專利名稱：一種測定人類免疫缺陷病毒(1＋2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性hiv抗體的方法及抗原條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本產(chǎn)品涉及體外免疫診斷領(lǐng)域，特別涉及一種測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的方法，并根據(jù)其測定結(jié)果判斷被測者是否感染HIV以及感染哪個亞型的HIV。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)，又名獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmuno-deficiency syndrome)，是由人類免疫缺陷病毒(Human ImmuneDeficiency Virus，HIV)引起的一種嚴重傳染病。通過性接觸和體液傳播，能破壞人的免疫系統(tǒng)，特別是細胞免疫系統(tǒng)，以機會性感染和惡性腫瘤為特征的慢性傳染病。艾滋病是一種目前尚無有效治愈辦法、病死率極高的傳染病，它在全世界的廣泛流行已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題和社會問題。
目前美國杜邦公司、伯樂公司，法國生物梅里埃(原“阿克蘇”)等公司先后推出了艾滋病確證試劑。這些進口試劑價格昂貴，而國內(nèi)絕大多數(shù)感染者集中在農(nóng)村或不發(fā)達地區(qū)，無法承擔昂貴的檢測費用。這種狀況極大地限制了確認試劑在我國艾滋病檢測工作的應(yīng)用。國內(nèi)只有極少數(shù)研究機構(gòu)進行了艾滋病免疫印跡確診試劑的研制工作，僅有的一種國產(chǎn)確認試劑由于采用全病毒作為抗原，其特異性受到限制，同時復(fù)雜的工藝也使得試劑的成本很高，價格與進口產(chǎn)品相差不大，無法在國內(nèi)推廣使用。確認試劑的國產(chǎn)化，尤其是是研制工藝簡單、價格低廉的確認試劑已經(jīng)迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種成本低、效果好的測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的方法及抗原條，根據(jù)其測定結(jié)果可確證被測者是否感染HIV以及感染哪個亞型的HIV。
為達上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的方法，包括以下步驟(1)用特異性HIV基因重組抗原包被于抗原條上的硝酸纖維素膜上制備HIV抗體特異性WB抗原條帶；(2)用膠體金標記羊抗-人IgG作為信號示蹤系統(tǒng)；(3)利用待測樣本中的HIV特異性抗體先與膠體金標記羊抗-人IgG反應(yīng)，然后與其對應(yīng)的特異性抗原反應(yīng)，形成特異性HIV抗原-特異性HIV抗體-膠體金標記羊抗人IgG抗體夾心復(fù)合物，通過膠體金顆粒特有的顏色示蹤而判斷特異性抗體的有無。
所述的特異性HIV基因重組抗原包括HIV-1 Env帶的gp41、gp120和gp160基因重組抗原片段，Gag帶的p55和p24基因重組抗原片段，Pol帶的p51和p31基因重組抗原片段，和HIV-2的gp36基因重組抗原片段。
測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的抗原條，包括PVC材質(zhì)的底板，底板上面中間部位設(shè)有包被HIV特異抗原的硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜下部上面疊合包被羊抗-人IgG膠體金標記抗體的聚酯膜材質(zhì)的膠體金墊，膠體金墊上面疊合有玻璃纖維材質(zhì)的樣品墊，硝酸纖維素膜上部上面貼合吸引樣品的棉漿板。
所述的特異性HIV基因重組抗原包括HIV-1 Env帶的gp41、gp120和gp160基因重組抗原片段，Gag帶的p55和p24基因重組抗原片段，Pol帶的p51和p31基因重組抗原片段，和HIV-2的gp36基因重組抗原片段。
所述的膠體金由橘櫞酸鈉還原氯金酸制備，膠體金顆粒大小為20-60nm；膠體金標記羊抗-人IgG用碳酸鉀調(diào)PH值6.0-9.0，單抗標記濃度為3-20μg/ml；抗原包被濃度為1.0mg/ml。
本發(fā)明使用基因重組抗原，避免了病毒全裂解抗原的隨意性和不可控性，極大的減少了非特異性反應(yīng)，可以選擇優(yōu)勢抗原的優(yōu)勢表位表達，提高檢測的靈敏度和敏感性，同時大大提高了試劑的穩(wěn)定性；使用金標記技術(shù)顯色，避免了因為酶標記引入底物和顯色劑等相對性質(zhì)不穩(wěn)定試劑所引入的非特異性反應(yīng)以及試劑變性所引發(fā)的漏檢的危險，操作更加簡單。成本低，不需要任何檢測設(shè)備。


圖1為本發(fā)明抗原條模式圖，其中a為HIV-1型陽性，b為HIV-2型陽性，c為陰性；圖2為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的抗原條，包括PVC材質(zhì)的底板1，底板1上面中間部位設(shè)有包被HIV特異抗原的硝酸纖維素膜2，硝酸纖維素膜2下部上面疊合包被羊抗-人IgG膠體金標記抗體的聚酯膜材質(zhì)的膠體金墊3，膠體金墊3上面疊合有玻璃纖維材質(zhì)的樣品墊4，硝酸纖維素膜2上部上面貼合吸引樣品的棉漿板5。
所述的特異性HIV基因重組抗原包括HIV-1 Env帶的gp41、gp120和gp160基因重組抗原片段，Gag帶的p55和p24基因重組抗原片段，Pol帶的p51和p31基因重組抗原片段，和HIV-2的gp36基因重組抗原片段。
所述的膠體金由橘櫞酸鈉還原氯金酸制備，膠體金顆粒大小在不同實施例中分別取20、40、60nm；膠體金標記羊抗-人IgG用碳酸鉀調(diào)PH值，在不同實施例中分別取6.0、7.5、9.0，單抗標記濃度在不同實施例中分別取3、12、20μg/ml；抗原包被濃度為1.0mg/ml。
抗原條制備主要步驟包括(1)、膠體金的制備用潔凈燒杯取100ml三蒸水，加入1％的氯金酸，攪拌煮沸，加入1ml 1％檸檬酸鈉繼續(xù)攪拌煮沸5-10min，冷卻。
(2)、金標記羊抗-人IgG的制備將冷卻之后的膠體金用0.2M碳酸鉀和0.1M的鹽酸調(diào)整PH至8.0左右，攪拌十分鐘，加入1％BSA繼續(xù)攪拌20-30分鐘，離心棄上清備用。
(3)、金標記羊抗-人IgG工作液的制備0.01M PH7.6的磷酸鹽緩沖液中加入1％BSA，5％蔗糖，0.01％PEG6000，充分混勻制成標記物稀釋液。將已經(jīng)離心的金標記羊抗-人IgG以合適的比例加入到上述稀釋液中，即制成金標記羊抗-人IgG工作液。
(4)、抗原條測試線的制備配制0.05M的碳酸鹽緩沖液(PH9.5)，分別加入1.0mg/ml的特異性抗原，以1.0ml/cm自動噴膜機點噴于硝酸纖維膜上，凍干。包被的特異性抗原包括以下片段a)Env帶的gp41、gp120、gp160基因重組抗原片段；b)Gag帶的p55、p24基因重組抗原片段；c)Pol帶的p51、p31基因重組抗原片段；d)HIV-2的p36基因重組抗原片段；(5)、抗原條質(zhì)控線的包被配制0.01M的磷酸鹽緩沖液(PH8.0)，加入0.5mg/ml的IgG抗體，以1.0ml/cm自動噴膜機點噴于硝酸纖維膜上，凍干。
(6)、抗原條上的測試線及質(zhì)控線的排列順序從抗原條編號端至另一端依次為HIV2 gp36、質(zhì)控線、gp17、gp24、gp34、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160。
利用該抗原條與輔料配合可組成人類免疫缺陷病毒(HIV)1+2型抗體免疫印跡試劑盒試劑盒組成HIV 1/2抗原條 20條(塑料瓶裝)印跡緩沖液(10×)12ml(塑料瓶裝)清洗緩沖液(10×)60ml(塑料瓶裝)印跡粉 1g×8(袋裝)結(jié)合物 70ul(離心管裝)HIV陰性對照品 70ul(離心管裝)HIV-1弱陽性對照品 70ul(離心管裝)HIV-1強陽性對照品 70ul(離心管裝)HIV-2陽性對照品反應(yīng)槽 1塊使用說明書 1份
原理以硝酸纖維素膜為載體的抗原條，組合了HIV-1全病毒抗原和HIV-2 gp36重組蛋白抗原。當抗原條與被檢血清及對照品接觸時，如血清標本有HIV-1/HIV-2特異性抗體，將會與抗原條上的HIV-1/HIV-2 gp36抗原結(jié)合。結(jié)合的抗體再與結(jié)合物(羊抗人IgG標記膠體金)結(jié)合，清洗后觀察并判斷結(jié)果。
適應(yīng)范圍用于初篩試劑判斷為HIV陽性(如ELISA法)基礎(chǔ)上的血清或血漿樣本，進行確證是否為HIV-1陽性及診斷是否感染了HIV-2。
使用方法1實驗室必備器材1.1搖床速度為60-90轉(zhuǎn)/分種1.2移液管1.3貯水瓶1.4鑷子或鉗子2溶液的配制(請按需要量現(xiàn)用現(xiàn)配)2.1清洗緩沖液配制取適量清洗緩沖液(10倍)，用蒸餾水按1∶10稀釋，混勻待用。實驗所需數(shù)量參考下表配制。
2.2印跡緩沖液配制A、取適量印跡緩沖液(10倍)，用蒸餾水按1∶10稀釋；B、1g印跡粉加入20ml印跡緩沖液中充分溶解待用。實驗所需數(shù)量參考下表配制。
2.3結(jié)合物稀釋液現(xiàn)用現(xiàn)配，按2ul結(jié)合物2ml印跡緩沖液的比例配制，并混勻待用。
不同抗原條數(shù)量所需的各種試劑量

3操作程序3.1取出反應(yīng)槽，每一槽內(nèi)加2ml清洗緩沖液。
3.2用鑷子小心地夾住抗原條編號的一端放入已有清洗緩沖液的反應(yīng)槽中，有編號的一面朝上，每槽一條，讓溶液覆蓋住抗原條。
3.3將反應(yīng)草放在搖床上，旋搖5-10分鐘，然后吸棄清洗緩沖液。
3.4每槽加入印跡緩沖液2ml。
3.5用微量移液器在每一槽中分別加入20ul待檢血清或血漿(注意凡溶血、脂血或混濁樣品均不能獲得可靠結(jié)果)，并用本試劑盒中的對照品作平行對照。每一槽加一個樣品，每加一個樣品，換一個吸頭，以免造成交叉污染。
3.6在室溫下將反應(yīng)槽在搖床上旋搖60分鐘，注意控制旋搖速度，以免溶液從槽內(nèi)濺入臨近槽中，造成實驗結(jié)果誤差。
3.7旋搖完畢后，吸棄印跡緩沖液。(注廢棄夜應(yīng)放如預(yù)先加入1％次鹵酸鈉的貯水瓶中。)3.8每槽加入2ml清洗緩沖液，旋搖5分鐘后，吸棄清洗緩沖液，共清洗3次，每次5分鐘。
3.9在每槽加入2ml結(jié)合物稀釋液，旋搖45分鐘。(注意時間太長抗原條本底變深，會使結(jié)果判斷困難；如果強陽性血清色帶增深時可先行終止反應(yīng)；若弱陽性血清色帶較淺可以適當延長反應(yīng)時間，但不得超過30分鐘。)3.10從槽中吸棄結(jié)合物稀釋液，每槽用2ml清洗緩沖液清洗三次，每次5分鐘，吸盡余液。
3.11將抗原條放于二張濾紙間吸干水分后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷1、對照品檢測結(jié)果判定要求1.1 HIV-1強陽性對照品必須出現(xiàn)gp 160/gp120和gp 41、p24帶型，以及p66、p55/51、p34、p17帶型判定為陽性。HIV-2 gp36為陰性(見模式圖)。
1.2 HIV-1弱陽性對照品，在gp 160、gp1 20和gp 41、p24帶型中至少出現(xiàn)二條，判定為陽性。其他位置也可能出現(xiàn)弱帶，但對分析并非必需。HIV-2gp36為陰性。
1.3 HIV-2陽性對照品必需出現(xiàn)gp36重組蛋白帶型，判定為陽性。
1.4 HIV-1陰性對照品應(yīng)無上述的特異型帶型出現(xiàn)，判定為陰性。
2被檢血清/血漿的判定標準2.1有下列情況之一者判定為HIV抗體陽性。
a)至少一條env帶和一條pol帶；b)至少一條env帶和一條gag帶；c)至少二條env帶；(注env帶有g(shù)p 160、gp120、gp 41；gag帶有p55、p24、p17；pol帶有p66、p51、p34。)2.2有HIV-2 gp36重組蛋白帶型出現(xiàn)者判定為HIV-2抗體陽性，需用HIV-2確認試劑進一步檢測。
2.3無HIV特異性抗體帶型出現(xiàn)者判定為HIV陰性。
2.4出現(xiàn)HIV特異性抗體帶型，但帶型不足以確認陽性者，判定為HIV抗體可疑。
注意事項1.只有按此手冊的操作程序操作才能獲得可信的結(jié)果，任何不按此程序操作均可能造成錯誤的結(jié)論。不論待測樣品多少，HIV-1強陽性、HIV-1弱陽性和HIV陰性對照均必須同時進行。
2.所有操作均應(yīng)在室溫下進行。試劑盒在檢測前從冰箱中取出，放于室溫下，平衡30分鐘后，方可使用。
3.任何變質(zhì)的抗原條，如變色或出現(xiàn)霉斑，不得使用。清洗緩沖液和印跡液呈現(xiàn)云狀物或白色顆粒，仍可使用，不能過濾。任何變質(zhì)的抗原或試劑都可能產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。
4.整個操作過程均應(yīng)戴手套，穿工作服，操作結(jié)束后及時洗手，配制溶液時嚴禁用嘴吸吸管。
5.所有待測樣品，硝酸纖維膜抗原條和對照品均應(yīng)做可傳染的病原體處理。
6.實驗中有液體濺出時，及時用1％次氯酸鈉處理，污染了的材料均應(yīng)消毒處理。
7.試驗中所用到的樣品和材料均應(yīng)作為可傳染物處理。可用121℃高壓滅菌1小時，也可焚燒處理，液體廢物可用1％次氯酸鈉處理。
8.使用時，本試劑盒中提供的對照品和試劑不可與另一套試劑盒混用，也不要交換瓶蓋，否則會造成交叉污染。
9.如果一次測試樣品不足20條，剩余抗原條仍放回原抗原條管中，密封好后于2-8℃保存。
10.如果抗原條和血清樣品作用時間過長，陰性樣品也可能出現(xiàn)弱帶。
11.HIV-1陽血清，據(jù)資料介紹，有少數(shù)病例可與HIV-2 gp36成交叉反應(yīng)。
12本試劑盒開啟后，盡可能在1個月內(nèi)使用完畢。使用上述抗原條檢測HIV抗體國家參考品(20050101)，檢測結(jié)果如下

權(quán)利要求
1.一種測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用特異性HIV基因重組抗原包被于抗原條上的硝酸纖維素膜上制備HIV抗體特異性WB抗原條帶；(2)用膠體金標記羊抗-人IgG作為信號示蹤系統(tǒng)；(3)利用待測樣本中的HIV特異性抗體先與膠體金標記羊抗-人IgG反應(yīng)，然后與其對應(yīng)的特異性抗原反應(yīng)，形成特異性HIV抗原-特異性HIV抗體-膠體金標記羊抗人IgG抗體夾心復(fù)合物，通過膠體金顆粒特有的顏色示蹤而判斷特異性抗體的有無。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的方法，其特征在于，所述的特異性HIV基因重組抗原包括Env帶的gp41、gp120和gp160基因重組抗原片段，Gag帶的p55和p24基因重組抗原片段，Pol帶的p51和p31基因重組抗原片段，和HIV-2的gp36基因重組抗原片段。
3.測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的抗原條，其特征在于，包括PVC材質(zhì)的底板，底板上面中間部位設(shè)有包被HIV特異抗原的硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜下部上面疊合包被羊抗-人IgG膠體金標記抗體的聚酯膜材質(zhì)的膠體金墊，膠體金墊上面疊合有玻璃纖維材質(zhì)的樣品墊，硝酸纖維素膜上部上面貼合吸引樣品的棉漿板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的抗原條，其特征在于，所述的特異性HIV基因重組抗原包括Env帶的gp41、gp120和gp160基因重組抗原片段，Gag帶的p55和p24基因重組抗原片段，Pol帶的p51和p31基因重組抗原片段，和HIV-2的gp36基因重組抗原片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的抗原條，其特征在于，所述的膠體金由橘櫞酸鈉還原氯金酸制備，膠體金顆粒大小為20-60nm；膠體金標記羊抗-人IgG用碳酸鉀調(diào)PH值6.0-9.0，單抗標記濃度為3-20μg/ml；抗原包被濃度為1.0mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定人類免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位產(chǎn)生的特異性HIV抗體的方法，并根據(jù)其測定結(jié)果確證被測者是否感染HIV以及感染哪個亞型的HIV。用特異性HIV基因重組抗原包被于硝酸纖維素膜上制備HIV抗體特異性抗原條帶；用膠體金標記羊抗－人IgG作為信號示蹤系統(tǒng)；待測樣本中的HIV特異性抗體可與膠體金標記羊抗－人IgG反應(yīng)，然后與其對應(yīng)的特異性抗原反應(yīng)，形成特異性HIV抗原－特異性HIV抗體－膠體金標記羊抗人IgG抗體夾心復(fù)合物，并通過膠體金顆粒特有的顏色示蹤而判斷特異性抗體的有無。本發(fā)明特異性高，信號示蹤系統(tǒng)性能穩(wěn)定，結(jié)果判斷直觀，且避免了由于引入底物系統(tǒng)而出現(xiàn)的非特異性以及漏檢的可能。
文檔編號G01N33/549GK101082625SQ20071005476
公開日2007年12月5日 申請日期2007年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者付光宇, 李桂林, 劉功成, 李彬, 項立紅, 陸瑩, 馬建軍, 吳學(xué)煒 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司