經(jīng)氨酸苷酶的穩(wěn)定劑是有效的。二價(jià)金屬離子優(yōu)選為鈣或鎂。通常，加入這些金屬離子在0.1-10mM的范圍內(nèi)。優(yōu)選加入它們至1-2mM的濃度。
實(shí)施例通過參考實(shí)施例在下文中詳細(xì)說明本發(fā)明，實(shí)施例不被視為限制性的。
實(shí)施例1.通過柱色變譜法純化HVJ對在漂浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的HVJ進(jìn)行離心以進(jìn)行細(xì)胞除去處理。通過3-階段色譜法純化得到的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
首先，為了滅活內(nèi)毒素，在使用前使0.25M氫氧化鈉溶液通過每個(gè)柱，并在擱置不少于8小時(shí)后使用柱。
(1)離子交換樹脂色譜法用50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)將離心的培養(yǎng)物上清液稀釋2倍。使其通過用含50mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)平衡的柱1以允許吸收。對于柱1，使用ANX-瓊脂糖4FF Low Sub(GEAmersham Biosciences K.K.制造，Cat.No.17-1286-01)，其為陰離子交換色譜法的載體，裝填到BPG200/500空柱(GE AmershamBiosciences K.K.制造)中至直徑20cm、高度9cm(3L)。線性流速為96cm/h。此外，使3倍柱體積的平衡緩沖液通過，然后通過使8倍柱體積的含210mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)通過來沖洗柱。為了從柱1洗脫HVJ，使含310mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)通過。此時(shí)，由于柱通過溶液在UV 280nm處的吸收增加，因此回收了相應(yīng)部分。其被用作柱1洗脫餾分。最后，使含2M氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液通過來再生柱1(見圖1)。
(2)疏水樹脂色譜法然后，向柱1洗脫餾分中加入等體積的4M硫酸銨溶液，得到含2M硫酸銨的溶液。使混合物通過用含2M硫酸銨的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)平衡的柱2以允許吸收。對于柱2，使用醚-TOYOPEARL 650M(TOSOH制造，Cat.No.16173)，其為疏水相互作用色譜法的載體，裝填在BPG100/500空柱(GE AmershamBiosciences K.K.制造)中至直徑10cm、高度12.5cm(1L)。線性流速為190cm/h。此外，使3倍柱體積的平衡緩沖液通過，然后通過使5倍柱體積的含1.4M硫酸銨的50mM Tris-HCl緩沖液通過來沖洗柱。為了從柱2洗脫HVJ，使含0.8M硫酸銨、5％乙二醇和0.05％Tween 80的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)通過。此時(shí)，由于柱通過溶液在UV 280nm處的吸收增加，因此回收了相應(yīng)部分。其被用作柱2洗脫餾分。最后，使5％乙二醇溶液通過來再生柱2(見圖2)。
(3)凝膠過濾色譜法此外，使柱2洗脫餾分通過用含150mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)平衡的柱3。對于柱3，使用瓊脂糖4FF(GE AmershamBiosciences K.K.制造，Cat.No.17-0149-01)，其為凝膠過濾色譜法的載體，裝填到XK50/60空柱(GE Amersham Bioseiences K.K.制造)中至直徑5cm、高度40cm(0.8L)。線性流速為120cm/h。在柱洗脫餾分后，使平衡緩沖液通過。此時(shí)，由于柱通過溶液在UV 280nm處的吸收增加，因此回收了相應(yīng)部分。其被用作柱3洗脫餾分。(見圖3)。
向柱3洗脫餾分中加入數(shù)量相當(dāng)于1/4體積的0.5％甲基纖維素，得到含最終濃度為0.1％甲基纖維素的HVJ溶液。使其通過0.45微米的殺菌過濾器。用液氮快速冷凍混合物，并在80℃下保存。因此，可穩(wěn)定地保存高純HVJ很長時(shí)間。
在用于緩沖液等的主要試劑中，使用的三(羥基甲基)氨基甲烷、氯化鈉、氯化鈣2-水合物、氯化鎂6-水合物、氫氧化鈉、乙二醇、硫酸銨和Tween 80為Wako Pure Chemical Industries，Ltd.或Sigma Ltd.制造的特級產(chǎn)品。使用的鹽酸為Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造的6N標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。作為純化制劑的穩(wěn)定劑加入的0.5％甲基纖維素為Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn)的那種。為了通過過濾純化制劑來殺菌，使用孔直徑為0.45微米的親水性過濾器MillipakGamma Gold(Nihon Millipore K.K.)。
對比實(shí)施例1.通過膜濃縮和柱色譜法純化HVJ對在漂浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的HVJ進(jìn)行離心以進(jìn)行細(xì)胞除去處理。通過超濾膜濃縮和3-階段色譜法純化得到的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
首先，為了滅活內(nèi)毒素，在使用前使0.25M氫氧化鈉溶液通過膜濃縮裝置和每個(gè)柱，并在擱置不少于8小時(shí)后使用它們(通常，擱置約一周，完全根除活細(xì)胞和內(nèi)毒素)。
(1)過濾和膜濃縮使離心的培養(yǎng)物上清液通過1.2μm毫格(milli-grid)過濾器以除去顆粒。使用Pellicon膜濃縮裝置將上清液濃縮至600mL。
(2)凝膠過濾色譜法(柱1)使在(1)中得到的濃縮培養(yǎng)物上清液通過用含150mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)平衡的柱1。對于柱1，使用瓊脂糖6FF(GE Amersham Biosciences K.K.制造)，其為凝膠過濾色譜法的載體，裝填到BPG100/500空柱(GE Amersham Biosciences K.K.制造)中至直徑10cm、高度33cm(2.5L)。線性流速為150cm/h。然后使平衡緩沖液通過。此時(shí)，由于柱通過溶液在UV 280nm處的吸收增加，因此回收了相應(yīng)部分。其被用作柱1洗脫餾分。
(3)離子交換樹脂色譜法(柱2)然后，使柱1洗脫餾分通過用含150mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)平衡的柱2以允許吸收。對于柱2，使用Q-瓊脂糖FF(GE Amersham Biosciences K.K.制造)，其為離子交換色譜法的載體，裝填到BPG200/500空柱(GE Amersham Biosciences K.K.制造)中至直徑20cm、高度6.5cm(2L)。線性流速為70cm/h。此外，使5倍柱體積的平衡緩沖液通過。為了從柱2洗脫HVJ，使含0.45M氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)通過。此時(shí)，由于柱通過溶液在UV 280nm處的吸收增加，因此回收了相應(yīng)部分。其被用作柱2洗脫餾分。最后，使2M氯化鈉通過來再生柱2。
(4)凝膠過濾色譜法(柱3)使柱2洗脫餾分通過用含150mM氯化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)平衡的柱3。對于柱3，使用瓊脂糖6FF(GE AmershamBiosciences K.K.制造)，其為凝膠過濾色譜法的載體，裝填到BPG100/500空柱(GE Amersham Biosciences K.K.制造)中至直徑10cm、高度33cm(2.5L)。線性流速為150cm/h。在柱洗脫餾分后，使平衡緩沖液通過。此時(shí)，由于柱通過溶液在UV 280nm處的吸收增加，因此回收了相應(yīng)部分。其被用作柱3洗脫餾分。
向柱3洗脫餾分中加入數(shù)量相當(dāng)于1/4體積的0.5％甲基纖維素，得到含最終濃度為0.1％甲基纖維素的HVJ溶液。使其通過0.45微米的殺菌過濾器。
在用于緩沖液等的主要試劑中，使用的三(羥基甲基)氨基甲烷、氯化鈉、氯化鈣2-水合物、氯化鎂6-水合物和氫氧化鈉為Wako PureChemical Industries，Ltd.或Sigma Ltd.制造的特級產(chǎn)品。使用的鹽酸為Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造的6N標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品。作為純化制劑的穩(wěn)定劑加入的0.5％甲基纖維素為Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生產(chǎn)的那種。為了通過過濾純化制劑來殺菌，使用孔直徑為0.45微米的親水性過濾器Miilipak Gamma Gold(NihonMillipore K.K.)。
實(shí)施例2.純化的HVJ的活性測量和回收率基于唾液酸降解酶(神經(jīng)氨酸苷酶，NA)活性和雞紅細(xì)胞凝集活性(血凝素活性，HA)測量HVJ的活性。兩者都與回收的病毒的濃度和數(shù)量成比例關(guān)系，并且是定量的。用這兩種方法測定的本發(fā)明實(shí)施例1中HVJ的殘留活性和基于NA活性值的回收率顯示在表1中。使用對比實(shí)施例的回收率顯示在表2中。從表1和2的比較可看出，本發(fā)明的較好效果是明顯的。
(表1)(本發(fā)明，實(shí)施例1)

(表2)(常規(guī)純化方法，對比實(shí)施例1)

實(shí)施例3.通過SDS-PAGE分析純化的HVJ的純度在4-12％SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行HVJ電泳分離。用增溶劑(SigmaLtd.CelLytic-M Cat.No.C2978)溶解HVJ，該增溶劑用于適合病毒的膜蛋白并直接被電泳分離。使用其作為非還原處理樣品。使用在溶解后加有2-巰基乙醇并在95℃下熱處理10分鐘的HVJ作為還原處理樣品。為了與通常的方法比較，通過在消毒雞蛋中培養(yǎng)和用陰離子交換色譜法純化絨膜尿囊液得到的HVJ按相同的方式被處理。在100V的恒定電壓下對樣品進(jìn)行電泳2.5小時(shí)，用SYPRO Ruby熒光菌株(Bio-Rad，Richmond，CA，SYPRO Ruby Protein Gel Stain Cat.No.170-3125)染色，并通過熒光成像系統(tǒng)分析凝膠。電泳結(jié)果顯示在圖4中。與基于從雞蛋純化的常規(guī)方法相比，可得到具有相同純度的HVJ包膜。
工業(yè)實(shí)用性可提供以高回收率純化病毒包膜同時(shí)保持其細(xì)胞融合活性的方法。純化的病毒包膜可用作導(dǎo)入生物聚合物如基因等到細(xì)胞或活生物內(nèi)的載體。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以以比常規(guī)方法高的回收率純化滅活的病毒包膜(例如HVJ)，同時(shí)保持它的融合活性。因此，能用于病毒包膜的工業(yè)生產(chǎn)。另外，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于未滅活包膜病毒的純化。
本申請基于在日本提交的專利申請No.2004-219381(提交日期2004年7月27日)，本文引入其全部內(nèi)容作為參考。
權(quán)利要求
1.一種純化病毒包膜的方法，包括使用疏水色譜法。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述疏水色譜法的官能團(tuán)為弱疏水基。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述疏水色譜法的官能團(tuán)為低聚乙二醇基或苯基。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水色譜法的官能團(tuán)為低聚乙二醇基。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水色譜法與離子交換樹脂色譜法和/或凝膠過濾色譜法聯(lián)合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中離子交換色譜法和疏水色譜法聯(lián)合。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中離子交換樹脂用于第一次色譜法，疏水樹脂用于第二次色譜法。
8.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法為陰離子交換色譜法。
9.權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法為弱陰離子交換色譜法。
10.權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法的官能團(tuán)為二乙基氨基丙基(DEAP)。
11.權(quán)利要求5-10任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法的官能團(tuán)被低密度取代(Low Sub)。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中色譜法的緩沖液具有7-9的pH。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中色譜法的緩沖液具有7.8-8.5的pH。
14.權(quán)利要求5-13任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法的緩沖液含氯化鈉或氯化鉀。
15.權(quán)利要求5-14任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法中的樣品吸收用緩沖液含0.01-150mM的氯化鈉。
16.權(quán)利要求5-15任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法中的樣品吸收用緩沖液含30-70mM的氯化鈉。
17.權(quán)利要求5-16任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法中的沖洗用緩沖液含150mM-250mM的氯化鈉。
18.權(quán)利要求5-17任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法中的沖洗用緩沖液含190-230mM的氯化鈉。
19.權(quán)利要求5-18任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法中的洗脫用緩沖液含100mM-1000mM的氯化鈉。
20.權(quán)利要求5-19任一項(xiàng)的方法，其中離子交換色譜法中的洗脫用緩沖液含290-330mM的氯化鈉。
21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法的緩沖液含硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的吸收用緩沖液含1.0M-2.5M的硫酸銨。
23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的吸收用緩沖液含1.8-2.2M的硫酸銨。
24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的沖洗用緩沖液含1.0-1.6M的硫酸銨。
25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的沖洗用緩沖液含1.2-1.5M的硫酸銨。
26.權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.01-1.5M的硫酸銨。
27.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.6-1.0M的硫酸銨。
28.權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含親水性有機(jī)溶劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中親水性有機(jī)溶劑為多元醇或低級醇。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中多元醇為乙二醇。
31.權(quán)利要求28-30任一項(xiàng)的方法，其中乙二醇的濃度為0.01-50％。
32.權(quán)利要求28-31任一項(xiàng)的方法，其中乙二醇的濃度為2-10％。
33.權(quán)利要求28-32任一項(xiàng)的方法，其中乙二醇的濃度為3-7％。
34.權(quán)利要求1-33任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含表面活性劑。
35.權(quán)利要求1-34任一項(xiàng)的方法，其中上述表面活性劑為Tween 80或Triton X。
36.權(quán)利要求1-35任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.001-1％的Tween 80.
37.權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的方法，其中疏水色譜法中的洗脫用緩沖液含0.01-0.1％的Tween 80。
38.權(quán)利要求1-37任一項(xiàng)的方法，其中在疏水色譜法中，通過從吸收過程中的溫度降低溫度不小于5℃來引起樣品吸收后的洗脫。
39.權(quán)利要求38的方法，其中洗脫過程中的溫度在(室溫-5)℃-4℃的范圍內(nèi)。
40.權(quán)利要求1-39任一項(xiàng)的方法，其中在疏水色譜法中，通過升高吸收用緩沖液的pH不小于0.5來引起樣品吸收后的洗脫。
41.權(quán)利要求40的方法，其中洗脫過程中的pH在6-10的范圍內(nèi)。
42.權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的方法，其中在疏水色譜法后進(jìn)行凝膠過濾色譜法。
43.權(quán)利要求1-42任一項(xiàng)的方法，其中凝膠過濾色譜法的載體為瓊脂糖。
44.權(quán)利要求1-43任一項(xiàng)的方法，其包括加入二價(jià)金屬離子到用于凝膠過濾色譜法的緩沖液內(nèi)。
45.權(quán)利要求44的方法，其中二價(jià)金屬離子為鈣或鎂。
46.權(quán)利要求44或45的方法，其中二價(jià)金屬離子的濃度為0.1-10mM。
47.權(quán)利要求44-46任一項(xiàng)的方法，其中二價(jià)金屬離子的濃度為1-2mM。
48.權(quán)利要求1-47任一項(xiàng)的方法，其中病毒隸屬于選自線狀病毒科、布尼病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、沙粒病毒科、正粘病毒科、反錄病毒科、嗜肝DNA病毒科、呼腸病毒科和δ病毒科中的科。
49.權(quán)利要求1-48任一項(xiàng)的方法，其中病毒選自埃博拉出血熱病毒、克里米亞-剛果出 血熱病毒、漢坦病毒、單純皰疹病毒、EB病毒、天花病毒、牛痘病毒、風(fēng)疹病毒、SARS病毒(人冠狀病毒)、丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、俄羅斯春夏季腦炎病毒、豬瘟病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、日本血凝病毒(HVJ)、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、腮腺炎病毒、RS病毒、拉沙病毒、流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、1型人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、呼腸病毒和丁型肝炎病毒。
50.權(quán)利要求1-49任一項(xiàng)的方法，其中病毒為HVJ。
51.權(quán)利要求1-50任一項(xiàng)的方法，其中病毒包膜為減毒或滅活病毒包膜。
52.權(quán)利要求1-51任一項(xiàng)的方法，其中病毒包膜為滅活病毒包膜。
全文摘要
提供病毒(例如日本血凝病毒，HVJ)包膜的工業(yè)純化方法。具體地說，提供通過離子交換色譜法和疏水色譜法以高回收率純化滅活病毒包膜同時(shí)保持病毒細(xì)胞融合活性的方法。純化的病毒包膜可用作導(dǎo)入生物聚合物如基因等到細(xì)胞和活生物內(nèi)的載體。另外，這種方法可用于純化減毒的包膜病毒。
文檔編號C12N7/02GK101018804SQ200580025540
公開日2007年8月15日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月27日
發(fā)明者井岡進(jìn)一 申請人:基諾美生物工程(制藥)公司