專利名稱：一種用于篩選人類免疫缺陷性病毒抑制劑的轉(zhuǎn)化子的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及用于篩選人類免疫缺陷性病毒(HIV)抑制劑的轉(zhuǎn)化子，具體涉及一種被表達HIV核殼蛋白的質(zhì)粒和含HIVψ核苷酸序列和β-半乳糖苷酶報道基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子；本發(fā)明還涉及一種采用所述轉(zhuǎn)化子篩選HIV抑制劑的方法。
至今，人們已經(jīng)開發(fā)了抑制HIV復制的一些藥物，包括反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑如3’-疊氮-3’-脫氧胸腺嘧啶(AZT)、雙脫氧肌苷(DDI)以及蛋白酶抑制劑等。最近，采用編碼HIV蛋白的核酸序列開發(fā)DNA疫苗(參見Hinkula J.et al.，Vaccine，15874-878，1997；Calarota et al.，Lancet，3511320-1325，1998)，以及通過去除HIV nef基因來制備活的減毒HIV疫苗(參見Kestler and Jeang，Science，2701219-1222，1995；Chakrabartiet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，939810-9815，1996)等研究都正在進行中。
由于HIV DNA插入到宿主免疫細胞的染色體中，所述藥物不能去除HIV的原病毒，或不能有選擇性地去除含有原病毒的宿主免疫細胞，因此這就不能排除由于基因突變引起的HIV變體獲得抗藥性或由于減毒的病毒疫苗的重組而導致的HIV回復突變株又重新獲得致病的HIV特性(參見Berkhout et al.，J.Virol.，731138-1145，1999)。更進一步研究發(fā)現(xiàn)HIV不僅需要CD4+分子作為其宿主細胞表面受體，而且其結(jié)合和獲得進入宿主細胞還需要共同受體如T細胞系向性的CXCR4/融合共同受體或巨噬細胞向性的CCR5共同受體等(參見Fenget al.，Science，272872-877，1966)。因此，一種藥物治療方法就是將這些共同受體作為藥物的靶以試圖抑制病毒結(jié)合到宿主細胞上。由于這些共同受體的正常功能是同在炎癥反應時發(fā)揮作用的趨化因子(或趨化細胞因子)結(jié)合，因此預計可能會產(chǎn)生嚴重的副作用(參見Murphy，D.M.Ann.Rev.Immol.，12593-633，1994)。鑒于上述情況，有必要開發(fā)出一種新型HIV抑制劑。這種抑制劑不影響與受體有關的宿主的免疫作用或生理活性。一種此類藥物治療方法就是將病毒裝配所需的特異因子作為目標。
當HIV病毒顆粒組裝時，其基因組RNA有選擇性地被裝進病毒粒子中。眾所周知，核殼蛋白(NC)區(qū)域與病毒包裝序列(包殼信號)ψ的特異性相互作用可選擇性地允許病毒基因組RNA的包裝。序列Psi(ψ)位于基因組RNA 5′端的長末端重復序列(LTR)和編碼前體多聚蛋白(基質(zhì)-衣殼-核殼)的gag基因之間，有4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)。然而由于缺少一個簡易有效的分析系統(tǒng)，能抑制包裝所必要的特異性病毒相互作用的化合物或組合物篩選是很困難的。
在這種狀況下，有很多理由需要開發(fā)一種模型系統(tǒng)，可以象在體內(nèi)一樣檢測HIV核殼蛋白和HIVψ序列之間的特異性相互作用，以便于篩選出能防礙HIV包裝的抑制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明人致力于開發(fā)出一種簡易有效的在體內(nèi)通過檢測HIV核殼蛋白和HIVψ序列間的特異性相互作用來篩選HIV包裝抑制劑的方法，并為此制備出了被表達HIV核殼蛋白的質(zhì)粒和含有HIVψ序列和β-半乳糖苷酶報道基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用所述轉(zhuǎn)化子并監(jiān)測其在β-半乳糖苷酶表達水平上的變化能夠方便地篩選出來HIV抑制劑。
本發(fā)明的主要目的是提供一種轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子被一種表達HIV核殼蛋白的質(zhì)粒和一種含有HIVψ序列和β-半乳糖苷酶報道基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的另一目的是提供一種采用所述轉(zhuǎn)化子篩選HIV包裝抑制劑的方法。


圖1a是質(zhì)粒pX1(-ATG)構(gòu)建方案示意圖。
圖1b是質(zhì)粒pNH1構(gòu)建方案示意圖。
圖1c是質(zhì)粒pNH1Psi或pNH1rePsi構(gòu)建方案示意圖。
圖2中的曲線顯示在共轉(zhuǎn)化子大腸桿菌JM109中的β-半乳糖苷酶表達水平，質(zhì)粒pNH1分別與表達核殼蛋白的質(zhì)粒pJC1或表達Gag蛋白的質(zhì)粒pTrcHisGag或作為對照的質(zhì)粒pSE380共轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
圖3a中的曲線顯示HIV核殼蛋白或Gag蛋白與HIVψ序列的相互作用對β-半乳糖苷酶表達的影響。大腸桿菌JM109被質(zhì)粒pNH1MCS分別與pJC1、pTrcHisGag或pSE380共轉(zhuǎn)化并經(jīng)IPTG誘導后表達β-半乳糖苷酶。
圖3b中的曲線顯示HIV核殼蛋白或Gag蛋白與HIVψ序列的相互作用對β-半乳糖苷酶表達的影響。大腸桿菌JM109被質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)分別與pJC1、pTrcHisGag或pSE380共轉(zhuǎn)化并經(jīng)IPTG誘導后表達β-半乳糖苷酶。
圖4中的曲線顯示HIV核殼蛋白或Gag蛋白與HIVψ序列的各個部份相互作用對大腸桿菌JM109中β-半乳糖苷酶表達的影響。將每一種含ψ核苷酸序列的質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)、pNH1Psi(SL234)、pNH1Psi(SL34)、pNH1Psi(SL23)或pNH1Psi(SL12)分別與質(zhì)粒pJC1、pTrcHisGag或pSE380共轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
發(fā)明詳述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子用于篩選HIV包裝抑制劑，所述轉(zhuǎn)化子由兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化制備，一種質(zhì)粒pJC1表達HIV核殼蛋白，另一種質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)含有HIVψ基因和β-半乳糖苷酶報道基因。
用于篩選HIV抑制劑的轉(zhuǎn)化子的制備過程將做更詳細的闡述。
通過表達HIV核殼蛋白的質(zhì)粒pJC1和含有HIVψ基因和β-半乳糖苷酶報道基因的質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)共轉(zhuǎn)化來制備轉(zhuǎn)化子在質(zhì)粒pSE280中插入LacZ基因片段構(gòu)建質(zhì)粒pX1，從pX1中去除ATG就構(gòu)建成質(zhì)粒pX1(-ATG)。然后，用含有卡那霉素抗性基因的AflIII-StuI片段替代質(zhì)粒pX1(-ATG)中的氨芐青霉素抗性基因就獲得質(zhì)粒pZ1。將含有rrnB T1T2終止子的來自pX1(-ATG)的HindIII-BspHI片段插入到質(zhì)粒pZ1里就構(gòu)建成含LacZ基因的質(zhì)粒pNH1。將來自質(zhì)粒pLLIII含ψ片段的4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)插入到上述已構(gòu)建的質(zhì)粒pNH1中就構(gòu)建成質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)，該質(zhì)粒含有的LacZ基因位于HIVψ核苷酸序列側(cè)翼，就在起始密碼子的前面(參見
圖1)。然后將由本發(fā)明人構(gòu)建的表達核殼蛋白的質(zhì)粒載體pJC1(參照Ji Chang You andCharles S.Mchenry，J.Biol.Chem.，26816519-16527，1993)和上述構(gòu)建的質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)共轉(zhuǎn)化進大腸桿菌。即載體pJC1和載體pNH1Psi(SL1234)通過電穿孔共轉(zhuǎn)化進大腸桿菌，然后在含抗生素的培養(yǎng)基中選擇抗生素抗性的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子命名為E.coli/pNH1Psi(SL1234)，保存在國際保藏單位韓國微生物保藏中心(KCCM，#361-221Hongie-1-dong，Seodaemun-gu，Seoul，Republic of Korea)，保藏登記號KCCM-10194，保藏日為2000年3月31日。上述轉(zhuǎn)化子具有一個特性由于ψ核苷酸序列與HIV核殼蛋白的相互作用，β-半乳糖苷酶報道基因表達為負調(diào)控，因此被轉(zhuǎn)化子能被用于篩選HIV包裝的抑制劑。例如，所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物用推定的HIV抑制劑的化合物或組份處理，然后測定培養(yǎng)液中β-半乳糖苷酶表達的變化水平。因而本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子能用于篩選HIV包裝的抑制劑，這些抑制劑能阻斷HIV核殼蛋白和HIVψ核苷酸序列的結(jié)合。
本發(fā)明用下列實施例進一步說明，這些實施例不應認為是對本發(fā)明范圍的限制。實施例1質(zhì)粒pNH1(SL1234)的構(gòu)建含β-半乳糖苷酶報道基因(SEQ ID NO1)的質(zhì)粒構(gòu)建。實施例1-1質(zhì)粒pNH1的構(gòu)建以內(nèi)切酶Pst I(德國Boeringer Mannheim)消化質(zhì)粒pUS935(參見Dellagostin，O.A.et al.，Microbiology，1411785-1792，1995)所得到的LacZ基因片段插入到質(zhì)粒pSE280(美國Invitrogen)中獲得質(zhì)粒pX1。為防止從位于LacZ片段多克隆位點上游的ATG起始翻譯，用NcoI、綠豆外切核酸酶(德國Boehringer Mannheim)和Klenow酶處理，去除上游ATG產(chǎn)生平末端，然后連接成pX1(-ATG)。
圖1a是pX1(-ATG)構(gòu)建方案的示意圖。用卡那霉素抗性基因替代質(zhì)粒pX1(-ATG)中的氨芐青霉素抗性基因，即連接來自pX1(-ATG)含LacZ基因的MscI片段和來自質(zhì)粒pZerO-2(美國Invitrogen)含Kanr基因的AflIII-StuI片段，制成質(zhì)粒pZ1。然后，將來自pX1(-ATG)含rrn T1T2終止子的HindIII-BspHI片段插入到質(zhì)粒pZ1的ScaI位點中制成新質(zhì)粒pNH1。
圖1b是質(zhì)粒pNH1構(gòu)建方案的示意圖。實施例1-2質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)的構(gòu)建質(zhì)粒pLLIII(University of Colorado，Health Sciences Center，CharlesS.McHenry)含有HIV-1的5′端長末端重復序列(LTR)，用內(nèi)切酶SacI和MseI消化，然后再用Klenow酶處理得到一個含有HIVψ核苷酸序列(命名為“SL1234”，SEQ ID NO2)的片段，“SL1234”有4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
SL1234先用內(nèi)切酶MaeI消化，再用Klenow片段處理獲得SL12(SEQ ID NO3)。將SL1234或兩個SL12片段插入到位于質(zhì)粒pNH1中LacZ基因上游的BstEII位點分別構(gòu)建成質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)和質(zhì)粒pNH1Psi(SL12)。含反方向HIVψ核苷酸序列的質(zhì)粒pNH1rePsi(SL1234)和質(zhì)粒pNH1rePsi(SL12)用作對照載體。正向221個堿基對的DNA帶和反向152個堿基對的DNA帶用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
引物，U2和L3對或U2和L4對分別用于SL23(SEQ ID NO4)或SL234(SEQ ID NO5)的擴增，它們的核苷酸序列如下引物U2(SEQ ID NO6)5′-GGGGGTGACCTTTAAAAGCAAGAGGCGAGGG-3′引物L3(SEQ ID NO7)5′-GGGGGTGACCCTCTCCTTCTAGCCTCCG-3′引物L4(SEQ ID NO8)5′-GGGGGTGACCGACGCTCTCGCACCCGTCTCT-3′為便于將ψ片段容易地插入到質(zhì)粒pNH1中BstEII位點，BstEII位點(黑體)被插入到每一個引物中，DraI位點(黑體)插入到引物U2中以鑒定方向。點突變(底劃線)T變成G被引入到引物L4中以防止從ψ序列起始翻譯。PCR在100μl反應混合物中進行10mM Tris-HCl，pH7.5，1.5mM MgCl2，50mM KCl，1mM dNTP，10μM每種引物，1μg質(zhì)粒pLLIII和2.5單位的Taq聚合酶(德國Boehringer Mannheim)。先94℃預保溫5分鐘，然后30次循環(huán)如下94℃變性1分鐘，引物60℃退火2分鐘，72℃延伸2分鐘。循環(huán)結(jié)束后增加72℃延伸10分鐘。對SL23插入，在每個質(zhì)粒用內(nèi)切酶DraI消化后，正向213個堿基對DNA帶和反向146個堿基對DNA帶用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對SL234插入，在每個質(zhì)粒用內(nèi)切酶DraI消化后，正向234個堿基對DNA帶和反向146個堿基對DNA帶用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
SL34片段由PCR產(chǎn)物SL234用內(nèi)切酶RsaI和BstEII消化后得到，經(jīng)Klenow片段處理后插入到質(zhì)粒pNH1的BstEII位點構(gòu)建成質(zhì)粒pNH1Psi(SL34)和對照質(zhì)粒pNH1rePsi(SL34)。每個質(zhì)粒用內(nèi)切酶BsmAI和XmnI雙消化后，正向40個堿基對DNA帶和反向56個堿基對DNA帶用4％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
為了使用一個陰性對照檢查核殼蛋白或Gag蛋白是否和與ψ非同源的核苷酸序列相互作用，通過將75個堿基對無ATG起始密碼子的多克隆位點(MCS)片段插入到質(zhì)粒pNH1內(nèi)的BstEII位點又構(gòu)建了質(zhì)粒pNH1MCS。先用內(nèi)切酶MaeI消化質(zhì)粒pSE280，再用Klenow片段處理，得到所述多克隆位點片段。RsaI消化后，229個堿基對的DNA帶通過2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
圖1c是質(zhì)粒pNH1Psi和pNH1rePsi構(gòu)建方案示意圖。實施例2HIV核殼蛋白或HIV Gag蛋白的表達由本發(fā)明人構(gòu)建和公開披露(參見Ji Chang You，and Charles S.McHenry，J.Biol.Chem.，268(22)16519-16527，1993)的核殼蛋白表達質(zhì)粒pJC1或表達Gag蛋白質(zhì)粒pTrcHisGag通過電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109(Luria-Bertani，美國Promega)為獲得感受態(tài)細胞，挑JM109單菌落過夜培養(yǎng)，按1％接種量(1∶100稀釋)轉(zhuǎn)移到200ml新鮮的LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani，美國Difco)中，培養(yǎng)至OD 0.5-0.7，4000g離心10分鐘收集細胞，將細胞沉淀重懸浮于冷的10％(體積比)甘油中，4000g離心10分鐘，重復四次洗滌，最終將細胞沉淀重懸浮于1ml冷10％甘油中。取20μl的感受態(tài)細胞與1-100ng的DNA混合，轉(zhuǎn)移到0.2cm光徑的電穿孔杯中，在大腸桿菌脈沖發(fā)生器(美國加州Bio-Lab，Heracules)使用2.5kV電休克轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子在含有100μg氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按1％接種量在新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。當進入對數(shù)生長期初期時，加入1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(德國Roche Diagnostics)誘導3小時。轉(zhuǎn)化子的液體培養(yǎng)液每小時取樣一次，10000g離心1分鐘。將細胞沉淀物重懸浮于20μl的裝膠緩沖液(50mM Tris-HCl，pH6.8，100mM DTT，2％ SDS，0.1％溴酚藍，10％甘油)中，100℃保溫5分鐘以破碎細胞壁。10000g離心30分鐘，每一個上清液置于15％SDS-PAGE中并于120V電泳2小時。凝膠在染色液(0.25％考馬斯亮蘭，45％甲醇和10％冰醋酸)中染色20分鐘，然后在脫色液(30％甲醇和10％醋酸)中脫色2小時。盡管如無IPTG誘導，HIV核殼蛋白(分子量7KD)帶不顯示，但在7KD位置上的蛋白帶會隨IPTG誘導時間的延長變深。同樣，HIV Gag蛋白條帶(分子量55KD)在IPTG誘導后會出現(xiàn)在55KD左右的位置上。實施例3共轉(zhuǎn)化以及β-半乳糖苷酶表達的測定為了測定HIVψ核苷酸序列和核殼蛋白或Gag蛋白相互作用對β-半乳糖苷酶表達水平的影響，質(zhì)粒pJC1和每一種pNH1Psi質(zhì)?；蛸|(zhì)粒pTrcHisGag和每一種pNH1Psi質(zhì)粒通過電穿孔分別共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109。為了排除質(zhì)?？截悢?shù)影響的可能性和確認lac阻遏物的表達，作為對照質(zhì)粒的pSE380(美國Invitrogen)與每一種pNH1Psi質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化JM109。每一個共轉(zhuǎn)化子在含100μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml卡那霉素的LB瓊脂糖平板上挑出。
為了測定共轉(zhuǎn)化子中β-半乳糖苷酶表達，對每一個轉(zhuǎn)化子進行3次以上的β-半乳糖苷酶液體分析。每一個共轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液按10％接種量(1∶10稀釋)接種到5ml新鮮LB培養(yǎng)基中。當進入對數(shù)生長期初期時，取出1ml培養(yǎng)液置于冰上，加入1mMIPTG誘導β-半乳糖苷酶，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，讓核殼蛋白、Gag蛋白和β-半乳糖苷酶表達，每小時取樣1ml培養(yǎng)液放置于冰上。細胞密度用酶聯(lián)免疫吸附分析讀數(shù)機(美國ELISA reader，Dynatech)在600nm處測定。對于測定β-半乳糖苷酶活性，每一個共轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液取50μl與450μl Z緩沖液(60mM Na2HPO4·7H2O，40mM NaH2PO4·H2O，10mM KCl，1mM MgSO4·7H2O，50mM β-巰基乙醇)混合。然后加入20μl氯仿和10μl 0.1％SDS，震蕩30秒，28℃溫育5分鐘，以破碎細胞壁。加入100μl鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)(4mg/ml美國Sigma)至細胞裂解液中，混合物室溫放置直至生成黃色。當黃色充分生成后，加入200μl 1M Na2CO3終止反應，混合物10000g離心30分鐘澄清，上清液在420nm和550nm處測定光密度(OD)值。β-半乳糖苷酶的活性定量用下列公式計算β-半乳糖苷酶的活性單位＝1000×(OD420-1.75×OD550)/(t×OD600)其中，t表示反應時間(分鐘)；1.75是一個常數(shù)。
為了確定核殼蛋白或Gag蛋白是否影響無ψ序列的質(zhì)粒中β-半乳糖苷酶的表達，大腸桿菌JM109分別被前體質(zhì)粒一含LacZ基因、無ψ序列的質(zhì)粒pNH1和表達核殼的質(zhì)粒pJC1；質(zhì)粒pNH1和表達Gag蛋白的質(zhì)粒pTrcHisGag；或質(zhì)粒pNH1和對照質(zhì)粒pSE380共轉(zhuǎn)化，β-半乳糖苷酶的活性測定方法同上。圖2中的曲線顯示了被質(zhì)粒pNH1分別與表達核殼蛋白的質(zhì)粒pJC1、表達Gag蛋白的質(zhì)粒pTrcHisGag、或?qū)φ召|(zhì)粒pSE380共轉(zhuǎn)化后JM109中的β-半乳糖苷酶表達水平。如圖2所示，用IPTG經(jīng)3小時誘導β-半乳糖苷酶后，表達核殼蛋白或Gag蛋白的共轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶表達水平與不表達這些其他蛋白(pSE380)的共轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶的表達水平?jīng)]有區(qū)別，因此表明在共轉(zhuǎn)化子中核殼蛋白或Gag蛋白對共轉(zhuǎn)化子中β-半乳糖苷酶的表達無影響。
為了證實HIV核殼蛋白和HIVψ序列或Gag蛋白和HIVψ序列間相互作用的特異性，對不同共轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶表達水平進行了測定。這些共轉(zhuǎn)化子分別含有質(zhì)粒pSE380、pJC1或pTrcHisGag中的一種以及質(zhì)粒pNH1MCS(多克隆位點MCS為一個與HIVψ的非同源序列)或pNH1Psi(SL1234，HIVψ核苷酸序列)中的一種。圖3a顯示HIV核殼蛋白或Gag蛋白與ψ非同源性序列間的相互作用對共轉(zhuǎn)化的JM109經(jīng)IPTG誘導后β-半乳糖苷酶表達的影響。所述JM109由質(zhì)粒pNH1MCS分別和pJC1、pTrcHisGag或pSE380共轉(zhuǎn)化。圖3b顯示HIV核殼蛋白或Gag蛋白與ψ同源性序列間的特異性相互作用對共轉(zhuǎn)化的JM109經(jīng)IPTG誘導后β-半乳糖苷酶表達的影響。所述JM109由質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)分別和pJC1、pTrcHisGag或pSE380共轉(zhuǎn)化。如圖3a所示，含有ψ非同源性序列和表達核殼蛋白或Gag蛋白的質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶的表達水平與含有質(zhì)粒pNH1MCS和對照質(zhì)粒pSE380的共轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶的表達水平?jīng)]有不同。同時如圖3b所示，當與質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)同時轉(zhuǎn)化時，表達Gag蛋白的共轉(zhuǎn)化子中的β-半乳糖苷酶水平與含對照載體pSE380共轉(zhuǎn)化子中的β-半乳糖苷酶水平比較下降15％，此外表達核殼蛋白的共轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶水平較對照共轉(zhuǎn)化子減少90％以上。
因此，可以證實由于存在HIVψ核苷酸序列，共轉(zhuǎn)化子中的β-半乳糖苷酶表達水平被HIV核殼蛋白降低了，而且這種下降是由HIV核殼蛋白和HIVψ核苷酸序列間的特異性相互作用引起的。
為了鑒別ψ核苷酸序列的哪一部分是負責和核殼蛋白的特異性相互作用的，用含有ψ核苷酸序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)各個部分的每一種質(zhì)粒與表達核殼蛋白或Gag蛋白的載體分別共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，然后測定每一個共轉(zhuǎn)化子的β-半乳糖苷酶活性。圖4表示HIV核殼蛋白或Gag蛋白與ψ序列部分間的特異性相互作用對大腸桿菌JM109共轉(zhuǎn)化子中的β-半乳糖苷酶表達的影響。大腸桿菌JM109由pJC1、pTrcHisGag或pSE380分別和每一種含有ψ核苷酸序列的各種不同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)部分質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)、pNH1Psi(SL234)、pNH1Psi(SL34)、pNH1Psi(SL23)或pNH1Psi(SL12)共轉(zhuǎn)化。在圖4中，水平軸代表pJC1、pTrcHisGag或pSE380和含ψ結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的共轉(zhuǎn)化子(欄1對照質(zhì)粒pNH1；欄2含非同源性序列的質(zhì)粒pNH1MCS；欄3pNH1Psi(SL1234)；欄4pNH1Psi(SL234)；欄5pNH1Psi(SL34)；欄6pNH1Psi(SL23)；欄7pNH1Psi(SL12))，縱軸代表β-半乳糖苷酶的活性。結(jié)果由斯氏試驗進行了統(tǒng)計學上的分析，“*”代表P＜0.05。如圖4所示，當細胞中存在ψ序列時HIV核殼蛋白能比HIV Gag蛋白更有效地降低LacZ基因的表達。當含有全長ψ核苷酸序列的質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)和pJC1共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109時，LacZ基因表達降低最明顯，其它序列的降低程度按SL34、SL234、SL23、SL12順序依次遞減。對于ψ序列和核殼蛋白間的特異性相互作用導致LacZ基因的表達的減少，SL4序列似乎比其他莖環(huán)結(jié)構(gòu)更重要。
因此，這些結(jié)果表明ψ序列中的全部4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)對β-半乳糖苷酶表達的顯著降低都是必須的，其中SL4序列對ψ序列和核殼蛋白的結(jié)合又是最重要的部分。為避免從SL4區(qū)域起始翻譯而制備的點突變質(zhì)粒pNH1Psi(SL234)和pNH1Psi(SL34)中LacZ基因表達減少的程度和沒有點突變的質(zhì)粒pNH1Psi(SL1234)的相似。因此轉(zhuǎn)化子命名為E.coli/pNH1Psi(SL1234)，顯示通過ψ序列和核殼蛋白的特異性相互作用，β-半乳糖苷酶表達的下降最大。E.coli/pNH1Psi(SL1234)存放在國際保藏單位韓國微生物保藏中心(KCCM，#361-221 Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，Seoul，Republic of Korea)，保藏登記號KCCM-10194，保藏日為2000年3月31日。上述實施例結(jié)果總結(jié)在下表1中。
表1依賴報道載體種類的β-半乳糖苷酶表達水平
結(jié)果由于ψ核苷酸序列和HIV核殼蛋白間的特異性相互作用，轉(zhuǎn)化子具有了降低β-半乳糖苷酶報道基因表達的特征。因此，通過推定的HIV抑制劑的化合物或組合物處理大腸桿菌JM109(KCCM-10194)培養(yǎng)液以及測定β-半乳糖苷酶表達變化的程度，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子能用來篩選HIV包裝抑制劑，這些抑制劑能阻斷HIV核殼蛋白結(jié)合到HIVψ序列上。
如上清晰地闡述和證實了，本發(fā)明提供了一種微生物，該微生物是被表達HIV核殼蛋白的基因和含有HIVψ基因和β-半乳糖苷酶報道基因的質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化的；本發(fā)明還提供了一種使用所述轉(zhuǎn)化子來篩選HIV抑制劑的方法。本發(fā)明的方法包括了所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)、采用推定的HIV抑制劑化合物或組合物處理轉(zhuǎn)化子以及培養(yǎng)基中β-半乳糖苷酶表達變化程度的測定等步驟，能實際應用于篩選HIV包裝抑制劑，這些抑制劑能阻斷HIV核殼與HIVψ基因序列間的相互作用。
序列表<110>柳志昌(YOU，Ji-Chang)<120>一種用于篩選人類免疫缺陷性病毒抑制劑的轉(zhuǎn)化子(A Transformant for Screening of Inhibitors for Human Immunodeficiency Virus)<130>P0019-JCY<160>8<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>3279<212>DNA<213>人工序列<220><223>β-半乳糖苷酶基因<400>1atgggacgtc gacctgaggt aattataacc cgggccctat atatggatcc aattgcaatg 60atcatcatga cagatctgcg cgcgatcgat atcagcgctt taaatttgcg catgctagct 120atagttctag aggtaccggt tgttaacgtt agccggctac gtatactccg gaatattaat 180aggcctagga tgcatatggc ggccgcctgc aggtcgactc tagaggatcc cgtcgtttta 240caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 300cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 360cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa 420agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag 480atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc aacgtaacct atcccattac ggtcaatccg 540ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa 600agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat 660ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt 720gacctgagcg catttttacg cgccggagaa aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgttgg 780agtgacggca gttatctgga agatcaggat atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac 840gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt 900aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt 960gactacctac gggtaacagt ttctttatgg cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc 1020gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta 1080cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg 1140gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt 1200ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt 1260cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg 1320atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat 1380tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat 1440gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc 1500tggctaccgg cgatgagcga acgcgtaacg cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg 1560agtgtgatca tctggtcgct ggggaatgaa tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg 1620tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc 1680gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc 1740ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc 1800ccgctgatcc tttgcgaata cgcccacgcg atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa 1860tactggcagg cgtttcgtca gtatccccgt ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg 1920gatcagtcgc tgattaaata tgatgaaaac ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat 1980tttggcgata cgccgaacga tcgccagttc tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc 2040acgccgcatc cagcgctgac ggaagcaaaa caccagcagc agtttttcca gttccgttta 2100tccgggcaaa ccatcgaagt gaccagcgaa tacctgttcc gtcatagcga taacgagctc 2160ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat 2220gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc 2280gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc 2340gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt ctggcggaaa acctcagtgt gacgctcccc 2400gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc accagcgaaa tggatttttg catcgagctg 2460ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag tcaggctttc tttcacagat gtggattggc 2520gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc gatcagttca cccgtgcacc gctggataac 2580gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag 2640gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct 2700gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc 2760agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa 2820gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg attggcctga actgccagct ggcgcaggta 2880gcagagcggg taaactggct cggattaggg ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact 2940gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc 3000ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg cgcgaattga attatggccc acaccagtgg 3060cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc 3120catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc acatggctga atatcgacgg tttccatatg 3180gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc 3240ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt caaaaataa3279<210>2<211>131<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>2ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacagca agaggcgagg ggcggcgact 60ggtgagtacg ccaatttttg actagcggag gctagaagga gagagagatg ggtgcgagag120cgtcggtatt a 131<210>3<211>84<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>3ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacagca agaggcgagg ggcggcgact60ggtgagtacg ccaatttttg acta 84<210>4<211>67<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>4agcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaatt tttgactagc ggaggctaga60aggagag 67<210>5<211>88<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>5agcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaatt tttgactagc ggaggctaga60aggagagaga gacgggtgcg agagcgtc 88<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增1型HIV病毒的SL23和SL234序列的引物<400>6gggggtgacc tttaaaagca agaggcgagg g 31<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增1型HIV病毒的SL23序列的引物<400>7gggggtgacc ctctccttct agcctccg 28<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于擴增1型HIV病毒的SL234序列的引物<400>8gggggtgacc gacgctctcg cacccgtctc t 3權利要求
1.大腸桿菌JM109(KCCM-10194)，其是被一種表達HIV核殼蛋白的載體pJC1和另一種含有HIVψ基因、SL1234(SEQ ID NO2)以及β-半乳糖苷酶報道基因(SEQ ID NO1)的載體pNH1Psi(SL1234)共轉(zhuǎn)化的。
2.一種篩選HIV包裝抑制劑的方法，包括如下步驟(1)權利要求1所述的大腸桿菌JM109(KCCM-10194)的培養(yǎng)；(2)用推定的HIV抑制劑化合物或組合物處理所述大腸桿菌；以及(3)測定培養(yǎng)液中β-半乳糖苷酶表達的變化程度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物,該微生物被一個表達HIV核殼蛋白的基因和一個含有HIVψ基因和β－半乳糖苷酶報道基因的質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化;本發(fā)明還涉及一種使用所述轉(zhuǎn)化子來篩選HIV抑制劑的方法。本發(fā)明的方法包括培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化子、采用推定的HIV抑制劑化合物或組合物處理轉(zhuǎn)化子以及測定培養(yǎng)液中β－半乳糖苷酶表達變化程度等步驟,該方法能實際應用于篩選HIV包裝抑制劑,這些抑制劑會阻斷HIV核殼與HIVψ基因序列間的相互作用。
文檔編號C12N1/19GK1354790SQ00808632
公開日2002年6月19日 申請日期2000年10月18日 優(yōu)先權日2000年4月8日
發(fā)明者南赫俊, 金相憲 申請人:柳志昌